Kvantitativ analyse af viskoelastiske egenskaber af røde blodlegemer ved hjælp af optisk pincet og defokuseringsmikroskopi

Summary

Her beskrives en integreret protokol baseret på optisk pincet og defokuseringsmikroskopi for at måle cellernes rheologiske egenskaber. Denne protokol har bred anvendelighed til at studere erytrocyternes viskoelastiske egenskaber under variable fysiopatologiske tilstande.

Abstract

De viskoelastiske egenskaber af erytrocytter er blevet undersøgt ved en række teknikker. De rapporterede eksperimentelle data varierer imidlertid. Dette tilskrives ikke kun cellernes normale variabilitet, men også forskellene i metoder og modeller af cellerespons. Her anvendes en integreret protokol ved hjælp af optisk pincet og defokuseringsmikroskopi til at opnå de rheologiske egenskaber ved røde blodlegemer i frekvensområdet 1 Hz til 35 Hz. Mens optisk pincet bruges til at måle den erytrocyt-komplekse elastiske konstant, er defokuseringsmikroskopi i stand til at opnå cellehøjdeprofilen, volumenet og dens formfaktor en parameter, der tillader omdannelse af kompleks elastisk konstant til komplekst forskydningsmodul. Desuden kan man ved anvendelse af en blød glasagtig reologimodel opnå skaleringseksponenten for begge moduli. Den udviklede metode gør det muligt at udforske den mekaniske opførsel af røde blodlegemer, der karakteriserer deres viskoelastiske parametre, opnået under veldefinerede eksperimentelle betingelser for flere fysiologiske og patologiske tilstande.

Introduction

Modne røde blodlegemer (RBC'er), også kendt som erythrocytter, er i stand til at strække sig mere end dobbelt så meget, når de passerer gennem de smaleste kapillærer i menneskekroppen¹. En sådan kapacitet tilskrives deres unikke evne til at deformere, når de udsættes for eksterne belastninger.

I de senere år har forskellige undersøgelser karakteriseret denne funktion i RBC-overflader ^2,3. Det område af fysikken, der beskriver de elastiske og viskøse reaktioner af materialer på grund af ydre belastninger, kaldes reologi. Generelt, når en ekstern kraft påføres, afhænger den resulterende deformation af materialets egenskaber og kan opdeles i elastiske deformationer, der lagrer energi eller viskøse deformationer, der spreder energi⁴. Alle celler, herunder RBC'er, udviser en viskoelastisk adfærd; Med andre ord er energi både lagret og spredt. Den viskoelastiske respons af en celle kan således karakteriseres ved dens komplekse forskydningsmodul G * (ω) = G'(ω) + iG"(ω), hvor G '(ω) er lagringsmodulet, relateret til den elastiske opførsel, og G" (ω) er tabsmodulet, relateret til dets viskositet⁴. Desuden er fænomenologiske modeller blevet brugt til at beskrive celleresponser, en af de mest anvendte kaldes den bløde glasagtige reologimodel⁵, kendetegnet ved en magtlovafhængighed af det komplekse forskydningsmodul med belastningsfrekvensen.

Enkeltcellebaserede metoder er blevet anvendt til at karakterisere RBC'ernes viskoelastiske egenskaber ved at anvende kraft og måle forskydning som en funktion af den pålagte belastning ^2,3. For det komplekse forskydningsmodul kan der imidlertid kun findes få resultater i litteraturen. Ved hjælp af dynamisk lysspredning blev værdier for RBC-lagring og tabsmoduli rapporteret varierende fra 0,01-1 Pa i frekvensområdet 1-100 Hz⁶. Ved anvendelse af optisk magnetisk vridningscytometri blev der opnået et tilsyneladende komplekst elastisk modul⁷, og til sammenligningsformål blev en multiplikativ faktor hævdet for muligvis at afklare uoverensstemmelserne.

For nylig blev der etableret en ny metode baseret på optisk pincet (OT) sammen med defokuseringsmikroskopi (DM) som et integreret værktøj til kvantitativt at kortlægge lagring og tab af forskydningsmoduler af humane erytrocytter over tidsafhængige belastninger ^8,9. Derudover blev en blød glasagtig reologimodel brugt til at passe resultaterne og opnå en effektlovkoefficient, der karakteriserer RBC'erne ^8,9.

Samlet set præciserer den udviklede metode^8,9, hvis protokol er beskrevet detaljeret nedenfor, tidligere uoverensstemmelser ved at anvende de målte værdier for formfaktoren, F_f, der relaterer kræfter og deformationer til spændinger og belastninger i RBC-overfladen og kan anvendes som en ny diagnostisk metode^, der er i stand til kvantitativt at bestemme de viskoelastiske parametre og bløde glasagtige egenskaber ved RBC'er opnået fra personer med forskelligt blod Patologier. En sådan karakterisering ved hjælp af protokollen beskrevet nedenfor kan åbne nye muligheder for at forstå RBC'ernes adfærd fra et mekanobiologisk perspektiv.

Protocol

Humane blodprøver blev leveret af voksne mænd og kvinder frivillige i henhold til protokoller godkendt af Research Ethics Committee ved Federal University of Rio de Janeiro (protokol 2.889.952) og registreret i Brasilien Platform under CAAE nummer 88140418.5.0000.5699. En skriftlig form for samtykke blev udstedt til og indsamlet fra alle frivillige. Dem med hæmoglobinopati og / eller tager kontrolleret medicin blev udelukket. Hele processen fulgte de retningslinjer, der blev godkendt af instituttets etiske udvalg.

1. Forberedelse af prøveholdere

1. Anskaf to dæksedler (24 mm x 60 mm og 24 mm x 32 mm; tykkelse = 0,13-0,17 mm) og en gummiring (diameter = 10 mm; tykkelse = 2 mm) til hver prøveholder.
2. Hæld silikonefedt over gummiringens overflade på en måde, der dækker hele omkredsen.
3. Placer gummiringen på dækselen med fedtsiden vendt mod dæksedlen. Vent i 5 minutter på korrekt fastgørelse, prøveholderne er derefter klar til at modtage cellekulturen.
   OBS: Derudover kan enten kommercielle eller hjemmelavede glasbundsfade også anvendes, som tidligere beskrevet¹⁰.

2. Cellekultur

BEMÆRK: Trinene nedenfor beskriver, hvordan man får sunde RBC'er fra humant blod. Det er vigtigt, at prøverne er frisklavede før hvert forsøg.

1. 20 μL blod fortyndes i 250 μL 1x phosphatbuffersaltopløsning (PBS) indeholdende 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM_Na2HPO 4, 1,8 mM KH₂PO₄, 10 mM glucose og suppleres med 1 mg/ml bovin serumalbumin (BSA).
2. Efter centrifugering ved 200 x g i 2 minutter ved stuetemperatur aspireres supernatanten med en pipette og cellepelleten resuspenderes i 1 ml 1x PBS/BSA-opløsning. Vask cellerne 2x i bufferen.
3. Celletætheden beregnes ved hjælp af en hæmocytometrier, og der frøes 50.000 til 100.000 celler i prøveholderen, der blev forberedt i trin 1. Vent i 10-15 minutter på uspecifik cellefastgørelse til dæksedlen; Ventetiden påvirker ikke cellerne.
4. Til prøven tilsættes 0,2 μL af en 10% v/v polystyrenkugleopløsning (radius = 1,52 ± 0,02 μm) til yderligere OT-forsøg. Bekræft korrekt blanding ved at se på prøverne under mikroskopet.
5. Efter cellesåning skal du bare placere det andet dæksel over gummiringen (det er ikke nødvendigt at tilføje fedt til fastgørelse), lukke opsætningen og afslutte prøveforberedelsen. Prøver er klar til mikroskopianalyse og manipulation.

3. Optisk pincet mikroskop opsætning

BEMÆRK: OT er værktøjer, der bruger en meget fokuseret laserstråle til at fange mikroskopiske objekter og til at måle kræfter i piconewtonområdet og forskydninger i nanometerskalaen. Den anvendte OT-laser (1064 nm bølgelængde) skal være korrekt justeret som tidligere beskrevet¹⁰.

1. Kort sagt, ved hjælp af mindst to spejle adskilt af en afstand på et par centimeter (mindst 10-20 cm), ret en lineært polariseret laserstråle mod bagindgangen til et omvendt mikroskop. Juster laserstrålen præcist for at komme ind i mikroskopet i en lige linje (figur 1).
2. Derefter reflekteres laserstrålen ved hjælp af et dikroisk spejl, der er installeret i mikroskopet, for at fortsætte parallelt med objektivlinsens akse og komme ind i linsen nær midten af bagindgangen. Dette vil fokusere laseren for at skabe den optiske fælde (figur 1).
3. For at måle kræfter med OT skal du kalibrere systemet for at opnå fældestivheden (κ_OT). Se¹⁰ for en mere detaljeret beskrivelse af OT-kalibreringsproceduren. Når κ OT er fundet, er _OT-systemet klar til reologieksperimenterne.

4. DM-opsætning

BEMÆRK: DM er en brightfield-baseret optisk mikroskopiteknik, der gør det muligt for gennemsigtige objekter at blive synlige, hvis mikroskopet er let defokuseret^11,12. En sådan teknik er blevet anvendt til at opnå RBC-formen¹³. Det samme mikroskop, der anvendes til OT-systemet, kan bruges til DM for at opnå en højdeprofil gennem 3D-rekonstruktioner.

1. Juster mikroskopbelysningssystemet ved at udføre Köhler-belysningen¹⁴ , og åbn kondensatormembranen helt for bedre opløsning for at udføre eksperimenterne.
2. Brug et piezoelektrisk positioneringssystem til at forskyde prøven i alle koordinater med nanometrisk præcision i z-aksen. Udfør autokalibrering af det piezoelektriske system på alle akser. Når alle procedurer er udført, er mikroskopsystemet klar til DM-eksperimenter.

5. OT-baseret reologieksperiment og analyse

BEMÆRK: Reologieksperimentet består i at observere cellens reaktioner på små svingninger med varierende frekvenser.

1. Eksperimenteren
   1. Brug OT-systemet til at fange kuglen med OT-laseren og derefter fastgøre den til en RBC ved at trykke kuglen mod celleoverfladen tæt på den øverste overflade og tæt på cellekanten. Brug mikroskopet til dette trin. Derefter skal du fælde en anden kugle og gentage den samme fastgørelsesprocedure, men fastgør den nu til dækselsedlen tæt på cellen. Kuglen, der er fastgjort til dæksedlen, er referenceperlen (figur 2), som er nødvendig for at følge piezoforskydningen og sammenligne med RBC-kuglen.
   2. Sørg for, at den valgte celle er godt fastgjort til dæksedlen, og at RBC- og referencekuglerne har klæbet til henholdsvis RBC-overfladen og dæksel, inden målingen påbegyndes. Identificer visuelt de ikke-klæbende celler, da de vil bevæge sig over tid på trods af den høje vedhæftningshastighed (ca. 80% -90%).
   3. Tilføj en sinusformet amplitudefunktion, ξ 0 = 0,500 ± 0,001 μm og varierende frekvenser på 1 Hz, 7 Hz, 14 Hz, 21 Hz, 28 Hz og 35 Hz med respektive vinkelfrekvenser, ω, på 6,3 rad / s, 169 rad / s, 88 rad / s, 132 rad / s, 176 rad / s og 220 rad / s til den piezoelektriske scenesoftware, ved hjælp af Piezoelectric-softwaren, som tidligere demonstreret ^8,9.
   4. Brug det piezoelektriske trin til at trykke på startknappen for at tillade den piezoelektriske forskydning og holde RBC-kuglen i fælden, send prøven til en bevægelsescyklus ved hjælp af den tidligere indstillede sinusformede funktion. Brug et kamera, der er i stand til at producere billeder med 790 billeder / s eller højere til at optage prøvebevægelsen. Et skema over eksperimentet er vist i figur 2.
   5. Mens prøven udsættes for sinusformede bevægelser, skal du aktivere OT for at fange kuglen, der er fastgjort til RBC-overfladen. Uanset hvilken temperatur der vælges til at udføre forsøgene, stuetemperatur, 37 °C eller en anden temperatur, skal temperaturen overvåges omhyggeligt for at undgå variationer under målingerne. Den infrarøde (1064 nm) laser, der bruges til at skabe OT, forårsager næsten ingen skade eller opvarmning af cellerne.
2. Analyse
   1. Analyser de billeder, der er opnået under sinusformede bevægelser ved hjælp af ImageJ for at finde centrum for massepositionen for hver af kuglerne over tid.
      BEMÆRK: Disse data gør det muligt at generere plots, der er i stand til at vise fase- og amplitudeforskelle mellem begge sfærer. Sådanne oplysninger er afgørende for at opnå RBC'ernes viskoelastiske respons.
   2. For at få massecentret for hver af kuglerne skal du åbne ImageJ-softwaren. Importer hele filmen opnået under sinusformede bevægelser.
   3. På fanen Billede skal du klikke på Juster og derefter vælge Tærskel. Tærskelvinduet åbnes. Vælg Sort/hvid. Dette vil gøre baggrunden hvid og kuglerne sorte.
   4. Juster tærsklen med begge rullepaneler under histogrammet, så begge kugler vises med det maksimale antal pixel.
   5. Vælg referencesfæren ved at klikke på Filer > rektangel. Tegn et rektangel for at vælge kuglen. Når du har valgt referencesfæren i ét billede, skal du sørge for, at rektanglet også markerer den samme kugle korrekt i alle andre billeder af filmen.
   6. Klik derefter på fanen Analysér på Indstil målinger og vælg indstillingen Center of Mass .
   7. Klik igen på fanen Analysér, og vælg Analysér partikler. Et nyt vindue åbnes. Definer størrelse og cirkularitet (afhængigt af kugleradius). Markér følgende afkrydsningsfelter Vis resultater og Ryd resultater. Klik til sidst på OK for at behandle alle billederne.
   8. Et nyt vindue, der indeholder en tabel med xy-koordinater for midten af massen, vises. Gem disse koordinatværdier som en .txt fil. Gentag proceduren for den anden kugle, der er fastgjort til RBC-overfladen.
   9. For at opnå amplituden og forskellene i fase for begge kugler skal du åbne analysesoftwaren. Importer de .txt filer, der tidligere er hentet.
   10. Opret en ny tabel med tre kolonner. I første kolonne (c0) lægges antallet af billeder sammen, i anden kolonne (c1) lægges x-koordinaterne for referencesfæren sammen, og i tredje kolonne (c2) lægges x-koordinaterne for kuglen fastgjort til RBC-overfladen.
       BEMÆRK: I dette eksempel, da sinusformede bevægelser kun blev udført i x-aksen, er det kun nødvendigt at bruge x-koordinaterne for begge kugler.
   11. Korreler derefter rammerne med tiden. Klik på Windows > formelindgang. Et nyt vindue kaldet formelindtastning åbnes. I dette vindue er det muligt at oprette otte forskellige ligninger, hver af dem i en bestemt nøgle (fra F1 til F8).
   12. Vælg F1, skriv følgende formel:
       C3= C0 / (kamera FPS)
       Klik på Kør. Dette opretter en ny kolonne for et stykke tid i tabellen (kolonne 4).
   13. Træk x-koordinatværdien for hver ramme fra med dens respektive middelværdi. Det kan du gøre ved at angive to nøgler på formelposten og skrive følgende ligninger for hver nøgle:
       c 4 = (c 1 - middelværdi (c 1)) og c 5 = (c 2 - middelværdi (c2))
       Klik på knappen Kør . Resultaterne vises i kolonne 5 og 6 for henholdsvis reference- og RBC-sfærer.
   14. Konverter centrum af masseværdier fra pixels til mikrometer. Til dette skal du bruge en anden nøgle på formelposten og skrive følgende ligning:
       C 4 = C 4 / Konverteringsnummer
       Gentag den samme proces for kolonne 5.
       BEMÆRK: Konvertering opnås ved hjælp af en mikrometerskala / lineal og opnåelse af sit billede med den samme mikroskopopsætning, der bruges til målingerne (inklusive den samme objektivlinse). Denne procedure kan udføres under mikroskopkalibreringen. Der opnås således en pixel/mikrometer-relation.
   15. Generer et plot med massecentrene for begge kugler på y-aksen og tiden på x-aksen. For dette skal du klikke på Galleri > lineær og scatter. Et nyt vindue åbnes. Vælg tidskolonnen for x-aksen, og vælg kolonnerne i massecentret i mikrometer for både reference- og RBC-sfærer i y-aksen.
   16. I plottet skal du kun vælge de data, der er relateret til den første vinkelfrekvens (6,3 rad/s). Brug de værktøjer, der er angivet i figur 3.
   17. Definer ligningen, der justerer datakurven for referencesfæren. For dette skal du klikke på Curve Fit > General og Fit1, markere feltet med data relateret til referencesfærens position og derefter klikke på Definer. Et nyt vindue åbnes for at definere ligningen. Referencekuglens position ξ(t) beskrives ved:
       ξ(t) = ξ₀cos(ωt)
       hvor ξ er prøvens sinusformede bevægelse, ω er vinkelfrekvensen og t er tiden i s. Ved at overføre denne ligning til analysesoftwaren vil den se ud som følger:
       , hvor m1 er ξ, m2 er f, m0 er tiden t, og m3 er fasen af cosinusfunktionen for t = 0.
   18. Anslå værdierne for m1, m2 og m3 fra plottet. Når du har defineret ligningen, skal du klikke på OK. Dataene tilpasses ud fra ligningen, og en kurve sammen med en lille firkant vises i grafen med værdierne m1, m2 og m3.
   19. Definer den ligning, der justerer datakurven for RBC-sfæren. For dette skal du klikke på Curve Fit > General og definere ligningen, der justerer kurven for dataene. RBC-sfærens position ρ(t) er givet ved:
       
       hvor ξ' er uden for faseamplitude, og φ er uden for fasevinklen. Ved at overføre denne formel til analysesoftwaren ser den ud som følger:
       , hvor m1, m2 og m3 er de værdier, der opnås i referencekuglens kurvetilpasning. m4 er ξ' og m5 er φ.
   20. Anslå værdierne for m4 og m5 fra plottet. Når du har defineret formlen, skal du klikke på OK. Dataene tilpasses ud fra ligningen, og en kurve sammen med en lille firkant vises i grafen med værdierne m4 og m5.
   21. Opret derefter en ny tabel for at tilføje de data, der er opnået fra kurvetilpasningen i deres respektive kolonner. Definer fem forskellige kolonner for følgende parametre: vinkelfrekvens, amplitude (referencekugle), starttid, amplitude (RBC-kugle) og uden for fasevinkel. Udfør den samme procedure for alle andre frekvenser.
   22. Brug følgende ligninger til at finde lager- (K') og tabskonstanterne (K"):
       
       
       hvor κ OT er _OT-elastisk konstant og β er Stokes-trækkoefficienten. Transponering af ligningerne til analysesoftwaren, det vil se ud som følger:
       og
       
        , hvor β og κ_OT skal erstattes af de værdier, der findes i systemet.
   23. Resultaterne afbildes på en graf ved hjælp af x-aksen for K " og y-aksen for K' (figur 4).

6. DM-eksperiment og analyse for at opnå den samlede celleformfaktor

1. Video erhvervelse
   1. Flyt det piezoelektriske trin i xy-retningen ved hjælp af softwaren til at søge efter en isoleret celle, der er fastgjort til dæksedlen. Fang og fastgør en polystyrenkugle med kendt diameter til RBC-overfladen. Brug det piezoelektriske trin til at flytte den fangede perle let, også fastgjort til RBC-overfladen, for at deformere cellen og derefter fastgøre perlen til dæksedlen.
      BEMÆRK: Det er også muligt at bruge den samme celle fra OT-målingerne.
   2. Skift z-aksens position for at finde det fokuserede billede, hvor fokusplanet er midt i den valgte celle. Dette billede viser den mindste kontrast med det grå niveau i midten af cellen svarende til det grå niveau uden for cellen (baggrund).
   3. Når positionen er fast, skal du bruge kamerasoftwaren til at oprette en film af hele cellen med ca. 5.000 billeder ved 8-bit og 256 pixels x 256 pixels med en billedhastighed på 25 fps. Flyt derefter z-aksepositionen 2 μm ned eller op for at opnå et defokuseret billede for den valgte celle. Gentag parametrene for at oprette en film til denne situation.
   4. Endelig, uden at ændre z-aksepositionen, skal du søge efter et område uden celler for at gentage den samme procedure og oprette en film af billedbaggrunden.
2. Indsamling af kontrastbilleder
   1. Konverter hver af de tre film til tre gennemsnitlige billeder. Brug ImageJ til at vælge en af filmene, klikke på Image > Stacks > Z Project og vælge indstillingen Gennemsnitlig intensitet . Gentag denne procedure for de andre film for at få deres respektive billeder.
   2. Skift alle de opnåede billeder fra 8-bit til float point 32-bits. Brug ImageJ til at klikke på Image > Skriv > 32-bits. Klik derefter på Analyser > Indstil målinger , og vælg indstillingen Gennemsnitlig grå værdi . Klik til sidst igen på Analyser > måling.
   3. Klik derefter på Process > Image Calculator og divider det fokuserede billede med baggrundsbilledet. Til dette resultat multipliceres gennemsnitsværdien af det fokuserede billedes grå niveau. Få gennemsnitsværdien ved at klikke på Process > Math > Multiplicere.
   4. For at opnå gennemsnitsværdien skal du vælge det fokuserede billede og derefter klikke på Analysér > måling. For det repræsentative billede er gennemsnitsværdien af det grå niveau 69.199. Gentag ovenstående procedurer for det defokuserede billede. I dette tilfælde er gennemsnitsværdien af det grå niveau 69.231. Figur 5 viser de fokuserede og defokuserede billeder før og efter proceduren.
   5. Billeder kan miste visuel kontrast under handlinger. For bedre at visualisere billederne skal du klikke på Billede > Juster > lysstyrke / kontrast og vælge indstillingen Auto .
   6. Brug derefter følgende forhold for at finde billedkontrasten:
      , hvor N _Img er cellens gråniveau, N₀ er gråniveauet uden for cellen og er en konstant parameter, der svarer til gråniveauet for nul lysintensitet, der afhænger af kameraet.
   7. For at finde værdien B skal du bruge en effektmåler til at måle lysintensiteten. For hver værdi af lysintensitet skal der optages en video; Således kan forskellige intensitetsværdier relateres til forskellige niveauer af grå. Endelig opnå en lineær pasform og relatere B til nul lysintensitet¹⁵.
   8. Find værdien af N₀, klik på ikonet Polygon Selection og tegn en polygon som den i figur 6. Klik derefter på fanen Analysér , og vælg Mål for at finde det gennemsnitlige gråniveau for det valgte område. Hvert billede er dannet af et sæt pixels, og hver pixel har et bestemt gråt niveau. Sættet af alle grå niveauer på grund af alle pixels, der udgør billedet, svarer til N_Img.
   9. Brug kontrastligningen til at bestemme N _Img - N_o og udfør dette ved at vælge Proces > Matematik > Træk fra. Del resultatet med N₀ - B. Find til sidst kontrasten for det fokuserede (C 0) og defokuserede billede (C1).
3. Opnåelse af højdeprofilen
   1. For at opnå højdeprofilen skal du bruge den allerede beskrevne metode¹³. Kort sagt skal du bruge Hartley-transformationen (FHT) til at opnå RBC-tykkelsen. I ImageJ skal du klikke på Behandl > FFT- > FFT-indstillinger og derefter vælge FHT.
   2. Subtrahere billederne C0 og C1 i ImageJ ved hjælp af Process > Math > Subtrahere for at få billedet til følgende procedure, C = C0 - C1.
   3. For billede C skal du klikke på Behandl > FFT- > FFT-indstillinger og derefter vælge FHT for at udføre Hartley-transformationen af billedet. Derefter divideres med den rumlige frekvens q² ved hjælp af det specialfremstillede plugin DivideQ2. Klik på Plugin > DivideQ2.
      BEMÆRK: Filen DivideQ2.class skal kopieres i plugins-mappen, hvor ImageJ er installeret. Pluginet leveres som en .class-fil (supplerende fil 1), der skal inkluderes i plugin-mappen til ImageJ.
   4. Udfør derefter den inverse transformering FHT ved hjælp af Process > FFT > FFT for at få et billede med et gråt niveau, der er proportionalt med cellens højde.
   5. Klik til sidst på Process > Math > Multiply for at multiplicere det resulterende billede ved hjælp af følgende konstant:
      
      som defineres ud fra billedernes, prøvens og den eksperimentelle opsætnings egenskaber¹³. Her er n = 1,51 oliebrydningsindekset, p = 0,0721 μm er forholdet mellem mikrometer og pixels af billederne, Δ n = 0,058 er forskellen mellem RBC og de vandige medium brydningsindekser, afstanden mellem fokuserings- og defokuseringsbillederne (Z _f1 - Z _f2) = 2μm og størrelsen på billederne, N2 = 256 pxl².
   6. Brug det resulterende billede til at opnå højdeprofilen (figur 7). Det resulterende billede bruges i ImageJ til at observere forskellige højdeprofiler. Det afhænger af, hvor i cellen den gule lodrette linje er placeret, for eksempel i figur 7 opnås en højdeprofil begrænset af den lodrette linje, observer dette ved at trykke på Ctrl + K.
4. Formfaktor
   1. Når du har fundet det billede, der indeholder RBC-højdeprofilen, skal du bruge den defokuserede kontrast på 2 μm til at oprette et sæt af to billeder i ImageJ. Klik på Image > Stacks, og vælg derefter indstillingen Images to Stack. Du kan finde formfaktoren ved at bruge en tilpasset ImageJ-makro til at analysere stakken. Den tilpassede makro ImageJ kan downloades som supplerende fil 2.
      BEMÆRK: Programmet bruger defokuseringsbilledet til at bestemme cellekanterne. Det bestemmer derefter omkredsen ved hjælp af det billede, der indeholder højdeprofilen, for hver vandret position. Ud over kanterne bestemmer den omkredsen såvel som den omvendte omkreds. Summen af de inverse omkredsværdier multipliceret med pixeltykkelsen svarer til formfaktorens inverse.
   2. Indsæt pixel/mikrometer-relationen i programmet. Få denne værdi fra mikroskopets objektive kalibreringseksperiment. I det anvendte eksempel er værdien 13,87 pixel/μm.
   3. Vælg den vandrette startposition for at placere den gule linje i det første billede af stakken. Start linjen før begyndelsen af cellen, og tegn den ud over cellens lodrette grænser. I eksemplet har den gule linje 153 pixels længde, og startpositionen er mellem i = 70, y1 = 80 og i = 70 og y2 = 195. Flyt derefter den gule linje vandret, indtil den endelige position er f = 245, y1 = 80 og f = 245 og y2 = 195.
   4. Endelig, for at finde cellekanterne, omkredsen og den omvendte af omkredsen, skal du vælge fanen Makro og klikke på Kør makro. Makroen leverer en tabel med kanternes position, omkredsen og omkredsens inverse og et billede af den analyserede celle. Kontroller, om kanterne på dette billede ligner kanterne på figur 7, ellers gentages proceduren.
   5. Brug summen af den inverse omkreds til at finde formfaktoren⁸.

7. Blød glasagtig reologimodel og eksperimentel analyse

1. Organisere eksperimentelle data i en tabel
   1. Opret en ny tabel i analysesoftwaren ved at klikke på fanen Filer . Bestem 10 forskellige kolonner (fra c0 til c9) for følgende parametre: anvendte vinkelfrekvenser (rad/s): c0; K' (pN/μm) værdier opnået for hver vinkelfrekvens: c1; ErrK«: c2; K" (pN/μm) værdier opnået for hver vinkelfrekvens: c3; ErrK": c4; G'(Pa)-værdier opnået for hver vinkelfrekvens: c5; ErrG«: c6; G" (Pa) værdier opnået for hver vinkelfrekvens: c7; ErrG": c8 og F_{f med} dens respektive fejl: c9 (figur 8). Brug følgende formel til at udfylde følgende kolonner:
      C5 = (3 x C1) / (8 x 1,28 x 0,087)
      c6 = (3 / (8 x 0,087 x 1,28)) x sqrt (c2^2 + (c1 x 0,01 / 1,28)^2 + (c1 x 0,008 / 0,087) ^ 2)
      C7 = (3 x C3) / (8 x 1,28 x 0,087)
      C8 = (3 / (8 x 0,087 x C4)) x sqrt (C4^2 + (C3 x 0,01 / 1,28)^2 + (C3 x 0,008 / 0,087)^2)
2. Afbildningskurve G' (ω) versus G" (ω)
   1. For at generere kurven G' (ω) versus G" (ω) i analysesoftwaren skal du bruge dataene fra den forrige tabel. Klik på Galleri > lineær, og vælg Scatter Plot-formatet.
   2. Et nyt vindue åbnes. Vælg kolonnen G " som x-aksen og kolonnen G' som y-aksen. Klik til sidst på knappen Plot for at få grafen.
   3. For at tilføje fejlbjælkerne i plottet skal du klikke på plotvinduet og derefter klikke på Plot > Error Bars. Et nyt vindue åbnes. Marker først indstillingen Y Err . Et andet vindue, kaldet Error Bar Settings åbnes.
   4. Klik på % af værdi, vælg Datakolonne, og klik derefter på kolonnen ErrG '. Klik til sidst på OK > Plot, fejlbjælkerne for y-værdierne vises. Gentag den samme procedure for x-akseværdier ved nu at vælge X Err-kvadratet og den korrekte kolonne til ErrG". Det endelige plot vil ligne det, der er vist i figur 9.
3. Tilpasning af parametrene til den bløde glasagtige reologimodel
   BEMÆRK: Dataanalysen er opdelt i to dele: 1) kurve, der passer til G' (ω) versus G" (ω) plottet for at opnå parametrene Γ og G_m; 2) kurvetilpasning G' (ω) og G" (ω) som funktion af frekvensen ω, for at opnå effektloveksponenten α.
   1. Kurve, der passer til plottet G' (ω) versus G" (ω) for at opnå parametrene Γ og G_m.
      1. Klik på fanen Curve Fit , vælg Fit1. Et nyt vindue åbnes. Vælg firkanten , og klik på knappen Definer . Et vindue kaldet generel kurvetilpasningsdefinition vises. Skriv følgende ligning:
         m1 + m0/m2
         hvor m1 = 61,576; m2 = 1, med tilladt fejl på 1 x ^10-5. Her repræsenterer m0 G ", m1 repræsenterer G_m og m2 repræsenterer Γ.
         BEMÆRK: For m1 og m2 er det nødvendigt at estimere deres respektive værdier under definitionen af kurvetilpasning. Estimaterne ovenfor var baseret på det viste eksempeleksperiment. I forsøgene estimeres tallene i henhold til de værdier, der observeres i plottet.
      2. Klik på OK-knappen i begge vinduer, og beslaget vises, som vist i figur 10 - en sort kurve. Kontroller de korrekte værdier for m1 og m2, der er angivet i kurvetilpasningstabellen, der blev vist sammen med plottet.
   2. Kurvetilpasning G ' og G" som funktion af vinkelfrekvensen ω
      1. Opret derefter to andre plot, nemlig G 'som en funktion af ω og G' som en funktion af ω. Placer kun fejlbjælkerne på y-aksen, som tidligere vist.
      2. Gentag kurvetilpasningsproceduren, men vælg nu G" i Valg af kurvetilpasning, og skriv derefter følgende ligning i Generel tilpasning > kurvedefinition:
         
         I dette tilfælde blev m1 anslået til at være værdien af G" (ω) = 23,683 Pa, når ω = 6,3 rad/s; m2 blev anslået til 0,5 (husk, at m2 er eksponenten α og varierer mellem 0 og 1). Indsæt værdien for Γ = 2,0293 i henhold til resultatet af m2 i figur 10.
      3. Marker indstillingen Vægtdata. Efter alle disse procedurer skal du klikke på OK, og en kurve, der passer til den i figur 11 - en blå kurve vises. Værdierne for α, α = 0, 63 ± 0, 02 og G 0, G 0 = (3, 7 ± ₀, 3) Pa vises. Brug disse værdier til at tilpasse den næste kurve, G' (ω).
      4. Klik på den næste kurve, gentag kurvetilpasningsproceduren, men skriv nu følgende ligning i definitionen af generel tilpasningskurve:
         
         I dette tilfælde er m3 kun en estimeret værdi på α for at bekræfte den tidligere opnåede værdi. Brug værdierne for G ₀ = 3,703 og G' (ω) = 23,683 Pa, når ω = 6,3 rad/s.
      5. Tilføj igen 1 x ^10-5 som tilladt fejl og marker indstillingen Vægtdata. Efter alle disse procedurer skal du klikke på OK, og en kurve , der passer til den i figur 11 - en grøn kurve vises.

Representative Results

Figur 1 viser skemaerne for OT-systemet, der anvendes til reologimålingerne. Figur 2 viser skemaerne for mikrorheologieksperimentet med begge sfærer, og en repræsentativ RBC vises også. Figur 3 viser en typisk kurve for amplituderne af begge sfærer som funktion af tiden, når sinusformede bevægelser produceres af det piezoelektriske stadium. Mens referencekuglen (figur 3 - rød kurve) svinger efter scenebevægelsen, svinger RBC-kuglen (figur 3 - en blå kurve) med en anden amplitude og fase. Ved at måle disse parametre er det muligt at bestemme den komplekse elastiske konstant K* (ω) for forskellige RBC'er i prøven. Figur 4 viser en typisk afbildning for lagringselastiskkonstanten K' (ω) som funktion af tabselastiskkonstanten K" (ω). Den observerede lineære afhængighed viser, at RBC-overfladen kan betragtes som et blødt glasagtigt materiale. Dernæst er det nødvendigt med en DM-procedure for at opnå den samlede celleformfaktor, F_f, og figur 5, figur 6 og figur 7 inkluderer nogle af de nødvendige trin til formålet. For at konvertere kræfter og deformationer til spændinger og belastninger er det nødvendigt at omdanne K * (ω) til G * (ω).

Den komplekse RBC-elastiske konstant defineres som K* (ω) = K' (ω) + iK" (ω). Desuden er K * (ω) relateret til RBC-kompleksets forskydningsmodul G * (ω) = G '(ω) + iG "(ω). G' (ω) og G" (ω) er henholdsvis RBC-forskydningslagring og tabsmoduli. Forholdet mellem K* (ω) og G* (ω) er givet ved:

hvor F_f er en formfaktor, der som tidligere nævnt afhænger af RBC-geometrien, og ζ er RBC-membrantykkelsen, tidligere bestemt som ζ = (0,087 ± 0,009)μm ^8,15.

Endvidere er lagringsforskydningsmodulerne G' (ω) og G" (ω) relateret til henholdsvis lagringskonstanterne K' (ω) og tab K" (ω) gennem ligningerne ^8,9

og

For at finde standardfejlene for henholdsvis G' (ω) og G" (ω), Err G' og Err G" skal du bruge udbredelsen af usikkerheder ligninger med resultaterne af K' (ω) og K" (ω) i henhold til følgende ligninger ^8,9:

.

Ifølge teorien om blød glasagtig reologi opfører RBC'erne sig som viskoelastiske materialer såsom emulsioner, pastaer og opslæmninger ^8,9, og deres opbevarings- og tabsmoduli adlyder følgende ligninger:

Således , hvor G _m er cellemembranforskydningsmodulet, G 0 er lavfrekvenslagringsmodulet, Γ er forholdet , α er effektloveksponenten for blød glasagtig reologimodel og ω₀ = 1 rad / s ^8,9. 

De værdier, der blev fundet for F,_f og også RBC-overfladetykkelsen ζ, blev anvendt (anslået til 87 ± 8 nm ^8,9,15). Resultaterne er vist i figur 8, figur 9 og figur 10. Igen er den lineære afhængighed mellem G 'og G' i overensstemmelse med hypotesen om, at RBC-overflader kan modelleres som bløde glasagtige materialer. Fra den lineære pasform af dette plot kan værdien af G _m også opnås, og ved at introducere denne værdi til den bløde glasagtige reologikurvepasning af G "bestemmes værdierne for G₀ og α (figur 11 - en blå kurve). Efter at have brugt det opnåede resultat for G ₀ og tilføjet det til den bløde glasagtige reologikurvetilpasning af G', udledes den samme værdi for eksponenten inden for fejlbjælker (figur 11 - en grøn kurve).

Figur 1: Skematisk gengivelse af OT-mikroskopet. Hele systemet er bygget på et antivibrationsbord. Laseren justeres ved hjælp af mindst to forskellige dikroiske spejle (hvid) og ledes til bagindgangen til mikroskopets objektivlinse ved hjælp af et andet dikroisk spejl (lyseblå). Et piezoelektrisk stadium og et digitalt videnskabeligt kamera fastgjort til en computer er også nødvendige. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Skemaer over mikrorheologieksperimentet. Referencekuglen (mørkegrå) er fastgjort til dæksedlen, og RBC-kuglen (blå) er fastgjort til erytrocytoverfladen (rød) og fanget af OT (angivet med ferskentrekanter, når laseren er tændt). ρ er ligevægtspositionen for RBC-kuglen i fælden; ξ er prøvens sinusformede bevægelse, og x er celledeformationen. Det skematiske billede blev oprettet i Biorender. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Plot, der illustrerer amplituderne (μm) af begge kugler over tid (er), når sinusformede bevægelser produceres af det piezoelektriske stadium. Referencekuglen (rød kurve) svinger efter scenebevægelsen, mens RBC-kuglen (blå kurve) svinger med en anden amplitude og fase. Den grønne pil til højre angiver datamarkeringsværktøjet, mens den gule pil angiver zoommarkeringsværktøjet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: RBC mikrorheologi resultater. Opbevar elastisk konstant som funktion af tabselastisk konstant for forskellige RBC'er i prøven (n = 10 forskellige celler fra tre forskellige prøver). Datapunkter repræsenterer middelværdierne for både K ' (y-aksen) og K" (x-aksen) med deres respektive fejlbjælker (standardmiddelfejl), opnået for hver vinkelfrekvens, der anvendes i forsøgsopstillingen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: DM anvendt på en RBC . (A) Defokuseret billede, størrelse = 2 μm. (B) Billede i fokus. (C) Baggrundsbillede. Ved at dividere hvert billede (A) og (B) med baggrundsbilledet (C) og derefter gange med den gennemsnitlige grå værdi af hvert billede er det muligt at få billeder (D) og (E). Skalabjælke: 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Baggrund gråt niveau N₀. Når du har åbnet det repræsentative billede i ImageJ (A), skal du vælge et område (gul geometrisk figur omkring RBC-cellen), der bruges til at opnå middelværdien af baggrundsgråniveauet og resultatet (B). For at udføre den gule markering i A skal du bruge polygonmarkeringsværktøjet i billede J (angivet med en grøn pil). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Højdeprofil for den deformerede RBC. Højdeprofil (venstre) repræsenteret langs billedets lodrette gule linje (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8: Repræsentativt skærmbillede af en typisk resultattabel i analysesoftwaren. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 9: RBC-viskoelastiske parametre. Opbevar forskydningsmodulet som funktion af tabsforskydningsmodulet for forskellige RBC'er i prøven (n = 10 forskellige celler fra tre forskellige prøver). Datapunkter repræsenterer middelværdierne for både G ' (y-aksen) og G" (x-aksen) med deres respektive fejlbjælker (standardmiddelværdi), der er opnået for hver vinkelfrekvens, der anvendes i forsøgene. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 10: Kurvetilpasning af G ' (Pa) som funktion af G" (Pa). Den lineære sorte linje er kurven, der passer til datapunkterne. N = 10 forskellige celler fra tre forskellige prøver. Fejlbjælker repræsenterer standardfejlen i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 11: Justering af den bløde glasagtige reologimodel til resultaterne. Det komplekse forskydningsmodul (G*) som funktion af vinkelfrekvensen ω for forskellige RBC'er i prøven. De grønne cirkler i plottet repræsenterer middelværdierne for G', mens de blå cirkler repræsenterer middelværdierne for G", afbildet med deres respektive fejlbjælker. De kontinuerlige grønne og blå linjer repræsenterer kurvetilpasningerne til den bløde glasagtige reologimodel. Parametrene m 1, m 2 og m3 er angivet i plottet. Mens m 1 er G₀, m2 og m3 er eksponenten, α. N = 10 forskellige celler fra tre forskellige prøver. Fejlbjælker repræsenterer standardfejlen i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: ImageJ plugin DivideQ2.class. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: ImageJ tilpassede makro for at opnå formfaktoren. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I denne protokol præsenteres en integreret metode baseret på optisk pincet og defokuseringsmikroskopi for kvantitativt at kortlægge de viskoelastiske egenskaber af RBC'er. Resultaterne for lagrings- og tabsforskydningsmoduliet sammen med skaleringseksponenten, der karakteriserer RBC's bløde glasagtige reologi, bestemmes. Anvendelse af denne protokol til forskellige eksperimentelle betingelser, såsom i fysiologisk situation⁸ eller langs hvert trin i P. falciparum intra-erythrocytisk cyklus⁹ , er allerede udført.

Referencer i litteraturen peger på uoverensstemmelser i RBC-reologi, delvist tilskrevet ændringer i cellemorfologi, der ikke er taget korrekt i betragtning under målinger ^6,7. Ved hjælp af dynamisk lysspredning blev værdier for RBC-lagring og tabsmoduli rapporteret fra 0,01-1 Pa i frekvensområdet 1-100 Hz⁶. I en anden undersøgelse ved anvendelse af optisk magnetisk vridningscytometri blev det tilsyneladende komplekse elastiske modul bestemt⁷, men afveg fra de dynamiske lysspredningsværdier; Således blev en multiplikativ faktor på 84 anvendt til sammenligningsformål. Efter procedurerne beskrevet i denne protokol blev disse forskelle afklaret⁸ ved at karakterisere RBC-formfaktoren ved hjælp af en ikke-invasiv defokuseringsmikroskopiteknik^11,12,13. Det komplekse forskydningsmodul, der karakteriserer celleoverflader, kan kun opnås, hvis geometrien betragtes som^16,17, og dette ikke altid blev udført korrekt.

Den integrerede metode, der præsenteres i denne protokol, gør det muligt at udføre begge metoder (OT-måling og DM-måling) for den samme enkelt celle, den ene efter den anden. Det giver også mulighed for at udføre OT-målinger for forskellige celler i en population og derefter udføre DM-målinger for andre celler i samme cellepopulation. Den sidste mulighed vil sandsynligvis introducere mere variabilitet til begge resultater, men fejlene kan udbredes i overensstemmelse hermed på en sådan måde, at resultaterne vil korrelere den samlede RBC-morfologi med de samlede RBC-viskoelastiske egenskaber i en given population af celler svarende til en bestemt eksperimentel tilstand.

Den største begrænsning for udførelse af denne protokol er den iboende vanskelighed ved at udføre selve metoden, da den er en integration af optisk pincet og defokuseringsmikroskopi; Derfor kan tilgængeligheden af instrumenter til at udføre alle de beskrevne trin være en udfordring. Men hvis man har adgang til en OT-facilitet, er det meget mere gennemførligt i sidste ende at tilpasse anlægget til at udføre eksperimenterne. Det er her, den nuværende protokol passer ind og ikke kun beskriver hvert trin til at udføre målingerne og analyserne, men hjælper også folk med at identificere og vedtage disse OT-systemer i stedet for at oprette en opsætning fra bunden.

RBC-fastgørelse til dæksedler bliver også en begrænsende faktor, da de er ikke-klæbende celler, og sådanne trin kan medføre vanskeligheder ved målinger, da nogle RBC'er kan løsnes. Det er således vigtigt at vælge en velklæbet RBC. En måde at kontrollere, om valget var vellykket, kan forekomme på tidspunktet for forberedelsen af prøven til målingen. Når du har placeret den OT-fangede RBC-kugle på celleoverfladen, skal du flytte prøven let for at sikre, at cellen er fast fastgjort og ikke har ændret position efter den OT-fangede perle. Hvis det er tilfældet, skal du kigge efter en anden celle i prøven. Fremtidige forbedringer såsom brugen af dobbeltstråle OT til samtidig at fange RBC og udføre reologimålingerne på samme tid kan også gøres.

Bortset fra det muliggør muligheden for at udtrække enkeltcellebaseret kvantitativ viskoelastisk information af RBC'er en række applikationer, der lige er begyndt at blive udforsket ^8,9. Således kan den præsenterede metode udvides til karakterisering af RBC mekanisk adfærd under andre fysio-patologiske tilstande som jernmangelanæmi og diabetes eller i genetiske blodsygdomme som seglcellesygdom og thalassæmi, for eksempel. Et sådant integreret værktøj kan danne grundlag for udviklingen af nye diagnostiske metoder, der er i stand til at korrelere ændringerne i RBC-viskoelastiske egenskaber med ændringer i blodgennemstrømningen hos personer med forskellige patologier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm culture dishes	Corning	430165
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418
Coverslips	Knittel Glass	VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01
Glass-bottom dishes	MatTek Life Sciences	P35G-0-10-C
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
Immersion oil	Nikon	MXA22165
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE300
KaleidaGraph	Synergy Software	https://www.synergy.com/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Microscope camera	Hamamatsu	C11440-10C
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich	BR717805-1EA
Objective lens	Nikon	PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2
Optical table	Thorlabs	T1020CK
OT laser	IPG Photonics	YLR-5-1064-LP
Polystyrene microspheres	Polysciences	17134-15
rubber ring	Forever Seals	NBR O-Ring
Silicone grease	Dow Corning	Z273554
Stage positioning	PI	P-545.3R8S
Pipette	Gilson	P1000