Summary
El protocolo de indentación de microscopía de fuerza atómica ofrece la posibilidad de diseccionar el papel de las propiedades físicas de la pared celular de una célula particular de un tejido u órgano durante el crecimiento normal o restringido (es decir, bajo déficit de agua).
Abstract
Aquí se describe un método para caracterizar las propiedades físicas de la pared celular de las células epidérmicas de raíces vivas de Arabidopsis a través de nanoindentaciones con un microscopio de fuerza atómica (AFM) junto con un microscopio óptico de fluorescencia invertida. El método consiste en aplicar fuerzas controladas a la muestra mientras se mide su deformación, permitiendo cuantificar parámetros como el aparente módulo de Young de las paredes celulares a resoluciones subcelulares. Requiere una cuidadosa inmovilización mecánica de la muestra y una correcta selección de penetradores y profundidades de hendidura. Aunque solo se puede usar en tejidos externos, este método permite caracterizar los cambios mecánicos en las paredes celulares de las plantas durante el desarrollo y permite la correlación de estos cambios microscópicos con el crecimiento de un órgano completo.
Introduction
Las células vegetales están rodeadas por una pared celular que es una estructura compleja compuesta de redes interactivas de polisacáridos, proteínas, metabolitos y agua que varía en grosor de 0,1 a varios μm dependiendo del tipo de célula y la fase de crecimiento 1,2. Las propiedades mecánicas de la pared celular juegan un papel esencial en el crecimiento de las plantas. Los bajos valores de rigidez de la pared celular se han propuesto como una condición previa para el crecimiento celular y la expansión de la pared celular, y cada vez hay más pruebas de que todas las células detectan fuerzas mecánicas para realizar sus funciones. Sin embargo, todavía se debate si los cambios en las propiedades físicas de la pared celular determinan el destino celular 2,3,4. Debido a que las células vegetales no se mueven durante el desarrollo, la forma final de un órgano depende de qué tan lejos y en qué dirección se expande una célula. Por lo tanto, la raíz de Arabidopsis es un buen modelo para estudiar el impacto de las propiedades físicas de la pared celular en la expansión celular porque se producen diferentes tipos de expansión en diferentes regiones de la raíz. Por ejemplo, la expansión anisotrópica es evidente en la zona de elongación y particularmente notable en las células epidérmicas5.
El método descrito aquí se utilizó para caracterizar las propiedades físicas de la pared celular de las células epidérmicas a nanoescala de raíces vivas de Arabidopsis utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM) junto con un microscopio de fase de fluorescencia invertida6. Para una revisión extensa de la técnica AFM, lea 7,8,9.
Este protocolo describe un método básico de preparación de muestras y un método general para mediciones de elasticidad basadas en AFM de paredes celulares vegetales.
Figura 1: Resumen esquemático del experimento de indentación de fuerza en raíces de Arabidopsis utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). El esquema ofrece una visión general de los pasos de un experimento de Fuerza-Indentación desde la preparación del sustrato para inmovilizar firmemente la muestra de raíz (1-2), la confirmación de la viabilidad de la raíz a través de la tinción de yoduro de propidio (3), el posicionamiento en voladizo en la superficie de una célula epidérmica alargada de la raíz primaria (4-5), la medición de curvas de fuerza (6) y el procesamiento de la curva de fuerza para calcular el módulo de Young aparente (7-8). EZ: zona de elongación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
1. Preparación del material vegetal y condiciones de crecimiento
- Para generar el material vegetal necesario, esterilice las semillas de tipo salvaje Arabidopsis y líneas mutantes de interés.
NOTA: En este protocolo, utilizamos lo siguiente: ttl1: líneas de inserción de ADN-T Salk_063943 (para TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) tipo salvaje; el mutante Procuste1 (prc1-1), que consiste en una mutación knock-out (Q720stop) en el gen CESA6 (AT5G64740), como se describió previamente en10,11; y TTL1 x PRC1-1 doble mutante.- Poner un volumen aproximado de 50 μL de semillas en un microtubo. Añadir 500 μL de etanol al 70% + solución de Tween al 0,01% a temperatura ambiente. Mezclar e incubar durante 7 min.
- Vierta la solución de etanol y agregue 500 μL de hipoclorito de sodio al 20%. Mezclar e incubar durante 7 min.
- Vierta la solución de hipoclorito de sodio y lave las semillas de tres a cuatro veces con agua estéril.
- Enchapado
- Preparar de antemano el medio basal Murashige y Skoog (MS)12 + 1,5% sacarosa + 1% agar (pH 5,7) (ver Tabla de materiales). Autoclave el medio. Prepare una campana de flujo laminar para trabajar en un ambiente estéril y etiquete las placas de Petri cuadradas necesarias para el experimento. Vierta el medio en las placas de Petri y permita que el medio se solidifique.
- Emplatar las semillas esterilizadas con puntas de pipeta estériles sobre placas de Petri cuadradas que contengan el medio. Distribuye las semillas uniformemente en dos filas. Cuando las semillas estén secas, cierre las tapas y selle los platos. Estratificar las semillas a 4 °C en la oscuridad durante 4 días.
NOTA: La estratificación es necesaria para sincronizar la germinación. - Colocar las placas verticalmente en la cámara de crecimiento en régimen de día largo (16 h de luz/8 h de oscuridad) con 25 μmol m2 s−1 de intensidad de luz y 23 °C (día/noche). Cultiva las plántulas durante 7 días.
2. Tratamiento del estrés osmótico (opcional)
NOTA: Esta sección proporciona detalles sobre el crecimiento de las raíces de Arabidopsis en el potencial osmótico de -1.2 MPa según lo estimado por el osmómetro crioscópico (Tabla de materiales). Esta parte puede ser omitida o cambiada dependiendo de la pregunta experimental en cuestión.
- Preparar MS basal medio + 1,5% sacarosa + 400 mM manitol + 1% agar (pH 5,7). Autoclave el medio. Vierta el medio en placas de Petri cuadradas en la campana de flujo laminar y permita que el medio se solidifique.
- Con pinzas (Tabla de materiales), coloque las plántulas de 5 días de edad precultivadas en MS basal + 1.5% de medio de sacarosa en placas de Petri cuadradas que contengan el medio complementado con manitol de 400 mM. Colocar las placas verticalmente en la cámara de crecimiento en las mismas condiciones que en el paso 1.2.3. Cultive las plántulas bajo esta condición de estrés osmótico durante 7 días.
NOTA: Para evaluar la adaptación al crecimiento radicular de la raíz primaria durante el estrés osmótico severo, se sugiere utilizar plántulas 5 días después de la germinación cultivadas en condiciones controladas para asegurar que el tamaño del meristemo de la raíz ya esté establecido13. Alternativamente, el análisis se puede realizar en cada etapa del desarrollo para determinar el efecto en el desarrollo de la acción del estrés osmótico.
3. Experimentos de nanoindentación de microscopía de fuerza atómica (AFM)
- Preparación de la muestra para experimentos de nanoindentación
NOTA: Este es un paso crucial para aplicar AFM al estudio de muestras biológicas vivas. La muestra debe estar firmemente unida al sustrato para que sea mecánicamente estable durante las mediciones de indentación. Al mismo tiempo, deben preservarse las cualidades estructurales de la muestra. Una estrategia efectiva para estabilizar una muestra grande para AFM es usar adhesivos. El adhesivo debe secarse rápidamente y no debe ser tóxico ni reactivo con el medio circundante. En este protocolo, se utilizaron placas de Petri de poliestireno como sustrato y se utilizó pegamento de silicona no ácida (Tabla de materiales) para unir las plántulas de Arabidopsis.- Extienda una capa delgada de pegamento de silicona en la placa de Petri con un cubreobjetos. Dejar el pegamento en el aire durante 45 s.
- Con pinzas, coloque la plántula sobre el pegamento, orientándola en una dirección que evite el contacto entre las partes sobresalientes de la plántula y el voladizo. Luego, presione la raíz suavemente contra la capa de pegamento de silicona para unirla firmemente. Deje la plántula en contacto con el pegamento durante 45 s antes de continuar con los siguientes pasos del protocolo.
- Incubar las plántulas adheridas con 2 μg/ml de yoduro de propidio (PI; Tabla de materiales) durante 5 minutos en la oscuridad y lavarlos cuidadosamente tres veces con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Tabla de materiales).
- Coloque las plántulas incubadas con PI en un microscopio de fluorescencia invertido junto con el AFM. Para observar la fluorescencia, establezca las longitudes de onda de excitación y emisión en 572 nm y 617 nm, respectivamente. La ausencia de fluorescencia dentro de las células epidérmicas confirma la viabilidad de las raíces.
- Cubra la plántula con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Protocolo de sangría
NOTA: Realice todas las mediciones de AFM dentro de 1 h después de la inmovilización de la muestra en su soporte a temperatura ambiente. La habitación donde se encuentra el AFM debe mantenerse a 25 °C con aire acondicionado. La solución de PBS debe estar a la misma temperatura.- Monte un voladizo de nitruro de silicio estándar con una punta piramidal (consulte Tabla de materiales) en el soporte de la sonda AFM para fluido (Tabla de materiales).
- Alinee el láser en el voladizo cerca de la posición de la punta. A continuación, mueva el fotodiodo para colocar el punto láser en el centro del detector.
- Para calibrar la sensibilidad a la deflexión, coloque una placa de Petri de poliestireno con 1x PBS debajo del AFM.
NOTA: Este paso es necesario para calcular la sangría. Cuando se realiza una medición de fuerza en una superficie dura, no hay hendidura en la superficie, por lo que cualquier cambio en el desplazamiento del escáner z corresponde a la deflexión en voladizo. Por lo tanto, es muy importante calibrar la sensibilidad a la deflexión en una superficie dura. El uso de una superficie blanda sobrestimará la sensibilidad a la deflexión, lo que dará como resultado constantes de resorte que son demasiado bajas. - Ajuste el fotodetector de modo que la deflexión sin contacto esté cerca de 0 V. Calibre la sensibilidad a la deflexión realizando una hendidura (curva de fuerza), con un tamaño de rampa de 3 μm, una tasa de indentación y retracción de 0,6 μm/s y un umbral de activación de 0,5 V.
- Para calibrar la constante de resorte del voladizo, utilice la utilidad Thermal Tune del software AFM (Tabla de materiales) recomendada para sondas con constantes de resorte inferiores a aproximadamente 5 N/m o utilice el método descrito en la referencia14. Antes de activar Thermal Tune en el software, asegúrese de que la sonda no interactúe con la muestra.
- Introduzca la temperatura del voladizo. Haga clic en Calibrar > Thermal Tune o en el icono Thermal Tune en la barra de herramientas de NanoScope . Seleccione un rango de frecuencia (1-100 Hz).
- Haga clic en Adquirir datos en el panel Thermal Tun. Espere a que el AFM adquiera datos y luego haga clic en el botón Oscilador armónico simple (fluido ).
- Ajuste el ancho del filtro mediano a 3. Ajuste el ancho de la bandeja PSD para reducir el ruido en los datos adquiridos mediante el promedio. Establezca límites de ajuste alrededor del primer pico de resonancia.
- Haga clic en Calcular constante de resorte k y, a continuación, haga clic en Sí en la ventana emergente que le pregunta si el usuario desea utilizar este valor.
- Repita los pasos descritos anteriormente tres veces y tome manualmente un promedio de los valores constantes de resorte. Introduzca este valor medio en el cuadro Constante de resorte de la lista de parámetros de rampa de la vista PicoForce . La calibración finaliza en este punto.
- Usando el microscopio óptico invertido con un aumento de 10x, 20x y 40x, coloque la sonda AFM en la superficie de la cuarta célula epidérmica alargada de la raíz primaria, asegurándose de colocarla en el centro de la célula.
- Con el valor constante de resorte calculado (paso 3.2.5.5), obtenga curvas de fuerza con un tamaño de rampa de 3 μm, un umbral de activación de 11 nN y una tasa de indentación y retracción de 0.6 μm/s en puntos seleccionados.
NOTA: El trabajo anterior15,16 encontró que la baja frecuencia de indentación y retracción ayuda a minimizar la histéresis y la fuerza de arrastre. - Obtenga curvas de fuerza de tres células por raíz para cada tratamiento (use tres réplicas biológicas por tratamiento). Captura al menos 150 curvas de fuerza para cada raíz.
4. Medir el módulo aparente de Young
- Ajuste cada curva de fuerza al siguiente modelo para penetradores piramidales17:
, donde E es el módulo de Young aparente de la muestra, 
es el módulo de Poisson de la muestra y α es el semiángulo al vértice. Descartar los ajustes con un coeficiente de correlación (r2) < 0,99. Considere la relación de Poisson para material totalmente incompresible: = 0.5 y la geometría del penetrador dada por los fabricantes.
NOTA: Utilice los primeros 100 nm desde el punto de contacto de la curva de carga para que el accesorio sea lo más sensible posible a la mecánica de la pared celular y para reducir el impacto de la presión de turgencia en los valores aparentes del módulo de Young8. El ajuste se ha realizado utilizando un programa personalizado de MATLAB (disponible a petición personal escribiendo a J. C. B) que permite establecer una profundidad de hendidura específica desde el punto de contacto de la curva de carga. - Cree un histograma normalizado con los datos del módulo de Young aparente y ajústelo con una distribución gaussiana. Descarte los puntos de datos fuera del intervalo de confianza del 95% y vuelva a calcular tanto el histograma como el ajuste gaussiano. Calcular y reportar la media y la desviación estándar del módulo de Young aparente.
- Determinar la importancia de las comparaciones entre grupos mediante múltiples pruebas de comparación como ANOVA.
, donde E es el módulo de Young aparente de la muestra, 
es el módulo de Poisson de la muestra y α es el semiángulo al vértice. Descartar los ajustes con un coeficiente de correlación (r2) < 0,99. Considere la relación de Poisson para material totalmente incompresible: Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Experimentos de forzamiento-sangría
El siguiente texto presenta algunos resultados esperados cuando se realiza un experimento de sangría forzada para mostrar la salida típica que se espera cuando el protocolo está bien ejecutado.
Curvas fuerza-desplazamiento
En la Figura 2 se presentan gráficas representativas de indentación de fuerza que se obtuvieron sangrando de muestras vivas en una posición colocada en el centro de la celda de la zona de elongación radicular. Cuando la punta AFM comienza a indentar la superficie de la pared celular, la fuerza comienza a aumentar (indicada por 1 en la Figura 2A) debido a la oposición de la pared celular a la deformación. El aumento de la fuerza (carga) continúa hasta que se alcanza el valor máximo de fuerza (indicado por 2 en la Figura 2A); Después de este punto, comienza la parte de descarga de la sangría.
Figura 2: Curvas de fuerza-desplazamiento obtenidas en experimentos de indentación realizados en paredes celulares de células vivas de la zona de elongación de la raíz . (A) Una curva típica de fuerza-desplazamiento. En la posición marcada por 1, la fuerza comienza a aumentar; la punta AFM comienza a sangrar la pared celular. El aumento de fuerza (carga) continúa hasta que se alcanza el valor máximo de fuerza, como se indica con 2; Después de este punto, comienza la parte de descarga de la sangría. (B) Ejemplo de una curva de fuerza-desplazamiento en la que es imposible detectar la posición de la superficie de la celda antes de la hendidura (indicada por a), y tanto las curvas de carga como las de descarga son ruidosas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las curvas de fuerza-desplazamiento esperadas mostrarán en la parte de indentación que la fuerza crece después de una parábola, como predice el modelo (explicado en el paso 4.1) (Figura 2A). Otro parámetro de ajuste es la posición del punto de contacto; debe corresponder a la superficie de la pared celular antes de la hendidura y se considera el origen del desplazamiento de la punta AFM. Las curvas de fuerza en las que es imposible detectar el punto de contacto antes de la hendidura deben descartarse (Figura 2B). La curva de carga y descarga del experimento de indentación de fuerza deberá carecer de ruido. Las curvas ruidosas como la representada en la Figura 2B deben descartarse.
Histograma normalizado del módulo de Young aparente
Los histogramas que muestran la distribución de la frecuencia de los valores obtenidos del módulo de Young aparente para un conjunto de 201 hendiduras exitosas en nueve celdas diferentes de tres plantas diferentes de Col-0 cultivadas en condiciones de control se presentan en la Figura 3. La figura muestra un ejemplo en el que la media y la desviación estándar del módulo de Young aparente (88,12 ± 2,79 KPa) se calcularon a partir de los histogramas equipados con una curva gaussiana6.
Figura 3: Ejemplo de un histograma de módulo de Young aparente que permitió un análisis estadístico adecuado de los resultados. Los datos se obtuvieron de curvas de fuerza en nueve células diferentes de tres plantas diferentes de Col-0 cultivadas en condiciones de control. Los datos obtenidos de 201 curvas de fuerza se ajustaron a una distribución gaussiana. La frecuencia relativa indica el número de curvas de fuerza ajustadas que corresponden a cada módulo de Young aparente calculado. Los valores de media y desviación estándar de esta condición se obtuvieron de los ajustes gaussianos. RF: Frecuencia relativa; AEM: módulo de Young aparente. Esta figura fue modificada de la referencia6Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Algunos genotipos podrían ser muy difíciles de sangrar debido a la morfología de la raíz. Este fue el caso del mutante prc1-1 y el mutante doble ttl1 prc1-1 cultivados en estrés osmótico severo. En esta condición, estos mutantes tenían pocas células alargadas en la zona de elongación de la raíz y desarrollaron pelos radiculares muy largos, que interfieren con el voladizo que produce el movimiento de la muestra. La Figura 4 presenta histogramas que muestran la distribución de probabilidad de los valores obtenidos del módulo de Young aparente en nueve celdas diferentes del mutante doble ttl1 prc1-1. La figura muestra un ejemplo en el que las curvas de fuerza obtenidas no permitieron el análisis adecuado. Sólo el histograma H que corresponde a una celda podría ajustarse a una distribución gaussiana6.
Figura 4: Ejemplo de histogramas de módulo de Young aparente que no permitieron un análisis adecuado. Los datos se obtuvieron de curvas de fuerza en nueve celdas diferentes de tres plantas diferentes del mutante doble ttl1prc1-1 . La frecuencia relativa indica el número de curvas de fuerza ajustadas que corresponden a cada módulo de Young aparente calculado. Sólo el histograma H podía ajustarse a una distribución gaussiana. RF: Frecuencia relativa; AEM: el módulo aparente de Young. Esta cifra fue modificada de la referencia6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La mecánica celular y de pared celular se está volviendo cada vez más relevante para obtener información sobre cómo la mecánica afecta los procesos de crecimiento. A medida que las fuerzas físicas se propagan a distancias considerables en los tejidos sólidos, el estudio de los cambios en las propiedades físicas de la pared celular y cómo se detectan, controlan, sintonizan e impactan el crecimiento de la planta se están convirtiendo en un importante campo de estudio 2,3,8.
Aquí se presenta un método para estudiar las propiedades físicas de la pared celular de las células en la zona de elongación de la raíz de Arabidopsis. La técnica AFM se puede combinar fácilmente con otras técnicas, como los estudios de tasa de crecimiento, para comprender el efecto de las propiedades físicas de la pared celular en el crecimiento de la raíz.
Uno de los pasos experimentales más críticos es la inmovilización mecánica de la muestra; La muestra debe estar firmemente unida para evitar el movimiento de la muestra mientras está sangrada. La capa del pegamento de silicona debe ser lo suficientemente delgada como para permitir que se seque rápidamente. La manipulación del pegamento de silicona y la muestra debe tener cuidado para asegurarse de que la silicona no cubra las áreas de la muestra que se medirán. Además, la preparación debe completarse rápidamente (en un minuto) para mantener las propiedades adhesivas del pegamento de silicona y evitar la deshidratación de las raíces. Es crucial prevenir el daño tisular; La deshidratación y el daño del tejido epidérmico producirán cambios irreversibles en las propiedades mecánicas de la pared celular. Otros métodos utilizaron la inmovilización en agarosa al 1% en un portaobjetos de vidrio; sin embargo, este método también tiene el desafío de necesitar una manipulación rápida y un paso adicional de preparación de los portaobjetos de vidrio para evitar que las muestras se muevan en los ejes X e Y durante el análisis. Para más información, véanse las referencias 8,18. Otro punto relevante de este protocolo es contar con un microscopio óptico con epifluorescencia acoplado al AFM que tiene diferentes objetivos (10x, 20x y 40x). Esto permite seleccionar el área de sangría con precisión.
Un aspecto desafiante del protocolo es la selección de la configuración de sangrías AFM. Diferentes penetradores y profundidades de sangría producen diferentes resoluciones y se pueden utilizar para responder a diferentes preguntas de investigación8. Varios estudios han demostrado que el tamaño y la geometría de la punta son consideraciones importantes para discernir los resultados deseados. Se obtiene información diferente con diferentes formas de punta7. Por ejemplo, la punta cónica puede discriminar propiedades mecánicas a nivel subcelular, la punta esférica puede representar mejor las propiedades mecánicas de toda la célula19, y las puntas piramidales permiten obtener imágenes de alta resolución y propiedades mecánicas al mismo tiempo 7,20. La selección del radio de la punta piramidal (20-60 nm) es importante para evitar que la punta se hunda, permitiendo un proceso de indentación adecuado. Para cada aplicación, el investigador debe elegir el tipo de voladizo (y punta) más adecuado para la muestra y el tipo de mediciones a realizar8.
El método tiene algunas limitaciones: solo se pueden medir las propiedades mecánicas de las células en la superficie de los órganos, y es difícil trabajar con tejidos con topografías variables. Por ejemplo, los pelos radiculares podrían dificultar el acceso a las células epidérmicas con la punta AFM 8,18. Finalmente, mientras que el método presentado mide la elasticidad, la nanoindentación también ha sido utilizada para reportar la viscosidad y la presión de turgencia en plantas y animales 8,18.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses. El script de MATLAB utilizado para ajustar los datos está disponible a petición personal escribiendo a J. C. B.
Acknowledgments
Esta investigación ha sido financiada por el CSIC I+D 2018, beca nº 95 (Mariana Sotelo Silveira); CSIC Grupos (Omar Borsani) y PEDECIBA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
| AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
| Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
| Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
| Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
| Tweezers | Sigma | T4537 |
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