Summary
هنا ، يتم وصف الطرق غير الغازية لتوطين بروتينات غشاء المستقبلات الضوئية وتقييم تنكس الشبكية في العين المركبة ذبابة الفاكهة باستخدام تألق eGFP.
Abstract
ينظم الاتجار بالبروتين الغشائي دمج وإزالة المستقبلات والقنوات الأيونية في غشاء البلازما. هذه العملية مهمة بشكل أساسي لوظيفة الخلية وسلامة الخلايا العصبية. أصبحت خلايا المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة نموذجا لدراسة الاتجار بالبروتين الغشائي. إلى جانب رودوبسين ، الذي يصبح عند الإضاءة مستوعبا من غشاء المستقبلات الضوئية ويتحلل ، فإن القناة الأيونية العابرة الشبيهة بإمكانات المستقبل (TRPL) في ذبابة الفاكهة تظهر انتقالا يعتمد على الضوء بين غشاء المستقبلات الضوئية الرابدوميرال (حيث يقع في الظلام) وجسم خلية المستقبلات الضوئية (التي يتم نقلها إليها عند الإضاءة). يمكن دراسة هذا النقل داخل الخلايا ل TRPL بطريقة بسيطة وغير جراحية عن طريق التعبير عن TRPL الموسوم ب eGFP في خلايا المستقبلات الضوئية. يمكن بعد ذلك ملاحظة تألق eGFP إما في التلميذ الكاذب العميق أو عن طريق الفحص المجهري للغمر المائي. تسمح هذه الطرق بالكشف عن التألق في العين السليمة ، وبالتالي فهي مفيدة للفحوصات عالية الإنتاجية والفحوصات الجينية لطفرات ذبابة الفاكهة المعيبة في نقل TRPL. هنا ، يتم شرح إعداد الذباب ، والتقنيات المجهرية ، وكذلك طرق القياس الكمي المستخدمة لدراسة هذا النقل الناجم عن الضوء من TRPL بالتفصيل. ويمكن تطبيق هذه الأساليب أيضا على دراسات الاتجار على بروتينات المستقبلات الضوئية الأخرى لذبابة الفاكهة ، مثل رودوبسين. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام بروتينات rhabdomeral الموسومة ب eGFP ، يمكن استخدام هذه الطرق لتقييم انحطاط خلايا المستقبلات الضوئية.
Introduction
من خلال توصيل وإزالة البروتينات من وإلى غشاء البلازما ، يتحكم الاتجار بالبروتين الغشائي في الخلايا العصبية في معدات غشاء البلازما مع المستقبلات وكذلك القنوات الأيونية ، ونتيجة لذلك ، ينظم وظيفة الخلايا العصبية. عادة ما يكون لسوء التنظيم أو العيوب في الاتجار بالبروتين آثار ضارة على الخلايا وتؤدي إلى تنكس الخلايا العصبية. في البشر ، قد يسبب هذا الأمراض العصبية التنكسية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون أو التهاب الشبكية الصباغي1. أصبحت المستقبلات الضوئية في العين المركبة لذبابة الفاكهة الميلانوغاستر نظاما نموذجيا في الجسم الحي لدراسة الاتجار بالبروتين الغشائي2. هذا ليس فقط بسبب التنوع الجيني لذبابة الفاكهة التي تسمح بإجراء فحوصات وراثية فعالة ، ولكن أيضا لأن جميع المكونات الأساسية لغشاء المستقبلات الضوئية الممتص للضوء تتميز بتفصيل كبير وتتوفر تقنيات مجهرية فعالة يمكن تطبيقها على عين الذبابة. هذه التقنيات هي محور هذه المقالة.
في خلايا المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة ، يشكل غشاء البلازما القمي كومة معبأة بكثافة من الزغابات الدقيقة على طول جانب واحد من الخلية ، تسمى rhabdomere. يتم ترتيب rhabdomeres من خلايا المستقبلات الضوئية R1-6 في نمط شبه منحرف مميز في حين أن خلايا المستقبلات الضوئية R7 و R8 تشكل rhabdomere واحد في وسط هذا شبه المنحرف3. هناك حاجة إلى الاتجار بالبروتين الغشائي من أجل دوران منظم لبروتينات غشاء rhabdomeral مثل رودوبسين و TRP المنشط بالضوء (إمكانات المستقبلات العابرة) وقنوات أيون TRPL (الشبيهة ب TRP) لضمان الكمية المناسبة من بروتينات النقل الضوئي هذه في rhabdomere. يتم تصنيع بروتينات غشاء المستقبلات الضوئية في الشبكة الإندوبلازمية ونقلها عبر جهاز غولجي إلى الرابدومير. بعد تنشيط رودوبسين بواسطة الضوء ، يمكن أن يصبح جزيء رودوبسين إما معطلا عن طريق امتصاص فوتون ثان أو يمكن إزالته من الرابدومير عن طريق داء الخلايا الداخلية بوساطة كلاثرين. رودوبسين إندوسيتوسيد إما أن يتحلل في الليزوسوم أو يعاد تدويره مرة أخرى إلى رابدومير 4,5. يتم استيعاب القناة الأيونية TRPL أيضا بعد تنشيط شلال النقل الضوئي وتخضع لعملية نقل تعتمد على الضوء بين rhabdomere (حيث توجد عندما يتم الاحتفاظ بالذباب في الظلام) وحجرة تخزين غنية ب ER في جسم الخلية (والتي يتم نقلها إليها في غضون عدة ساعات عند الإضاءة)6,7,8,9,10 . على النقيض من رودوبسين endocytosed ، يتم تحلل كميات صغيرة فقط من TRPL عبر المسار الداخلي الصبغي ، ويتم تخزين الغالبية داخل الخلايا بدلا من ذلك وإعادة تدويرها مرة أخرى إلى rhabdomere عند التكيف المظلم6. وبالتالي يمكن استخدام TRPL لتحليل الاتجار ببروتينات غشاء البلازما الناجم عن الضوء. تستخدم خلايا المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة أيضا لدراسة التنكس العصبي. غالبا ما يتم تحديد تنكس خلايا المستقبلات الضوئية من خلال تقييم بنية rhabdomeres ، والتي تتفكك نتيجة للعمليات التنكسية5.
من أجل دراسة التوطين تحت الخلوي ل TRPL و rhodopsin في خلايا المستقبلات الضوئية أو تنكس خلايا المستقبلات الضوئية ، تم تطبيق طريقتين مجهريتين فلوريتين تختلفان فيما يتعلق بسرعة التحليل والدقة هنا. طريقة سريعة جدا وغير جراحية يمكن استخدامها للشاشات الجينية ولكن بدقة مكانية محدودة هي الكشف عن التألق في التلميذ الكاذب العميق (DPP). DPP هي ظاهرة بصرية للعيون المركبة المفصلية التي تم شرح أصلها الهندسي بالتفصيل من قبل Franceschini و Kirschfeld في 197111. باختصار ، على العديد من المستويات البصرية أسفل تراكب شبكية العين ، يمكن ملاحظة صور الرابدوميرات من ommatidia المجاورة. على المستوى البؤري من خلال مركز انحناء العين ، تشكل هذه الإسقاطات المتراكبة صورة تشبه التخطيط شبه المنحرف للرابدوميرات في أوماتيديوم واحد فقط من الحجم الأكبر. يمكن أيضا ملاحظة هذه الظاهرة بشكل مستقل عن التعبير الخارجي لبروتينات التألق (مثل TRPL::eGFP8) ، والتي مع ذلك تجعل من السهل اكتشاف DPP (الشكل 1A-A'')12. الطريقة الثانية غير الغازية هي الفحص المجهري للغمر المائي الذي يعتمد على تصوير البروتينات الموسومة بالفلورسنت بعد تحييد جهاز العين ثنائي العين بصريا بالماء (الشكل 1B-C'')12. باستخدام طريقة الغمر بالماء ، يمكن تقييم الكمية النسبية من TRPL::eGFP في rhabdomeres أو جسم الخلية كميا لخلايا المستقبلات الضوئية الفردية. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام البروتينات الموسومة بالتألق غير المنقولة لتقييم سلامة rhabdomeral وتحديد المسار الزمني للانحطاط المحتمل بطريقة كمية ، كما هو موضح هنا.
في حين أن تسجيلات DPP هي إلى حد بعيد أسهل وأسرع هذه الطرق في الأداء ، فإن الدقة المكانية للبيانات التي تولدها محدودة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من الأسباب التي تجعل DPP غائبا ، والتي لا يمكن تمييزها بالضرورة عن طريق تصوير DPP نفسه. نظرا لأن DPP يمثل مجموعة من العديد من ommatidia ، يتم فقدان المعلومات حول الخلايا الفردية. وبالتالي ، فإن تصوير DPP منخفض الدقة يؤدي وظيفة مهمة في فحص أعداد كبيرة من الذباب ولكن يجب أن تتبعه عموما تسجيلات عالية الدقة عن طريق الفحص المجهري للغمر بالماء. تسمح الصور المجهرية للغمر المائي بتفسيرات حول الخلايا الفردية أو عيوب النمو أو مورفولوجيا العين أو سوء توطين البروتين أو تنكس الشبكية بالإضافة إلى تحديد كمية هذه الآثار. ويصف هذا البروتوكول هاتين التقنيتين بالتفصيل.
الشكل 1: نظرة عامة على الاختلافات المجهرية لعين ذبابة الفاكهة المعروضة في هذا البروتوكول. التمثيلات التخطيطية والرسوم البيانية المجهرية النموذجية للتصوير الفلوري العميق للبؤبؤ الكاذب (DPP) ، (B-B'') المجهر القاتل للغمر المائي للرابدوميرات الفلورية ، و (C-C'') المجهر غير المميت لقطرة الماء من الرابدوميرات الفلورية. شريط المقياس (A''): 100 ميكرومتر. أشرطة المقياس (B''-C''): 10 ميكرومتر. وقد عدل هذا الرقم من المرجع13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اعتبارات عامة
- استخدم مخزونات ذبابة الفاكهة التي تعبر عن بروتين فلوري دائم الموقع بشكل دائم للتحليل المورفولوجي (على سبيل المثال ، TRP::eGFP ، eGFP::NINAC) ونقل البروتينات للتحليلات المتعلقة بالاتجار بالبروتين (على سبيل المثال ، TRPL::eGFP ، Arr2::eGFP).
- تحديد مسبق لظروف التعرض للضوء للذباب المختار للنهج التجريبي.
- للتكيف مع الظلام ، احتفظ بالذباب في صناديق مظلمة للفترة المطلوبة عند 25 درجة مئوية. للحصول على إضاءة تصل إلى 16 ساعة في تجارب النقل (على سبيل المثال، TRPL::eGFP التي تعبر عن الذباب)، احتفظ بالذباب تحت أنبوب فلورسنت في درجة حرارة الغرفة.
- في التجارب التي تقيم انحطاط المستقبلات الضوئية (على سبيل المثال ، TRP::eGFP الذي يعبر عن الذباب) ، احتفظ بالذباب تحت أنبوب فلورسنت عند 25 درجة مئوية في دورة مظلمة مدتها 12 ساعة / 12 ساعة للإضاءة طويلة الأجل تصل إلى 28 يوما مع الضوء الأبيض.
- لإضاءة الذباب بالضوء الملون ، استخدم صناديق بلاستيكية شفافة ملونة مختلفة مع أنبوب الفلورسنت.
- إذا تم استخدام مخزونات الذباب ذات العيون المصطبغة ، فإن الحيوانات العمرية على وجه التحديد للتحليل المقارن ، لأن تصبغ العين قد يزداد بشكل كبير مع تقدم العمر.
ملاحظة: بالنسبة لتفسير البيانات ، من المهم ملاحظة وجود تحيز للإشارة بسبب التأثير الموجي البصري للبنية الرابدوميرالية. وفقا لذلك ، سيتم دائما تضخيم إشارة التألق من rhabdomere إلى حد ما في تصوير DPP والفحص المجهري للغمر المائي بالنسبة للإشارات التي تم الحصول عليها من جسم الخلية. ويلاحظ هذا بشكل بارز في العيون المصطبغة ، حيث يتم امتصاص التألق من خارج الرابدوميرات بواسطة هذه الأصباغ وله أهمية خاصة عند اكتشاف بروتينات الاندماج التي تنقل داخل الخلايا. وبالتالي ، فيما يتعلق بالخطوات الحرجة ، تنظر هذه الدراسة في الذباب الأبيض والأحمر العينين بشكل منفصل. - فيما يتعلق بالفحص المجهري للغمر المائي ، يتم وصف نوعين مختلفين. تباين قاتل أسرع بالإضافة إلى اختلاف غير قاتل يسمح بالشفاء للدراسات اللاحقة.
2. تصوير DPP
- قم بإعداد مساحة العمل بالمعدات والكواشف اللازمة كما هو موضح في الشكل 2. تخدير الذباب (1-3 أيام) من النمط الوراثي الذي يعبر عن بروتين التألق في خلايا المستقبلات الضوئية مع CO2 على flypad. اختر للتصوير تحت مجهر ستيريو مع مصدر ضوء تقليدي وتكبير منخفض (على سبيل المثال، 10x).
الشكل 2: مساحة عمل تصوير DPP. المواد المطلوبة هي (A) جهاز تخدير CO2 ، (B) مجهر ستيريو مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية ومجموعة مرشحات التألق ، (C) مصدر الضوء ، (D) كاميرا مثبتة على المجهر مع برنامج (E) ، (F) فرشاة الطلاء ، (G) الورق المقوى الأسود ، و (H) قارورة الطيران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- بالنسبة لتصوير DPP ، حافظ على تخدير الذباب المحدد ووضع أحدهما في وسط هدف المجهر على جانبه بحيث تواجه العين اليسرى أو اليمنى الهدف شعاعيا بدقة (الشكل 3A).
ملاحظة: نظرا لأن التخطيط الوهمي لخلايا المستقبلات الضوئية يعرض تناظر المرآة عند خط الوسط الظهري البطني ، فمن الأفضل ملاحظة DPP أعلى أو أسفل خط الاستواء للعين بقليل (الشكل 3B).
الشكل 3: وضع الذبابة تحت المجهر المجسم لتصوير DPP . (أ) رسم توضيحي للذبابة على جانبها مع عين واحدة تواجه هدف المجهر شعاعيا. (ب) يجب قلب رأس الذبابة قليلا لأعلى أو لأسفل بحيث يركز الهدف على نقطة أعلى أو أسفل خط الاستواء بالعين بقليل كما هو موضح في الأسهم الحمراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- قم بزيادة التكبير ليناسب العين بأكملها (على سبيل المثال ، 100x) وتوسيط ommatidia المركزي للعين. قلل من عمق مجال المجهر، على سبيل المثال، عن طريق ضبط الحجاب الحاجز المزدوج القزحية إلى إعداد ضحل (الشكل 4A-B').
- قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء التقليدي وقم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية المجهري بأقصى كثافة وحدد مجموعة مرشح التألق للمجهر وفقا لبروتين التألق المعبر عنه في العينين (الشكل 4C-E). اضبط مسار الضوء باتجاه الكاميرا المثبتة على المجهر.
- استخدم ميزة التصوير المباشر داخل البرنامج لضبط سطوع الصورة على إعداد يكتشف إشارات محددة فقط من العين عن طريق ضبط وقت التعرض وقيمة الكسب (على سبيل المثال ، 80 مللي ثانية و 12x ، على التوالي). أعد ضبط تركيز المجهر "في" العين (أسفل القرنية) لتوليد الصورة المتراكبة ل DPP (الشكل 4C-E').
الشكل 4: رسم توضيحي لتصوير DPP وتصوير DPP الفلورسنت. صور مثالية لعيون ذبابة الفاكهة تحت الإضاءة التقليدية والأشعة فوق البنفسجية مع مجموعة مرشحات GFP ، تم التقاطها بمستويات بؤرية مختلفة موضحة في مقاطع عرضية تخطيطية عبر العين. (أ) ميكروغراف مسجل بإعدادات ساطعة لمصدر ضوء تقليدي ، ووقت تعرض 30 مللي ثانية ، وكسب 1x ، وعمق عمق المجال ، والمستوى البؤري بالقرب من سطح القرنية كما هو موضح في (A'). (ب) تم تسجيل التصوير المجهري بإعدادات ساطعة لمصدر ضوء تقليدي ، ووقت تعرض 30 مللي ثانية ، وكسب 1x ، وعمق مجال ضحل ، ومستوى بؤري حوالي 180 ميكرومتر تحت سطح القرنية كما هو موضح في (B'). وأشار DPP. (ج-هاء) تم تسجيل التصوير المجهري بإعدادات عالية الكثافة لمصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية ومجموعة مرشحات GFP ، ووقت التعرض البالغ 80 مللي ثانية ، والكسب 12x ، وعمق المجال الضحل ، والمستوى البؤري (C') بالقرب من ، (D') أقل قليلا ، أو (E') حوالي 180 ميكرومتر تحت سطح القرنية. يشار إلى DPP الفلورسنت بسهم منحني. شريط المقياس 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- التقط لقطة من DPP الفلورسنت. قم بتحويل المجهر مرة أخرى إلى الضوء المرئي ومسار الضوء مرة أخرى نحو المناظير. استرجع الحيوان المصور في قارورة ذبابة لمزيد من الإجراءات وفقا لنمطه الظاهري DPP (على سبيل المثال ، الصلبان). تابع مع الحيوان التالي في الخطوة 2.2.
3. المجهر غمر الماء
- إعداد الذباب
- قم بإعداد مساحة العمل بالمعدات والكواشف اللازمة كما هو موضح في الشكل 5. انقل الذباب مع ظروف العمر والإضاءة المحددة مسبقا إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل مبرد مسبقا وقم بتخديره عن طريق احتضانه على الجليد لمدة 15 إلى 30 دقيقة.
ملاحظة: احمل الذباب البالغ من العمر 1 يوم والمتكيف مع الظلام كمرجع. بشكل عام ، يجب نقل الذباب المتكيف مع الظلام إلى صندوق ثلج مع غطاء في الظلام. يمكن نقل الذباب المتكيف مع الضوء إلى الجليد في ضوء الغرفة.
- قم بإعداد مساحة العمل بالمعدات والكواشف اللازمة كما هو موضح في الشكل 5. انقل الذباب مع ظروف العمر والإضاءة المحددة مسبقا إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل مبرد مسبقا وقم بتخديره عن طريق احتضانه على الجليد لمدة 15 إلى 30 دقيقة.
الشكل 5: مساحة عمل الفحص المجهري للغمر في الماء. المواد المطلوبة هي: (أ) أنبوب طرد مركزي 15 مل ، (ب) رقائق ثلج ، (ج) ماء مقطر مبرد ، (د) مجهر مجسم ، (ه) طبق بتري ، (و) بلاستيسين ، (ز) شريحة كائن ، (ح) دبابيس الحشرات أو أطراف ماصة ومشرط ، (ط) مجهر فلوري مع برنامج (ي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- اختر التحضير المناسب من الاثنين الموصوفين أدناه (3.1.3 التباين المميت أو 3.1.7 التباين غير المميت) وكلما تم التمييز بين العيون المصطبغة وغير المصطبغة ، اتبع الخطوات ذات الصلة.
- تحضير الذباب للاختلاف القاتل على النحو التالي.
- قم بلصق قطعة من البلاستيسين على شريحة كائن وقطعة أخرى في وسط طبق بتري (على سبيل المثال ، 94 مم Ø) واحتفظ بها منفصلة في الوقت الحالي. املأ طبق بتري بالماء المقطر المبرد بالثلج وبعض رقائق الثلج (الشكل 6A).
- ضع ذبابة واحدة مخدرة بالجليد تحت مجهر مجسمة فوق شريحة الجسم المطلي بالبلاستيسين. أدر الذبابة على ظهرها واخترق دبوس حشرة من خلال مركز الصدر (الشكل 6B). ثبت الدبوس أفقيا على شريحة الجسم المطلي بالبلاستيك ووجه إما العين اليسرى أو اليمنى للذبابة إلى أعلى (الشكل 6C).
- قم بإصلاح شريحة الكائن بعناية ، مع توجيه جانبها الخالي من البلاستيك لأسفل ، في طبق Petri الذي يمنع دوران الذبابة. تأكد من أن عين الذبابة مغطاة بالماء (الشكل 6D). استخدم إبرة تحضير لإزالة أي فقاعات هواء قد تكون تشكلت حول العين بعناية ، وانتقل على الفور إلى التقاط الصور للحصول على أفضل النتائج.
ملاحظة: يؤدي التأخير الكبير في الحصول على الصور إلى إعادة الاستيقاظ وحركات الذبابة مما قد يؤدي إلى صور ضبابية.
الشكل 6: التحضير للفحص المجهري للغمر المائي القاتل. رسم توضيحي ل (أ) شريحة جسم مغلفة بالبلاستيك وطبق بتري ، (ب) تثبيت ذبابة عبر الصدر على أرض بلاستيكية ، (ج) اتجاه الذبابة على شريحة الجسم المطلي بالبلاستيك ، و (د) الإعداد التجريبي النهائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- تحضير الذباب للاختلاف غير المميت على النحو التالي.
- انقل ذبابة واحدة مخدرة بالثلج أولا إلى طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر وادفع الذبابة نحو الطرف بعناية بالهواء المضغوط.
- اقطع طرف الماصة أمام الرأس مباشرة باستخدام مشرط. باستخدام ملاقط ، ادفع الذبابة بعناية على بعد بضعة ملليمترات من الطرف. اقطع طرف الماصة مرة أخرى وادفع الذبابة مرة أخرى نحو الطرف بالهواء المضغوط بحيث يبرز رأس الذبابة فقط من طرف الماصة.
- قم بلصق قطعة من البلاستيسين على شريحة كائن واضغط على طرف الماصة فيها بحيث تكون العين اليسرى أو اليمنى للذبابة متجهة إلى الأعلى (الشكل 7A). قبل الحصول على الصورة مباشرة، استخدم ماصة مختبرية للالتصاق بقطرة كبيرة من الماء المبرد على الجانب السفلي من هدف الغمر بالماء (الشكل 7B). انتقل على الفور إلى الحصول على الصور للحصول على أفضل النتائج.
ملاحظة: يؤدي التأخير الكبير في الحصول على الصور إلى إعادة الاستيقاظ وحركات الذبابة مما قد يؤدي إلى صور ضبابية.
الشكل 7: التحضير للمجهر غير المميت لقطرة الماء. رسم توضيحي ل (أ) ذبابة مخدرة على البارد مثبتة داخل طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر مثبت على شريحة جسم مغلفة بالبلاستيك و (ب) تطبيق قطرة ماء مبردة على الجانب السفلي من هدف الغمر بالماء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- الحصول على الصور
- ضع بعناية طبق بتري (الخطوة 3.1.3) أو شريحة الكائن (الخطوة 3.1.7) مع الذبابة المحضرة على مرحلة المجهر وحدد هدفا للغمر بالماء.
- اخفض هدف الغمر بالماء يدويا حتى تلامس سطح الماء (الخطوة 3.1.3) أو تلمس عين الذبابة القطرة (الخطوة 3.1.7) (الشكل 8A ، B).
- قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية المجهري وحدد مجموعة المرشحات المناسبة. استخدم العدسات لوضع الذبابة تحت الهدف وتركيز المجهر على سطح العين.
- قم بتبديل مسار الضوء نحو كاميرا المجهر وقم بإنشاء صورة حية في البرنامج المقابل. أعد ضبط التركيز البؤري للكاميرا وقم بتقييم اتجاه العين ، مع الأخذ في الاعتبار أن العين يجب أن تواجه هدف المجهر شعاعيا كما هو موضح بمزيد من التفصيل في الشكل 8C-E.
الشكل 8: وضع الذبابة تحت المجهر الفلوري لتصوير الغمر بالماء. الإعداد والتوجيه النهائي للحصول على الصور باستخدام بروتوكولات إعداد الذبابة (A) القاتلة أو (B) غير المميتة. (ج) رسم توضيحي لاتجاه الذبابة للحصول على أفضل النتائج لصور الفحص المجهري للغمر في الماء. النقطة المثالية للتركيز على العين ليست المركز الدقيق فيما يتعلق بالمحاور الأمامية / الخلفية والظهرية / البطنية ولكنها أعلى قليلا من خط استواء العين ، كما هو موضح في السهم الأحمر. (د) مثال على صورة الغمر بالماء لعين في وضع مثالي. تظهر جميع محاور التماثل الثلاثة للتجانب السداسي الوهمي كخطوط مستقيمة ويمكن أن يكون الحد الأقصى لكمية الأوماتيديا في بؤرة التركيز في نفس الوقت. (ه) مثال على صورة الغمر المائي لعين في وضع غير صحيح. تحتوي الصورة على محاور منحنية وعمق مجال ضحل. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- استخدم LUT المناسب (جدول البحث) داخل برنامج التصوير للكشف عن التشبع الزائد (المشار إليه على أنه بيكسلات حمراء).
- في حالة الذباب غير المصطبغ، اضبط وقت التعرض بحيث تكون ألمع وحدات البكسل أقل بقليل من حد التشبع لكل صورة.
- في حالة الذباب المصطبغ والتباين القاتل ، اضبط وقت التعرض بحيث تكون جميع وحدات البكسل الأكثر سطوعا أقل بقليل من حد التشبع في ما لا يقل عن خمسة ذباب فردي عمره 1 يوم ، متكيفة مع الظلام. تطبيق متوسط وقت التعرض المحسوب على جميع الظروف التجريبية الأخرى (الأنماط الجينية ، ظروف الإضاءة ، النقاط الزمنية ، إلخ).
- في حالة الذباب المصطبغ (على سبيل المثال ، العيون الحمراء) والاختلاف غير المميت ، اضبط وقت التعرض بحيث تكون جميع وحدات البكسل الأكثر سطوعا أقل بقليل من حد التشبع لكل ذبابة عمرها 1 يوم ، متكيفة مع الظلام بشكل فردي. قم بتطبيق وقت التعرض هذا على جميع الظروف التجريبية الأخرى (ظروف الإضاءة ، والنقاط الزمنية ، وما إلى ذلك) لهذه الذبابة.
- قم بتسجيل صورة وحفظها كملف خام لأرشفة جميع البيانات الوصفية المقابلة للتسجيل. تصدير الصورة بتنسيق .tif للقياس الكمي التالي.
ملاحظة: في حالة التباين غير المميت ، قم بإضاءة الذباب لمدة 5 دقائق بالضوء الأحمر (على سبيل المثال ، 630 نانومتر) مباشرة بعد الحصول على الصورة ، إذا كان المقصود استخدامها لمزيد من التجارب. يعمل الضوء الأحمر على إلغاء تنشيط شلال النقل الضوئي الذي تم تنشيطه بشكل مفرط بواسطة الضوء القصير المكثف أثناء التقاط الصورة.
- تحليل البيانات وتحديد كمية التألق eGFP النسبي في rhabdomeres من المجهر غمر الماء
- قم بتنزيل البرنامج ImageJ/Fiji وتثبيته وتنفيذه.
- اضبط إعدادات ImageJ بالنقر فوق تحليل > مجموعة القياسات ... وحدد فقط المربع الخاص بمتوسط القيمة الرمادية. استيراد صورة .tif من خلال النقر على ملف > فتح... أو عن طريق السحب والإفلات. اختر منطقة تمثيلية للصورة التي هي في التركيز البؤري وقم بتكبيرها إلى 200٪ -300٪ عن طريق الضغط بشكل متكرر على Ctrl و + معا .
- حدد الأداة البيضاوية وأثناء الضغط على مفتاح Shift ، قم بإنشاء تحديد دائري في الصورة أصغر بكثير من rhabdomere فلورسنت واحد. قبل تحرير زر الماوس، ابحث عن الحجم الدقيق المعروض أسفل شريط الأدوات في نافذة ImageJ الرئيسية. استخدم نفس حجم التحديد الدائري لجميع التحليلات.
ملاحظة: يعتمد الحجم الدقيق للتحديد الدائري بالبكسل أو الميكرون على الإعداد المحدد. استخدم دائرة حوالي 1/3 أو 1/4 من قطر الرابدوميرال لذباب التحكم الذي يبلغ من العمر يوما واحدا والمتكيف مع الظلام. - حرك التحديد الدائري إما بالنقر بالماوس فوقه وسحبه أو بالضغط على مفاتيح الأسهم على لوحة المفاتيح.
- لقياس شدة التألق داخل التحديد الدائري ، حرك الدائرة إلى الرابدومير الأول (r1) وانقر فوق تحليل > قياس أو استخدم الاختصار Ctrl + M. ستظهر نافذة نتيجة تسرد القيمة الرمادية المقاسة.
- استمر في قياسات r2-r6 كقياسات متكررة وقياس إشارة الخلفية (b). في حالة الذباب غير المصطبغ ، قم بإجراء قياسات إضافية لمناطق جسم الخلية المقابلة (c1-c6) (الشكل 9).
الشكل 9: القياس الكمي للتألق الرحيدي النسبي لدراسات النقل. رسم توضيحي بشأن التحديد الكمي لتألق eGFP النسبي في الرابدوميرات عن طريق قياس شدة التألق للرابدومير (r) وجسم الخلية (c) والخلفية (b) لثلاث أوماتيديا تمثيلية مختلفة (دوائر بيضاء) في صورة مجهرية واحدة للغمر بالماء ؛ شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يظهر أوماتيديوم مكبر على اليمين. شريط المقياس: 2 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- كرر الخطوتين 3.3.5 و3.3.6 لأوماتيديا أخريين، مما أدى إلى ثلاث نسخ متماثلة تقنية. ضع علامة على ommatidia التي تم تحليلها باستخدام أداة قلم رصاص واحفظ هذه الصورة للتوثيق.
- حدد القيم الرمادية المقاسة وانسخها من نافذة النتائج والصقها في برنامج جداول البيانات لإجراء مزيد من العمليات الحسابية. فرز قيم كثافة التألق وفقا لأصلها في فئات rhabdomere (r) ، جسم الخلية (c) ، والخلفية (b). احسب متوسط الكثافة من كل فئة (I r ، Ic ، Ib).
- احسب الكمية النسبية ل eGFP الموجودة في الرابدومير (R)، باستخدام الصيغة التالية (1) للعيون غير المصطبغة والصيغة (2) للعيون المصطبغة:
(1)
(2) - تابع الصورة التالية في الخطوة 3.3.3. يوصى باستخدام صور من خمسة أفراد على الأقل من كل مجموعة تجريبية كنسخ بيولوجية للحصول على قياس موثوق.
(1)
(2)- تحليل البيانات وتحديد كمية مورفولوجيا العين بواسطة تألق eGFP في الصور المجهرية للغمر المائي
- قم بتنزيل برنامج ImageJ/Fiji وتثبيته وتنفيذه. استيراد صورة .tif بالنقر فوق ملف > فتح ... أو عن طريق السحب والإفلات. اختر ثلاثة أوماتيديا متجاورة في منطقة تمثيلية للصورة قيد التركيز.
- قم بتقييم 18 rhabdomeres من الاختيار بشكل فردي وفقا لكثافة eGFP ، وحدة الحافة ، والتباين فيما يتعلق بإشارة الخلفية المحيطة لإنشاء مؤشر انحطاط. سجل الرابدوميرات المرئية بوضوح بقيمة 2 ، والرابدوميرات المرئية بشكل ضعيف بقيمة 1 ، والرابدوميرات الغائبة بقيمة 0 (الشكل 10).
ملاحظة: تؤدي طريقة القياس هذه إلى الحصول على درجة 36 للعيون السليمة تماما ودرجة 0 للعيون المنحطة بالكامل. يوصى بتعيين درجة 36 إلى 100٪ على مؤشر الانحطاط.
الشكل 10: القياس الكمي عن طريق تقييم الرابدومير لدراسات الانحطاط. رسم توضيحي يتعلق بالقياس الكمي لمورفولوجيا العين عن طريق تسجيل الرابدوميرات لثلاث دوائر تمثيلية مختلفة (دوائر بيضاء) في صورة مجهرية واحدة للغمر المائي بقيم 2 (مرئية بوضوح ؛ دائرة زرقاء) ، 1 (مرئية بشكل ضعيف ؛ دائرة برتقالية) ، أو 0 (غائبة ؛ دائرة حمراء). شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يظهر أوماتيديوم مكبر على اليمين. شريط المقياس: 2 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- افتح الصورة التالية وتابع مع الخطوة 3.4.2. يوصى باستخدام صور من ثمانية أفراد على الأقل من كل مجموعة تجريبية كنسخ بيولوجية للحصول على قياس موثوق.
ملاحظة: نظرا لأن طريقة القياس الكمي هذه أقل موضوعية من طريقة تحديد حجم النقل حسب كثافة التألق، فإن العدد الموصى به من النسخ المتماثلة أعلى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا الذباب الذي يعبر عن TRPL::eGFP بروتين الانصهار تحت سيطرة المروج رودوبسين 1. في هذه الذباب، يتم التعبير عن TRPL::eGFP في خلايا المستقبلات الضوئية R1-6 من العين المركبة ويعرض توطينا يعتمد على الإضاءة. عندما يتم الاحتفاظ بالذباب في الظلام ، يتم دمج TRPL::eGFP في الرابدوميرات الخارجية. بعد الإضاءة لعدة ساعات ، ينتقل TRPL إلى جسم الخلية حيث يتم تخزينه في حجرة غنية ب ER. 8,10 عندما يقع TRPL::eGFP في الرابدوميرات ، يمكن ملاحظة تألقه في DPP. ومع ذلك ، يختفي التألق الرحيدي في الضوء نتيجة لنقل TRPL::eGFP (الشكل 11A ، B). وقد استخدم هذا لإجراء فحص جيني للطفرات المعيبة في استيعاب TRPL::eGFP (الشكل 11C,D)14,15. للسماح بعزل الطفرات القاتلة التي يحتمل أن تكون متماثلة الزيجوت ، تم تنفيذ هذه الشاشة باستخدام نظام الخميرة Flp / FRT لتوليد استنساخ الخلايا الجسدية في أنسجة العين النامية (أي عيون الفسيفساء). إلى جانب بساطة فحص DPP ، فإن المزايا الكبيرة الأخرى لطريقة الكشف عن التألق هذه هي إنتاجيتها العالية بالإضافة إلى طابعها غير الغازي الذي يسمح بتحديد الطفرات في الذباب الحي واستخدام هذه الذباب لتوليد مخزونات ذبابة متحورة مستقرة.
الشكل 11: نتائج تمثيلية من فحص وراثي على عيوب نقل TRPL. تم تحور ذكور الذباب مع ميثان سلفونات الإيثيل (EMS) وعبرت إلى الإناث التي تعبر عن TRPL::eGFP في خلايا المستقبلات الضوئية R1-6. تم فحص الجيل F1 الناتج مع عيون الفسيفساء التي يسببها Flp / FRT المتحورة بشكل متماثل بحثا عن عيوب في نقل TRPL عن طريق تصوير التلاميذ الزائفين العميقين الفلورسنت (DPP) بعد فترة من التكيف المظلم (العمود الأيسر) وكذلك التكيف مع الضوء (العمود الأيمن). (أ، ب) تم نقل الذباب غير المتحور على طول كعنصر تحكم في نقل TRPL المنتظم الناجم عن الضوء. يشار إلى DPP غير الفلورسنت بواسطة سهم. (ج، د) نتيجة مثالية للطفرات المعزولة المعيبة في نقل TRPL الناجم عن الضوء. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تحديد الطفرات المعيبة لنقل TRPL (ttd) التي تم عزلها من هذه الشاشة الجينية في وقت لاحق وتم تمييز عيوبها بمزيد من التفصيل بمساعدة تصوير الغمر بالماء. وقد طبق الفحص المجهري للغمر المائي لتقييم توطين البروتينات في الرابدوميرات وأجسام الخلايا أو لتتبع العيوب في بنية الرابدوميرال بسبب انحطاط المستقبلات الضوئية كميا على النحو المبين في البروتوكول. يوضح الشكل 12A,B التقدير الكمي لكمية TRPL::eGFP الموجودة في rhabdomeres من الذباب مع عيون الفسيفساء المتحولة غير المتحولة و lolattd12 في الظلام ، في الضوء ، وبعد التكيف المظلم الثاني. في الذباب المتحكم (غير المتحول) ، ينتقل TRPL::eGFP من rhabdomeres إلى جسم الخلية بعد 16 ساعة من الإضاءة مما يؤدي إلى انخفاض TRPL::eGFP إلى حوالي 45٪ مقارنة بالحالة المظلمة المتكيفة. الحضانة المظلمة الثانية ترفع التألق الرابدوميرال مرة أخرى إلى 95٪ من القيمة الأولية. تم عزل متحور lolattd12 بواسطة فحص DPP بسبب عيب نقل TRPL. وبناء على ذلك، لا يبدو أن نمط التألق TRPL::eGFP في صور الغمر المائي للرابدوميرات يتغير بشكل كبير بعد 16 ساعة من الإضاءة والتكيف المظلم اللاحق لمدة 24 ساعة. ومع ذلك ، تكشف الصور أيضا أن طفرات lolattd12 معيبة من الناحية التنموية ، وهو ما يتضح من الغياب العرضي لخلايا المستقبلات الضوئية كما هو موضح سابقا لمسوخ لولا الأخرى16. تؤدي هذه العيوب المورفولوجية إلى عدم القدرة على قياس إشارة خلفية صالحة ، مما يمنع القياس الكمي الصحيح باستخدام الصيغة (1). في المقابل ، vps35MH20 هو متحور يعرض عيب نقل TRPL دون التأثير على مورفولوجيا ommatidial بهذه الطريقة10. في هذا المتحور ، يمكن لطريقة القياس الكمي الموصوفة هنا اكتشاف عيب إعادة تدوير كبير إحصائيا (الشكل 12C ، D).
الشكل 12: النتائج التمثيلية لعيب نقل TRPL في ذباب لولا و vps35 المتحور وحدود طريقة القياس الكمي. (A) TRPL::eGFP - التعبير عن الذباب غير المتحور و lolattd12 تم احتضان الذباب الفسيفسائي المتحولة العينين في الظلام لمدة 3 أيام ، مضاءة بالضوء البرتقالي لمدة 16 ساعة ، وتكييفها الظلام لمدة 24 ساعة للمرة الثانية. تم التقاط صور لرابدوميرات الفلورسنت عن طريق الفحص المجهري للغمر المائي لتسجيل توطين TRPL::eGFP تحت الخلوي كما هو موضح في الخطوة 3.2.6. (ب) التحديد الكمي للتألق الرابدومري للحيوانات غير الطافرة (الرمادية) واللولاttd12 المتحولة (الخضراء) كما هو موضح في الخطوة 3-3-9 باستخدام الصيغة (1). تمثل أشرطة الخطأ SEM. (C) TRPL::eGFP - التعبير عن الذباب غير المتحور و vps35MH20 تم احتضان الذباب ذو العيون الفسيفسائية المتحولة في الظلام لمدة 3 أيام ، ومضاءة بالضوء البرتقالي لمدة 16 ساعة ، والتكيف مع الظلام لمدة 24 ساعة للمرة الثانية. تم التقاط صور لرابدوميرات الفلورسنت عن طريق الفحص المجهري للغمر المائي لتسجيل توطين TRPL::eGFP تحت الخلوي كما هو موضح في الخطوة 3.2.6. (د) التحديد الكمي للتألق الرابدومري للحيوانات غير الطافرة (الرمادية) و vps35MH20 (الحمراء) كما هو موضح في الخطوة 3.3.9 باستخدام الصيغة (1). تم حساب الدلالة الإحصائية كمقارنات متعددة مع تصحيح بونفيروني بعد ANOVA (ns، ليس كبيرا؛ *، p ≤ 0.05؛ ***، p ≤ 0.001). شريط المقياس: 10 ميكرومتر. وقد عدل الفريقان جيم ودال من المرجع10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
كما سبق ذكره في البروتوكول ، يؤثر تصبغ العين بشكل كبير على صورة الغمر المائي الناتجة. يسمح الذباب ذو العيون البيضاء بالكشف عن إشارات التألق من كل من الرابدومير وجسم الخلية ، مما يتيح تحديد دقيق إلى حد ما لنسبة توزيع TRPL::eGFP. في المقابل، في الذباب أحمر العينين TRPL::eGFP إشارة لا يمكن اكتشافها إلا في rhabdomeres ولكن ليس في أجسام الخلايا (الشكل 13A). ويرجع ذلك إلى جزيئات الصباغ التي تمتص الضوء المنبعث من TRPL::eGFP. ومع ذلك ، باستخدام الصيغة (2) للعيون المصطبغة ، يكشف القياس الكمي بشكل جيد عن سلوك نقل TRPL::eGFP في الذباب الأبيض وكذلك الأحمر العينين. وبناء على ذلك ، تنخفض القيم المقابلة لتألق الرابدومير من 100٪ في الحالة المظلمة المتكيفة إلى 25٪ و 5٪ بعد الإضاءة وتزداد مرة أخرى إلى 80٪ و 90٪ نتيجة لحضانة مظلمة ثانية (الشكل 13B).
الشكل 13: النتائج التمثيلية ل TRPL::eGFP التألق في الذباب الأبيض والأحمر العينين. (A) TRPL::eGFP - تم احتضان الذباب الأبيض والأحمر العينين في الظلام لمدة يوم واحد ، والإضاءة بالضوء البرتقالي لمدة 16 ساعة ، وتكييفها الداكنة لمدة 24 ساعة للمرة الثانية. تم التقاط صور للرابدوميرات الفلورية عن طريق الفحص المجهري لقطرات الماء غير المميتة لتسجيل توطين TRPL::eGFP تحت الخلوي كما هو موضح في الخطوتين 3.2.6 (الذباب الأبيض العينين) و 3.2.8 (الذباب ذو العيون الحمراء). (ب) التحديد الكمي للتألق الرابدوميرالي في الذباب الأبيض العينين (الرمادي) والأحمر العينين (الأحمر). تم قياس الذباب الأبيض العينين كميا باستخدام الصيغة (1) والذباب أحمر العينين ، باستخدام الصيغة (2) ، كما هو موضح في الخطوة 3.3.9. تمثل أشرطة الخطأ SEM. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض إصدار أكبر من هذا الشكل.
لتقييم انحطاط المستقبلات الضوئية ، يمكن تحديد مؤشر التنكس القائم على تألق TRP::eGFP في rhabdomeres (انظر البروتوكول). ويوضح الشكل 10 طريقة القياس الكمي هذه. في النتائج التمثيلية هنا ، تم الاحتفاظ بالذباب غير المتحور و sdhAttd11 المتحور ذو العيون الفسيفسائية في دورة مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة لمدة أسبوعين وتم التحقيق في سلامة rhabdomeres كل 2-4 أيام من خلال مراقبة TRP::eGFP باستخدام المجهر الغمر المائي (الشكل 14A). يظهر المنحنى الناتج انخفاضا في مؤشر الانحطاط في الذباب المتحور ولكن ليس في السيطرة (الشكل 14B).
الشكل 14: النتائج التمثيلية لتنكس الشبكية الناجم عن الضوء في الذباب المتحور sdhA . (A) TRP::eGFP-معبرا عن غير متحور و sdhAttd11 تم احتضان الذباب المتحور ذو العيون الفسيفسائية لمدة 14 يوما في دورة مظلمة مدتها 12 ساعة / 12 ساعة عند 25 درجة مئوية. تم التقاط صور للرابدوميرات الفلورية عن طريق الفحص المجهري للغمر بالماء على فترات زمنية منتظمة لتسجيل صحة الشبكية. (ب) التحديد الكمي للذباب الفلوري الرابدوميرال من النوع البري (الرمادي) والذباب المتحور sdhAttd11 (البرتقالي) كما هو موضح في الخطوة 3.4. تمثل أشرطة الخطأ SEM. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض إصدار أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد ثبت أن قابلية تطبيق البروتينات الفلورية وبساطة الفحص عن طريق تصوير DPP والفحص المجهري للغمر المائي في شبكية العين ناجحان من قبل العديد من المجموعات12. تم استخدام استراتيجيات مماثلة لتلك المعروضة هنا في العديد من الشاشات الجينية للكشف عن العيوب في مستويات التعبير عن رودوبسين ، أو التوازن ، أو تنظيم الشبكية ، أو السلامة الخلوية بمساعدة Rh1::eGFP 17,18,19,20,21. كما هو موضح أعلاه ، يمكن استخدام نقل بروتينات الاندماج مثل TRPL::eGFP للكشف عما إذا كانت عمليات تهريب البروتين من وإلى rhabdomere ضعيفة ، على سبيل المثال ، في شاشات الطفرات. من ناحية أخرى ، يمكن استخدام بروتينات الانصهار الرابدوميرال الدائمة مثل TRP::eGFP للتحقيق في مورفولوجيا الرابدومير. يعتبر DPP والفحص المجهري للغمر المائي طرقا ممتازة للتحليلات والشاشات عالية الإنتاجية داخل نموذج عين ذبابة الفاكهة. ومع ذلك ، يوصى بإجراء تحليلات نسيجية كيميائية (مناعية) في نهاية المطاف لأوماتيديا المعزولة أو أنسجة الشبكية المجزأة بالتبريد لتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها بواسطة DPP أو الفحص المجهري للغمر بالماء. مقترنة بالمجهر الفلوري عالي الدقة ، تسمح هذه التقنيات بالتفسيرات نحو توطين دقيق تحت الخلوية. في ما يلي ، يتم تقديم بعض الإرشادات حول كيفية استكشاف أخطاء عمليات التصوير الخاصة ب DPP والفحص المجهري للغمر المائي في شبكية العين وإصلاحها والتي تعتبر مهمة بشكل خاص للتحليلات الكمية الصحيحة.
فيما يتعلق ب DPP ، إذا كان تراكب التألق ضبابيا أو غير واضح ، فقد لا تكون الإعدادات صحيحة. أحد الاحتمالات هو أن العين لا تواجه الهدف بدقة شعاعيا أو أن التركيز يتم ضبطه على المناطق الطرفية للعين. نظرا لأن التخطيط الوهمي لخلايا المستقبلات الضوئية يعرض تناظر المرآة عند خط الوسط الظهري البطني ، يمكن رؤية نمط غير عادي في DPP ، إذا تم اكتشاف الإشارات من نصفي الكرة الأرضية للعين. تعتمد جودة DPP أيضا بشكل كبير على عمق المجال الضحل لتوليد مقطع بصري من خلال العين المركبة. إذا كان سطح لوحة الذبابة يعرض التألق الذاتي ، فقد يتم وضع الذبابة على قطعة صغيرة من الورق المقوى الأسود غير الفلوري أعلى لوحة الذبابة. قد يكون عدم القدرة على تسجيل DPP مرتبطا بمجموعة متنوعة من الأسباب الكامنة ، بما في ذلك تحديد موقع الذبابة دون المستوى الأمثل ، أو انخفاض مستويات التعبير عن البروتين الفلوري ، أو بنية شبكية العين غير المنظمة ، أو العمليات التنكسية. عند تصوير DPP ، تجدر الإشارة أيضا إلى أن التألق السيتوبلازمي في الذباب الأبيض العينين قد ينشر حدود الإشارة من rhabdomeres ، وقد تختلف مستويات التعبير عن البروتين بشكل كبير بين الأفراد وتؤثر على جودة DPP الناتج. وبالتالي ، في حالة تصوير DPP الفلورسنت ، من المفيد استخدام الذباب بعيون مصطبغة. بسبب امتصاص إشارات التألق من أجسام الخلايا ، قد يبدو DPP الناتج أكثر حدة من الذباب الأبيض العينين.
لتجنب الصور الضبابية في مجهر الغمر بالماء ، يجب إجراء الحصول على الصور بسرعة بعد إعداد الذبابة لمنع الاستيقاظ وحركات الذبابة. بالنسبة للصور عالية الجودة ، يجب أن تصل إشارات التألق الأكثر سطوعا من العين إلى التشبع تقريبا في جميع الصور إذا كنت تستخدم الذباب الأبيض العينين. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق ضبط وقت التعرض أثناء التصوير. نظرا لأن التصبغ يعيق الكشف عن تألق eGFP الخلوي ، فإن النهج الموصوف للذباب الأبيض العينين لضبط وقت التعرض سيؤدي دائما إلى إشارات تألق رحاب قوية في العيون المصطبغة ، مما يشوه التفسير اللاحق وتحديد الكمية. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام عيون مصطبغة ، قد يؤدي التبييض الضوئي بسبب التعرض القوي للضوء الأزرق إلى إشارات أضعف وبالتالي سوء تفسير البيانات. اعتمادا على السياق (أي القاتل أو غير الفتاك) ، يتم تقديم إجراءين بديلين في بروتوكول العيون المصطبغة. بشكل عام ، يفضل التباين غير المميت مع العيون المصطبغة ، حيث يمكن قياس نفس الذبابة بشكل متكرر ، ويؤدي تقييم وقت التعرض المحدد لكل ذبابة فردية إلى تحديد كميات أكثر دقة وقابلية تكرار أعلى من تحديد متوسط وقت التعرض الناتج عن العينة. ومع ذلك ، فإن الاختلاف غير المميت يتطلب أيضا مزيدا من العناية في التعامل مع الحيوانات لضمان بقائها على قيد الحياة أثناء القياسات المتكررة. يمكن تحقيق ذلك باستخدام الهواء منخفض الضغط فقط لنقل الذباب إلى طرف الماصة واستخدام الملقط بعناية لتحرير الذبابة من طرف الماصة بعد التصوير. نظرا لأن الذباب لا يتم غمره في الماء المبرد بالجليد أثناء الإجراء ، فهناك خطر متزايد من الاستيقاظ مرة أخرى. نتيجة للقياسات المتكررة من العينات الفردية ، فإن سلسلة القياسات بأكملها صالحة فقط إذا بقيت الذبابة دون أذى من البداية إلى النهاية. ونتيجة لذلك ، فإن التباين غير المميت كثيف العمالة ويستغرق وقتا طويلا. من ناحية أخرى ، يسمح الاختلاف القاتل بإنتاجية أعلى حيث يمكن تثبيت ذباب متعدد على التوالي على نفس دبوس الحشرة وتسجيله بالتتابع في جولة واحدة لالتقاط الصور. ومع ذلك ، فإن الذباب المتعدد على نفس الدبوس يتطلب أيضا تصويرا أسرع لتجنب الاستيقاظ والحركات. من الواضح أن العيب الأخير للتباين القاتل هو عدم القدرة على استعادة الحيوانات بعد التصوير للتطبيقات اللاحقة (على سبيل المثال ، الصلبان ، القياسات المتكررة).
وفيما يتعلق بالتحديد الكمي لعملية النقل، يقدم هذا البروتوكول الصيغة (1)، التي تنظر في إشارات التألق من الرابدومير وكذلك من جسم الخلية، وبالتالي تولد تقديرا جيدا جدا للتوزيع النسبي للبروتين المنقول داخل الخلية (الشكل 12D). نظرا لعدم وجود قياسات التألق من جسم الخلية في حالة العيون المصطبغة ، يتم تقديم الصيغة (2) ، والتي تعمل بشكل جيد لهذه المشكلة التي تواجهها بشكل متكرر (الشكل 13B). بصرف النظر عن تصبغ العين ، هناك ظروف أخرى تمنع التحديد الكمي بأي من هذه الصيغ. يتم عرض إحدى هذه الحالات في الشكل 12A ، B في شكل متحور lolattd12. في هذا المتحور ، على وجه التحديد ، يؤثر غياب خلية المستقبلات الضوئية R7 بشكل كبير على مورفولوجيا ommatidial وبالتالي القدرة على الحصول على قياسات كثافة معقولة من التألق الخلفية من هذه المنطقة. إذا تم استخدام نفس طريقة تحديد الموقع الكمي على الرغم من هذه المشكلات ، فإن النتائج تظهر كميات كبيرة من التباين ، ويصعب مقارنتها بالضوابط ، وقد يساء تفسيرها. وهكذا يوضح مثال متحور lolattd12 حدود طريقة القياس الكمي هذه التي تعتمد حتما على مورفولوجيا تشبه "النوع البري" لقياس الكثافة الصحيحة. وفي حالات نادرة يتعين فيها تحديد عيوب نقل البروتين كميا في أوماتيديا المعيبة مورفولوجيا، يفشل البروتوكول المعروض هنا ويجب تكييفه وفقا لذلك. ويشمل ذلك إدخال تغييرات مناسبة على الصيغة من أجل استبعاد القياسات التي لا يمكن الحصول عليها بشكل معقول أو لإدراج قياسات إضافية للمناطق التمثيلية الأخرى.
في حالة التحديد الكمي للعمليات التنكسية ، تبين أن عتبات كثافة التألق ليست مؤشرا جيدا ، نظرا لوجود الكثير من التباين داخل وبين الرابدوميرات. يتم حساب متوسط هذا التباين على جميع الرابدوميرات المقاسة البالغ عددها 18 في طريقة تحديد حجم النقل. ومع ذلك ، نظرا للتقييم الفردي لكل رابدومير في تقييم التنكس ، لا يمكن حساب متوسط التباين في شدة التألق. علاوة على ذلك ، فإن الكثافة ليست سوى واحدة من الخصائص التي يجب مراعاتها. الجوانب الهامة الأخرى هي التباين وحدة الحواف. وبالتالي ، يقدم هذا البروتوكول طريقة قياس كمي تعتمد على تصنيف مورفولوجيا الرابدوميرات وفقا لتألقها بالعين. هذا هو بالضرورة ذاتي إلى حد ما. ومع ذلك، ونظرا للخبرة الكافية، أثبت هذا البروتوكول أنه طريقة مفيدة وسريعة وقابلة للتكرار لتحديد كمية الانحطاط (الشكل 14) وتم نشره عدة مرات22,10. كما هو الحال مع جميع التقييمات الذاتية ، من المستحسن دائما إجراؤها في سياق أعمى. عادة ما تستخدم بروتوكولات المجموعات الأخرى فئتين فقط لتحديد كمية تنكس الشبكية في ذبابة الفاكهة (وجود أو عدم وجود rhabdomeres) ، والتي قد تكون أقل ذاتية ، ولكنها أيضا أقل دقة. وبالإضافة إلى ذلك، لا تزال طريقة القياس الكمي هذه تنطوي على مسألة تحديد نقطة فاصلة بين الفئتين، والتي قد يكون من الصعب بنفس القدر تحديدها بموضوعية.
فيما يتعلق بالتعديلات والتطبيقات المتقدمة للطرق المعروضة هنا ، من الممكن أيضا تقييم الكمية النسبية لبروتينين اندماجيين فلوريين في وقت واحد عن طريق التصوير المزدوج اللون. على سبيل المثال ، باستخدام TRPL::HcRed و TRP::eGFP ، تم تقييم نقل TRPL::HcRed في الاعتبار سلامة rhabdomeral في نفس الذبابة23. يستخدم التصوير الملون المزدوج أيضا في طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT ، على سبيل المثال ، لتحديد العوامل التي تحفز موت الخلايا المبرمج24. هذا الاختلاف يجعل من الممكن تصور انحطاط خلايا المستقبلات الضوئية عبر ninaC::eGFP في استنساخ الخلايا المسمى بالفلورسنت الذي يتميز ب ninaC::tdTomato. تطبيق آخر للفحص المجهري للغمر المائي هو مراقبة دوران الفوسفوينوسيتيد في المستقبلات الضوئية. لهذا الغرض ، يتم استخدام مجالات ربط الفوسفوينوسيتيد الموسومة بالفلورسنت مثل مجال تماثل pleckstrin (PH) من PLCδ1. تسمح مجسات التألق هذه بتتبع تدهور الفوسفوينوسيتيد بمرور الوقت عن طريق الكشف عن انخفاض التألق الرابدوميرالي الناجم عن انتشار المسبار من الرابدومير إلى السيتوسول25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر طلابنا الباحثين على مر السنين. على وجه الخصوص ، نينا ماير ، سيبيل ماير ، جوليان كايم ، ولورا جاجي ، الذين تم استخدام بياناتهم في هذا البروتوكول كنتائج تمثيلية. تم تمويل أبحاث مجموعتنا المعروضة هنا من خلال منح من Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4 ، Hu 839/7-1) إلى Armin Huber.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| CO2 anaesthesia fly pad | Flystuff | 59-172 | |
| Cold light lamp (KL 1500 LCD) | Zeiss | ||
| Fiji/ImageJ | NIH | ||
| Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition) | Zeiss | ||
| Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2] and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2] |
Osram | 4050300518039 | |
| Laboratory pipette (20-200 µL) | Eppendorf | ||
| Object slide | Roth | 0656.1 | |
| Petri dish (94 mm) | Greiner Bio-One | 633102 | |
| Pipette tips (200 µL) | Labsolute | 7695844 | |
| Plasticine (Blu-Tack) | Bostik | 30811745 | |
| Stereo microscope (SMZ445) | Nikon | ||
| Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12) | Leica |
References
- Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H.
- Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
- Hardie, R. C. The photoreceptor array of the dipteran retina. Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).
- Wang, T., Montell, C. Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).
- Xiong, B., Bellen, H. J. Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly. Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).
- Bähner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
- Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).
- Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade. Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).
- Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin. European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).
- Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum. Traffic. , (2021).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila. Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).
- Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128 (6), 815-826 (2001).
- Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).
- Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2005).
- Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL. Fly. 2 (1), 36-46 (2008).
- Zheng, L., Carthew, R. W. Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye. Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).
- Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).
- Huang, Y., Xie, J., Wang, T. A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila. PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).
- Zhao, H., Wang, J., Wang, T. The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).
- Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
- Zhao, H., Wang, T. PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila. PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).
- Cerny, A. C., et al. The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells. PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).
- Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2007).
- Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).
- Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
- Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).
