Summary
이 방법 논문의 목표는 외과적으로 절제된 흉막 중피종으로부터 원발성 종양 세포주의 농축, 생성 및 확장을 위한 강력하고 재현 가능한 방법론을 입증하는 것이다.
Abstract
희귀 종양 유형으로부터 원발성 종양 세포주의 확장을 위한 현재의 방법론은 결여되어 있다. 이 프로토콜은 소화에서 농축, 확장, 냉동 보존 및 표현형 특성화에 이르는 과정에 대한 완전한 개요를 제공함으로써 외과적으로 절제된 악성 흉막 중피종(MPM)으로부터 원발성 종양 세포를 확장하는 방법을 설명합니다. 또한, 이 프로토콜은 차등 트립신화와 같은 다수의 종양 유형에 유용할 수 있는 종양 생성에 대한 개념을 소개하고, 표현형 특성화를 위한 세포 표면 마커의 검출에 대한 해리 방법의 영향을 소개한다. 이 연구의 주요 한계는 2차원(2D) 배양 시스템에서 확장될 종양 세포의 선택이다. 3차원(3D) 배양 시스템, 배지 보충제, 부착을 개선하기 위한 플레이트 코팅, 및 대체 분해 방법을 포함하는 이 프로토콜의 변형은 이 기술과 종양 라인 구축의 전반적인 성공률을 향상시킬 수 있다. 전반적으로, 이 프로토콜은 이 희귀 종양으로부터 종양 세포를 확립하고 특성화하기 위한 기본 방법을 제공한다.
Introduction
악성 흉막 중피종 (MPM)은 석면 노출과 매우 관련이있는 드문 종양입니다. 면역 요법 기반 접근법이 고무적인 결과를 보여 주었지만,이 질병을 앓고있는 환자에게 사용할 수있는 치료 옵션이 부족하며 전체 5 년 생존율은 1,2로 낮습니다. 이 질병을 더 잘 이해하고 환자 결과를 향상시킬 수있는 새로운 치료 목표를 식별하기위한 여러 기관에서 노력이 진행되고 있습니다. 다수의 중피종 마우스 모델이 존재하지만, 원발성 중피종 종양 세포에 대한 접근은 더욱 제한적이다3. 원발성 중피종 종양 세포의 시험관내 확장은 종양 세포를 직접 연구하는데 활용될 수 있는 유용한 모델 시스템을 제공할 것이며, 종양 침윤 림프구와 같은 자가 면역 세포와의 상호작용을 제공할 것이다. 원발성 중피종 종양 세포주의 확장에 대한 보고가 있었지만, 이들은 거의 없으며 상세한 표준 수술 절차(SOP)를 제공하지 않는다. 또한, ATCC(American Type Culture Collection)와 같은 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있는 세포주는 거의 없다. 원발성 종양 라인의 이용가능성은 제한되어 있지만, 종양 세포가 흉막 삼출액으로부터 그리고 종양 조직으로부터 직접 확장될 수 있다는 것이 입증되었다(4,5). 또한, 확장된 종양 세포주는 원래의 종양 4,5,6의 분자 프로파일을 보존하는 것으로 나타났다.
우리 실험실은 MPM의 종양 면역 미세 환경을 연구하고 있으며 외과 적으로 절제된 사례에서 원발성 MPM 종양 세포주를 확장하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 원발성 전이성 흑색종 종양 세포주를 확립하는 우리의 경험으로부터 적응된다. 이 연구의 목표는 2D 모델 시스템 및 후속 표현형 프로파일링을 사용하여 원발성 중피종 종양 라인 확장에 대한 상세하고 실용적인 접근법을 제공하는 것입니다. 첫 번째 라인 설정2에서 CTLA4 및 PD-1을 표적으로 하는 체크포인트 봉쇄 전략의 최근 성공을 감안할 때, 많은 원발성 종양 라인을 생성하는 능력은 종양 내성의 내재적 메커니즘에 대한 이해를 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 T 세포 인식을 평가하는 중요한 모델 시스템을 제공할 수 있으며, 따라서 MPM에서의 면역 반응에 대한 우리의 이해를 심화시킬 수 있다.
이 프로토콜의 주요 한계는 모든 종양이 다른 미세 환경을 포함하고 확장 성공의 높은 수준의 가변성이 있다는 것입니다. 또한, 이 방법은 2D 배양 시스템에서 확장할 수 있는 종양 세포를 선택한다. 3D 스페로이드 또는 오가노이드 배양의 생산을 수반하는 다른 방법은 더 높은 확장 성공률을 허용하거나 전통적인 2D 시스템에서 확장할 수 없는 세포주를 유도하는 능력을 초래할 수 있는 대안적인 접근법을 제공할 수 있다. 이러한 3D 배양은 확장하기 어려운 종양 유형, 예를 들어 췌장암7의 생성에 유용한 것으로 입증되었다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 방법은 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터의 기관 검토위원회 (IRB)의 승인을 받았습니다. 이것은 표준 치료, 외과 적으로 절제된 MPM 종양이 정보에 입각 한 동의에 따라 제거되는 것과 관련이 있습니다.
1. 종양 소화 매질 및 다른 관련 매질의 제조
- 종양 소화 배지를 준비하려면 층류 후드에 멸균된 로스웰 파크 기념 연구소(RPMI) 1640 배지 500mL에 100% 펜/스트렙토마이신(페니실린/스트렙토마이신) 5mL를 첨가합니다.
- 배지를 진공 여과를 위해 500 mL, 0.22 μm 폴리에테르술폰(PES) 멸균 필터로 옮긴다.
참고: 여과 및 흡인 단계는 75-150 torr의 표준 진공 압력으로 수행되어야 합니다. - 종양 소화 배지를 라벨링하고 데이트하고, 이를 4°C에서 보관한다.
참고: 배지는 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 배지를 진공 여과를 위해 500 mL, 0.22 μm 폴리에테르술폰(PES) 멸균 필터로 옮긴다.
- 종양 소화 효소 칵테일을 준비하려면 3% 콜라게나제 유형 1 2.5mL, 히알루로니다제 1mL 1mL, 250,000units/mL DNAse 20μL를 층류 후드의 50mL 원뿔형 튜브에 1~16.5mL의 소화 배지에 첨가한다.
참고: 종양 소화 효소 칵테일의 총 부피는 20 mL이다; 그러나 종양 샘플 당 10 mL 만 필요합니다. 이와 같이, 나머지 칵테일은 필요할 때까지 -20°C에서 저장될 수 있다. 분취량을 다시 얼리지 마십시오. - 완전한 종양 배지를 준비하려면 층류 후드에서 500mL의 100% Pen/Strep과 50mL의 태아 소 혈청(FBS)을 500mL의 멸균 RPMI 1640에 첨가하십시오.
- 배지를 진공 여과를 위해 500 mL, 0.22 μm PES 멸균 필터로 옮긴다.
- 완전한 종양 배지를 라벨링하고 데이트하고, 이를 4°C에서 보관한다.
참고: 배지는 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 굶주림을 위한 환원 혈청 배지를 준비하려면 층류 후드에서 5mL의 100% Pen/Strep과 5mL의 FBS를 멸균 RPMI 1640 500mL에 첨가하십시오.
- 배지를 진공 여과를 위해 500 mL, 0.22 μm PES 멸균 필터로 옮긴다.
- 환원된 혈청 배지를 라벨링하고 데이트하고, 이를 4°C에서 보관한다.
참고: 배지는 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 동결 배지를 제조하기 위해, 층류 후드에 45 mL의 FBS에 5 mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 첨가한다.
- 배지를 진공 여과를 위해 50 mL, 0.22 μm PES 멸균 필터로 옮긴다.
- 라벨 및 날짜 5 15 mL 코니컬 튜브.
- 동결 배지 10 mL를 각 튜브에 옮기고 튜브를 -20°C에서 보관한다.
- 마이코플라즈마 테스트를 위한 항생제가 없는 배지를 준비하려면 층류 후드에 500mL의 멸균 RPMI 1640에 50mL의 FBS를 첨가하십시오.
- 배지를 진공 여과를 위해 50 mL, 0.22 μm PES 멸균 필터로 옮긴다.
- 항생제가 없는 배지를 라벨링하고 데이트하고 이를 4°C에서 보관한다.
참고: 배지는 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 표현형 분석을 위한 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액을 준비하기 위해, 층류 후드에서 멸균된 1x 인산완충식염수(PBS) 500mL에 멸균된 소 혈청 알부민 16.6mL를 첨가한다.
- FACS 완충액을 라벨링하고 데이트하고 이를 4°C에서 보관한다.
참고: FACS 버퍼는 두 구성 요소가 모두 멸균 상태로 유지되는 한 필터 멸균이 필요하지 않습니다. FACS 완충액은 4°C에서 6개월 동안 개봉하기 전에 저장될 수 있다.
- FACS 완충액을 라벨링하고 데이트하고 이를 4°C에서 보관한다.
2. 종양 조직의 소화
- 종양 소화 효소 칵테일 10 mL를 단계 1.2에서 해리 튜브로 옮긴다.
- 종양 조직 조각을 멸균 메스를 사용하여 멸균된 6-웰 플레이트 뚜껑으로 옮깁니다.
참고: 종양 조직과 함께 전달되는 배지의 양은 처리에 충분합니다.- 새로운 멸균 메스와 포셉을 사용하여 모든 지방 조직, 괴사 조직 및 / 또는 혈전을 제거하십시오.
참고: 지방 조직은 일반적으로 외관이 노랗고 반고체입니다. 괴사 조직은 외관상 주변 조직보다 어둡고 매우 부드럽습니다. 지방질과 괴사 성 조직 모두 쉽게 부서집니다. 피 묻은 조직은 밝은 빨간색으로 나타나며 조작 될 때 혈액을 매체로 방출 할 수 있습니다. 일단 제거되면, 생성 된 종양 조직은 조직 유형에 따라 모양을 유지하고 창백하거나 분홍색이어야합니다. - 전체 종양 조직을 1mm3 개의 작은 조각으로 자릅니다. 조직이 건조하지 않도록 하려면 500μL의 멸균 행크 밸런스드 소금 용액(HBSS)을 종양 조직에 첨가하십시오.
- 새로운 멸균 메스와 포셉을 사용하여 모든 지방 조직, 괴사 조직 및 / 또는 혈전을 제거하십시오.
- 종양 단편을 종양-소화된 효소 칵테일 10 mL를 함유하는 해리 튜브 내로 옮긴다(단계 2.1). 튜브를 단단히 닫고 뚜껑 측면을 조직 해리기에 내려 놓은 다음 해리 튜브 위에 슬리브처럼 적용하고 제자리에 클릭하여 눌러서 히터 장치를 추가하십시오.
참고: 각 튜브의 최대 용량은 종양 4g과 부피 10mL입니다. - 해리 37C_h_TDK_1에서 미리 프로그래밍된 설정을 선택합니다. 깜박이는 빨간색 표시등으로 표시된 대로 막힘 오류가 없는지 10분 후 상태를 확인합니다.
참고: 이 프로그램은 37°C에서 온도를 켠 상태에서 1시간 동안 1,865rpm으로 처리합니다.
주: 막힘이 발생하면 해리 튜브를 제거하고 수동으로 소용돌이 치며 뚜껑에 잡힌 조직을 제거하십시오. 그런 다음 튜브를 해리기에 교체하고 프로그램을 다시 시작하십시오. - 1 시간 소화 후, 해리 튜브를 제거하고 층류 후드에 놓습니다. 50 mL 원뿔형 튜브의 상부에 70 μm 세포 스트레이너를 배치하고 10 mL 피펫을 사용하여 소화된 종양을 필터 상에 피펫팅함으로써 소화된 종양을 여과한다. 필터가 막히면 새 필터로 전환합니다.
- 해리 튜브를 10 mL의 신선한 종양 소화 배지로 헹구고 필터를 통해 세척을 통과시킵니다.
- 70μm 필터를 분리하고 버립니다.
- 종양 소화 배지로 총 부피를 40 mL로 가져온다.
- 실온에서 5분 동안 500 × g 에서 원심분리한다.
- 진공 공급원에 부착된 2 mL 흡기 피펫을 사용하여, 펠릿을 교란시키지 않고 상청액을 흡인하고, 멸균된 완전한 종양 배지 10 mL를 사용하여 세포를 재현탁시켰다.
- 2.6단계를 반복합니다.
- 단계 2.7에 기재된 바와 같이 상청액을 흡인한다. 세포를 멸균된 완전한 종양 배지 3 mL에 재현탁시키고, 세포 현탁액을 멸균된 6-웰 플레이트의 한 웰로 옮긴다.
- 플레이트를 5%CO2와 함께 37°C의 인큐베이터에 보관한다.
- 24시간 후, 사용된 배지를 웰 1의 소화된 종양으로부터 동일한 6-웰 플레이트의 새로운 웰(웰 2)로 옮긴다. 멸균된 완전한 종양 배지 3 mL를 웰 1에 첨가한다.
- 사용된 배지를 웰 1 및 2로부터 옮기고, 단계 2.11 후 24시간 후에 동일한 6-웰 플레이트에서 웰 3으로 합한다. 멸균된 완전한 종양 배지 3 mL를 웰 1과 2에 첨가한다.
- 모든 3개의 웰 및 피펫 3 mL의 완전한 종양 배지로부터의 배지를 단계 2.12 후에 48 h 동안 각 웰로 흡인시킨다.
3. 원발성 종양 세포주의 생성
- 반전 위상 현미경을 사용하여 초기 계대 배양에서 섬유아세포 오염의 백분율을 결정한다.
참고 : 섬유 아세포는 일반적으로 길고 불규칙하며 잘못 정의 된 세포막을 가지고 있습니다. 그들은 Z 스케일에서 얇거나 평평하게 보입니다.- 섬유아세포 오염이 초기 계대 배양에서 세포의 20%를 초과하는 경우, 완전한 배지를 환원 혈청 배지로 교체한 후 배양을 계속한다.
- 단계 3.1.1에서 환원된 혈청 배지로 교체를 3-4주 동안 일주일에 두 번 반복한다.
- 배양물이 80% 컨플루언시에 도달하면, 50:50을 분할하여 세포를 6-웰 플레이트의 2개의 새로운 웰로 통과시킨다. 세포가 80% 컨플루언시에 도달하면 감소된 혈청 배지에서 50:50 계대를 계속하십시오.
- 3.1.3단계를 최대 4주 동안 반복하고, 필요에 따라 더 큰 배양 플라스크에서 계대배양을 50:50으로 나누어 배양이 80% 컨플루언시티에 도달하면 됩니다. 섬유아세포 집단이 10% 이하로 감소하지 않으면, 단계 3.2를 계속하여 섬유아세포 오염을 제거하기 위한 시차 트립신화 방법을 시도한다. 그렇지 않으면 3.3단계로 진행하십시오.
- 종양 세포를 풍부하게하기 위해, 웰을 1x PBS로 부드럽게 헹구어 혈청을 함유하는 배지를 제거하였다.
- 트립신을 다음과 같이 첨가한다: 6-웰 플레이트에 있는 경우 웰당 1 mL, T25 플라스크의 경우 2 mL, T75 플라스크의 경우 3 mL이다.
- 6-웰 플레이트 또는 플라스크를 1분 동안 37°C의 인큐베이터에 놓는다. 인큐베이터에서 플레이트 또는 플라스크를 제거하고 거꾸로 된 현미경을 사용하여 세포의 접착력을 확인하십시오. 세포가 부분적으로 들어 올리거나 떠있는 경우, 부유 된 세포와 트립신 만 부드럽게 제거하십시오. 세포를 동일하거나 더 큰 부피의 완전한 종양 배지를 함유하는 15 mL 원뿔형 튜브에 넣는다.
참고: 접착 특성에 기초한 세포의 이 부분적인 수집은 다중 분획 중 첫 번째이다. - 모든 셀이 들어올려지거나 4개의 분획이 제거될 때까지 3.2.1단계와 3.2.2단계를 반복합니다.
- 모든 독립 분획을 실온에서 5분 동안 500 × g 에서 원심분리한다.
- 단계 2.7에 기재된 바와 같이 상청액을 흡인하고, 세포를 멸균, 환원된 혈청 배지 5 mL를 사용하여 재현탁시킨다.
- 세포를 각 분획에 대한 T25 플라스크에 플레이트하고, 플라스크를 37°C의 인큐베이터에 놓는다.
- 48시간 후에 배양을 평가하여 종양 세포 대 섬유아세포에 대해 어느 분획이 농축되는지를 결정한다. 섬유아세포가 풍부한 플라스크는 버리세요. 섬유아세포 오염이 <10%이면, 완전한 종양 배지에서 팽창을 계속하고 단계 4로 진행한다. 섬유아세포 오염이 10-30%인 경우, 3.1.2-3.1.4단계를 반복한다. 섬유아세포 오염이 30%를 초과하면, 3.2-3.2.7단계를 반복한다.
- 초기 계대 배양 내에서 섬유아세포가 거의 또는 전혀 검출되지 않으면, 세포가 6-웰 플레이트 또는 플라스크에서 80% 합류되면 50:50으로 분할하여 완전한 종양 배지에서 세포를 계대배양을 계속한다.
4. 조기 통과 원발성 종양 세포주의 확장
- 원발성 종양 배양물에 섬유아세포 오염이 10% 이하가 포함되면, 배지를 흡인하고 일주일에 두 번 멸균된 완전한 종양 배지로 교체한다.
참고: T25의 최적 중간 부피는 5mL입니다. T75는 12 mL; T150은 25 mL이다.- 배양 50:50을 접시 또는 플라스크에서 80 % 컨플루언시에 도달하면 필요에 따라 더 큰 플라스크로 통과시킵니다.
참고 : 문화는 성장에 따라 더 높은 비율로 계대되어야 할 수도 있습니다. 문화가 3-5 일마다 80 %의 합류율에 도달하도록 조정하십시오.
- 배양 50:50을 접시 또는 플라스크에서 80 % 컨플루언시에 도달하면 필요에 따라 더 큰 플라스크로 통과시킵니다.
- 문화가 계대 4 이상에있을 때까지 통과하십시오. 배양물이 최소 두 개의 T75 플라스크에서 80% 합류되면, 단계 5를 계속한다.
5. 확립된 원발성 종양 세포주의 특성화 및 은행 업무
- T75 플라스크 하나를 조기 통과 동결로 Cryopreserve 합니다. 나머지 T75 플라스크의 마이코플라즈마 테스트를 위해, 단계 5.2로 계속하십시오.
- 조기 통과 세포의 동결보존을 위해, 단계 1.5에서 제조된 분취된 동결 배지 1 튜브를 해동시킨다.
- 먼저 단계 3.2에 기재된 바와 같이 플레이트를 1x PBS로 세척하고 단계 3.2.1에 기재된 바와 같이 트립신을 첨가하여 트립신화에 의해 세포를 수집한다.
- 플라스크를 3분 동안 37°C의 인큐베이터에 놓는다. 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 거꾸로 된 현미경을 사용하여 세포의 접착력을 확인하십시오. 세포가 들어 올리거나 떠 다니는 경우, 부드럽게 부유 한 세포와 트립신을 제거하십시오. 세포를 동일하거나 더 큰 부피의 완전한 종양 배지를 함유하는 15 mL 원뿔형 튜브에 넣는다.
참고: 3분 후에도 세포가 부착되어 있으면 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣고 2분 동안 추가로 보관하십시오. - 튜브를 부드럽게 피펫팅하여 잘 혼합하고 계수를 위해 20 μL를 제거하였다.
- 튜브를 실온에서 5분 동안 500 × g 에서 원심분리한다.
- 세포가 회전하는 동안 트리판 블루 또는 아크리딘 오렌지/프로피듐 요오드화물(AO/PI)과 같은 실험실 별 카운팅 프로토콜을 사용하여 계수합니다.
- 원심분리 후 세포를 최소 2 × 106 cells/1 mL 동결 배지로 동결 배지에 재현탁시킨다.
- 단계 5.1.7로부터의 세포 현탁액 1 mL를 예비표지된 1.5 mL 한극물로 옮긴다.
- 동결액을 제어된 속도 동결 챔버에 넣고 즉시 -80°C로 옮긴다.
- 세포를 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮기기 전에 최대 1주 동안 -80°C에서 보관하십시오.
- 마이코플라스마 테스트를 위해 T75 플라스크를 50:50으로 나눕니다. 배지를 단계 1.6에서 제조된 무항생제 배지로 변경한다.
- 72시간 후, 마이코플라즈마 검출 시약, 기질 및 대조군을 시험 전에 실온에서 15분 동안 해동시킨다.
- 시험할 각 배양물로부터 상청액 1 mL를 수집하여 15 mL 원뿔형 튜브에 넣는다.
- 임의의 현탁된 세포를 실온에서 5분 동안 500 × g 에서 원심분리하여 펠릿화한다.
- 100 μL의 샘플 상청액을 로딩하고 대조군을 백색 96-웰 플레이트에 넣는다. 100 μL의 마이코플라즈마 검출 시약을 각 샘플 및 대조군에 첨가한다.
- 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 플레이트를 플레이트 리더에 놓고 발광을 판독한다(판독 A, 즉, 첫 번째 판독).
참고: 마이코플라즈마 키트 제조업체의 프로토콜은 다기능 플레이트 판독기에서 기본 설정을 유지하는 것을 나타냅니다. 판독값은 Luminescence 끝점에서 1초의 통합 시간과 135의 이득으로 설정됩니다. 플레이트 리더는 자동 스케일 루틴을 사용하여 각 실험에 대한 이득 신호를 최적화합니다. 1초 통합 시간은 표준 기본값입니다. 두 설정 모두 플레이트 리더에 의해 해석되는 발광 신호의 강도를 조정하는 데 사용되며 개별 플레이트 리더에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. - 플레이트 판독기로부터 플레이트를 제거하고, 100 μL의 마이코플라즈마 검출 기질을 각 샘플 및 대조군에 첨가한다.
- 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- 플레이트를 플레이트 리더기에 놓고 발광을 판독한다(판독 B, 즉, 두 번째 판독).
- 마이코플라스마 양성을 결정하려면, 판독 B와 판독값 A의 비율을 결정하십시오.
참고: 마이코플라스마 양성률은 마이코플라스마 키트 제조업체의 프로토콜에 설명되어 있습니다. 판독값 A와 B는 동일한 설정으로 획득되며 단순히 판독 순서를 반영합니다.- 마이코플라스마 음성으로 1< 비율을 고려하십시오.
- 1-1.2의 비율이 결정적이지 않다고 생각하고 5.2 단계를 반복하십시오.
- 마이코 플라스마 양성으로 1.2> 비율을 고려하고이 배양을 모니터링하십시오. 필요한 경우 배양을 종료합니다.
- 마이코플라즈마-음성 종양 세포의 유세포 분석 특성화
- 세포-해리 완충액을 사용하여 종양 세포를 제거한다.
- 세포를 계수하고, 단계 1.7에서 FACS 완충액 중에 1 × 106/mL에서 세포를 재현탁시켰다.
- 표면 염색을 위해 100μL의 세포 현탁액을 개별 튜브로 제거한다.
- 실온에서 5분 동안 500 × g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 흡인하고, 세포를 실온에서 10분 동안 FACS 완충액 중의 5% 염소 혈청 중 500 μL로 인큐베이션함으로써 Fc 수용체를 차단한다.
- FACS 완충액 2 mL를 첨가하고, 현탁액을 실온에서 5분 동안 500 × g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 흡인하고 최종 부피가 100 μL가 되도록 항체 (표 1) 및 FACS 완충액의 표면 얼룩 혼합물을 첨가한다.
- 5.3.6단계를 반복합니다.
- 상청액을 흡인하고, 200 μL의 1% 파라포름알데히드 (PFA) 플러스 0.25% EtOH에 재현탁시켜 세포를 고정시킨다. 빛으로부터 보호된 샘플과 함께 실온에서 20분 동안 인큐베이션한다.
- 5.3.6단계를 반복합니다. 세포를 적절한 유세포 분석기를 사용하여 획득하기 위해 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다.
참고: 중피종 종양 세포는 메소텔린 및 N-카데린에 대해 양성일 것으로 예상된다. 일부는 또한 CD90을 발현할 수 있다.
- 각각 단계 4.1 및 5.1에 기재된 바와 같이 완전한 종양 배지 및 뱅크에서 확장시킨다.
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Representative Results
초기 계대 배양의 섬유아세포 오염을 결정하기 위해, 세포는 존재하는 다른 부착성 세포에 비해 섬유아세포의 빈도를 확인하기 위해 반전된 위상 현미경을 사용하여 평가된다. 도 1은 섬유아세포 오염이 없는 배양물에 비해 80%(도 1A), 50%(도 1B) 및 30%(도 1C)의 섬유아세포 오염이 증가한 예를 보여준다(도 1D). 이러한 시각적 평가에 기초하여, 위에서 설명된 바와 같이 확장 조건을 조정한다. 일단 <10% 섬유아세포 오염을 갖는 마이코플라즈마-프리 배양이 확립되면, 유세포 분석기가 중피종 종양 라인의 순도를 결정하기 위해 사용된다.
도 2A,B는 음성 대조군으로서 흑색종 종양 라인(MEL526)을 갖는 ATCC-확립된 중피종 종양 라인(NCI-H2452 및 MSTO-211H)과 비교한 2개의 원발성 중피종 종양 라인(MESO171 및 MESO176)의 대표적인 유세포 분석 표면 염색을 보여준다. 중피종 종양 세포는 메소텔린(도 2A) 및 N-카데린(도 2B)을 발현할 수 있다. 사용된 유세포 분석기 패널과 관련된 상세한 정보는 표 1에 나타내었다. 게이팅 전략은 보충 그림 1에 나와 있습니다. 참고로, CD90은 중피종 종양 세포에 의해서도 발현될 수 있기 때문에 섬유아세포 특이적 마커로서 사용될 수 없다. 표면 단백질 마커 발현에 대한 효소 분리의 영향을 시험하는 것의 중요성은 또한 트립신과 프로테아제-콜라게나제 혼합물 모두 CD90이 영향을 받지 않은 반면 N-cadherin의 표면 발현의 손실을 초래한 것으로 나타났다(도 2C).
도 1: 초기 계대 배양물에서 섬유아세포 오염의 빈도 증가와 확립된 종양 라인의 대표적인 이미지. (A) 80% 섬유아세포 오염을 함유하는 조기 통과 배양의 이미지. (b) 50% 섬유아세포 오염을 함유하는 조기 통과 배양의 이미지. (c) 30% 섬유아세포 오염을 함유하는 조기 통과 배양의 이미지. (d) 확립된 원발성 중피종 종양 라인의 이미지. 배율 막대 = 200μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 확립된 중피종 종양 세포주의 대표적인 유세포 표현형. (A 및 B) ATCC 중피종 세포주, 대조군 흑색종 종양주, 및 원발성 중피종 종양 라인 상의 메소텔린 및 N-카데린의 표면 발현 패턴을 나타내는 히스토그램. (C 및 D) 트립신, 프로테아제-콜라게나제 혼합물, 및 세포 해리 완충제가 N-카데린 및 CD90에 미치는 영향. 약어: Comp-X-A = 형광단 X의 보정된 영역; PE = 피코에리트린; APC = 알로피코시아닌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 표면 항체 | 포르테사 X20 채널 | 레이저 | 클론 | 이소타입 | 부피 / 샘플 (μL) |
| 라이브/데드 옐로우 | BV510 | 보라색 | 해당 없음 | 해당 없음 | 1 |
| 항 메소텔린 APC | 증권 시세 표시기 | 빨강 | REA1057 | IgG1 | 2 |
| 항 CD325 (N- 카데린) PE | 체육 | 증권 시세 표시기 | 8C11 | IgG1 | 5 |
| 안티 CD90 PE-Cy7 | PE-Cy7 | 증권 시세 표시기 | 5E10 | IgG1 | 5 |
표 1: 종양 라인을 표현형화하기 위해 사용되는 유세포 분석 항체. 약어: PE = 피코에리트린; APC = 알로피코시아닌.
보충 그림 S1: 종양 라인의 표현형 분석을 위한 게이팅 전략. 도트 플롯은 관심있는 마커의 발현을 평가하는 것으로 이어지는 게이팅 전략의 각 단계에 대해 표시됩니다. 순방향 스캐터 및 측면 스캐터 특성을 사용하는 임의의 초기 게이트는 관심있는 셀을 식별하기 위해 만들어지고, 그 다음에 시간 특징에 기초한 QC 게이트가 뒤따른다. 그런 다음 세포를 서브게이징하여 전방 및 측면 산란 특성을 사용하여 임의의 이중을 제거합니다. 최종 QC 게이트는 생존력에 기초하며, 죽은 세포는 염료에 대해 양성으로 염색됩니다. 생존 게이트에 따라, 서브게이팅은 패널에 기초하여 수행될 수 있다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 간단하지만 면밀히 따라야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 조기 통과 동결은 초기에 실패한 경우 종양-세포 농축 과정을 반복하는 능력을 보존하는 데 중요하다. 정확한 분할 및 배지 기아 기술을 결정하기 위해 눈으로 섬유아세포 오염을 평가하는 능력은 배양물에서 섬유아세포의 과성장을 방지하는 데 매우 중요합니다. 또한, 시차 트립신화 방법은 배양 동안 세포의 신중한 관찰이 필요합니다. 세포는 상이한 속도로 플라스틱 플레이트를 들어 올릴 수 있으며, 이것은 세포주마다 다를 것이다. 이 과정을 학습하고 이러한 의사 결정 단계를 정제하는 동안, 종양 세포 농축이 관찰될 수 있을 때까지 환원된 혈청 기아 배지(1% Pen/Strep 및 1% FBS를 갖는 RPMI 1640)를 사용하여 원래의 배양물의 일부를 6-웰 플레이트에서 보존할 수 있다.
중피종 종양 라인의 검증된 표현형 특성화에서 주목된 한 가지 중요한 인자는 중피종 종양 세포 표면 마커인 N-cadherin8의 발현에 대한 트립신화 및 프로테아제-콜라게나제 혼합물의 영향이었다. 우리는 세포가 이러한 효소를 사용하여 분리 된 경우 표면 마커의 손실을 관찰했으며, 이는 이전에 기술되었습니다9. 대부분의 표면 단백질이 트립신에 의해 부정적인 영향을 받지 않는 것으로 밝혀졌지만, 유동 패널 설계(10) 동안 각각의 표면 마커를 시험하는 것이 중요하다. 또한, 세포가 확장의 로그 단계에 도달하고 이러한 마커를 재발현할 시간을 가질 때까지 종양 세포를 배양하거나 확장하는 것이 매우 권장된다. 세포 해리 배지를 사용하여 유세포 분석기를 이용한 검출을 위해 N-카데린의 발현 유지를 허용하였다. 해리 매체의 다른 타입은 또한 마커 보유를 허용할 수 있고; 그러나 개별 실험실은 유세포 측정 패널을 구축하기 전에 이러한 배지를 신중하게 테스트해야합니다.
이 연구의 주요 한계는 세포주 확립의 성공률이 50 %에 불과하다는 것입니다. 이는 종양 미세환경의 이질적인 성질 때문일 수 있다. 이러한 과정을 개선하기 위한 애비뉴는 3D 배양 시스템의 사용, 종양 세포 확장을 촉진하기 위한 배지 보충제의 첨가, 개선된 응집 방법, 환자 유래 이종이식편의 사용, 또는 종양 세포 부착을 개선하기 위한 플레이트 코팅(11)을 포함할 수 있다. 실제로, 3D 배양은 췌장암과 같은 도전적인 종양 세포주7의 생성에 성공하는 것으로 나타났다.
이 프로토콜에 포함되지 않는 선택의 한 가지 방법은 메소텔린과 같은 중피종 종양 마커에 기초한 세포 분류에 의한 종양-세포 농축이다. 중피종 종양 세포가 표준 섬유아세포 마커인 CD90을 발현할 수 있기 때문에, 양성 선택은 더 나은 대안이 될 수 있다. 이 방법에 대한 주의 사항은 초기 배양물에서 낮은 수준의 세포성이며, 이는 384- 또는 96-웰 플레이트와 같은 작은 부피의 멀티웰 플레이트로 분류해야 할 것이다. 또한, 이러한 프로토콜은 조직 소화를 위한 콜라게나제의 사용을 포함하므로, 이것이 또한 N-카데린 또는 메조텔린의 표면 발현에 영향을 미칠 수 있는지는 알려져 있지 않다. 메소텔린 발현의 메카니즘은 비교적 알려지지 않았지만, N-카데린은 세포 부착에 중요한 역할을 하며, 이 단백질의 제거는 종양 라인12의 확립에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 이것은 현재 평가 중입니다.
이 방법은 시험관내 모델 시스템의 생성이 이러한 희귀 종양 유형을 연구할 수 있게 하기 때문에 중요하다. 여기에는 CAR-T 세포와 함께 메소텔린과 같은 중피종의 새로운 표면 표적을 확인하고 표적 또는 면역 요법에 대한 내성의 종양 내재적 특성을 밝히는 연구가 포함될 수 있습니다. 또한, 이들 세포가 마우스 모델 에서 생체내에서 확장될 수 있다면, 이것은 또한 소분자뿐만 아니라 세포 기반 및 항체 기반 치료제를 시험하기 위한 공급원을 만들 것이다. 이 프로토콜의 향후 방향은 육종 및 이phasic 하위 집합과 같은 MPM의 다른 하위 유형을 확장하는 능력을 테스트하는 것입니다.
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Disclosures
CH는 Briacell Therapeutics 및 Mesothelioma Applied Research Foundation의 SAB 회원입니다. 다른 모든 저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는이 프로토콜을 시작하는 데 기여한 Raquel Laza-Briviesca와 조직 수집에 대한 협력을 위해 Boris Sepesi, Reza Mehran 및 David Rice 박사를 인정하고 싶습니다. 이 작업과 관련된 추가 자금은 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
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- Testa, J. R., Berns, A.
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- Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
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