Biology

ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और डीफोकसिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लाल रक्त कोशिकाओं के विस्कोस्टिक गुणों का मात्रात्मक विश्लेषण

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/63626

Summary

यहां, कोशिकाओं के रियोलॉजिकल गुणों को मापने के लिए ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और डीफोकसिंग माइक्रोस्कोपी पर आधारित एक एकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल में परिवर्तनीय फिजियो-पैथोलॉजिकल स्थितियों के तहत एरिथ्रोसाइट्स के विस्कोस्टिक गुणों का अध्ययन करने में व्यापक प्रयोज्यता है।

Abstract

एरिथ्रोसाइट्स के विस्कोस्टिक गुणों की जांच कई तकनीकों द्वारा की गई है। हालांकि, रिपोर्ट किए गए प्रयोगात्मक डेटा अलग-अलग हैं। यह न केवल कोशिकाओं की सामान्य परिवर्तनशीलता के लिए जिम्मेदार है, बल्कि सेल प्रतिक्रिया के तरीकों और मॉडल में अंतर के लिए भी जिम्मेदार है। यहां, ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और डीफोकसिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक एकीकृत प्रोटोकॉल 1 हर्ट्ज से 35 हर्ट्ज की आवृत्ति सीमा में लाल रक्त कोशिकाओं की रियोलॉजिकल विशेषताओं को प्राप्त करने के लिए नियोजित किया जाता है। जबकि ऑप्टिकल ट्वीज़र्स का उपयोग एरिथ्रोसाइट-कॉम्प्लेक्स इलास्टिक स्थिरांक को मापने के लिए किया जाता है, डीफोकसिंग माइक्रोस्कोपी सेल ऊंचाई प्रोफ़ाइल, वॉल्यूम और इसके फॉर्म फैक्टर को एक पैरामीटर प्राप्त करने में सक्षम है जो जटिल लोचदार स्थिरांक को जटिल कतरनी मापांक में बदलने की अनुमति देता है। इसके अलावा, एक नरम ग्लासी रियोलॉजी मॉडल को लागू करते हुए, दोनों मोडुलिन के लिए स्केलिंग प्रतिपादक प्राप्त किया जा सकता है। विकसित पद्धति लाल रक्त कोशिकाओं के यांत्रिक व्यवहार का पता लगाने की अनुमति देती है, जो कई शारीरिक और रोग स्थितियों के लिए अच्छी तरह से परिभाषित प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत प्राप्त उनके विस्कोस्टिक मापदंडों को दर्शाती है।

Introduction

परिपक्व लाल रक्त कोशिकाएं (आरबीसी), जिन्हें एरिथ्रोसाइट्स के रूप में भी जाना जाता है,^{मानव शरीर की} सबसे संकीर्ण केशिकाओं से गुजरने पर अपने आकार से दोगुने से अधिक विस्तार करने में सक्षम हैं। इस तरह की क्षमता को बाहरी भार के अधीन होने पर विकृत करने की उनकी अनूठी क्षमता के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है।

हाल के वर्षों में, विभिन्न अध्ययनों ने आरबीसी सतहों ^2,3 में इस सुविधा की विशेषता बताई है। भौतिकी का क्षेत्र जो बाहरी भार के कारण सामग्रियों की लोचदार और चिपचिपी प्रतिक्रियाओं का वर्णन करता है, उसे रियोलॉजी कहा जाता है। सामान्य तौर पर, जब एक बाहरी बल लागू किया जाता है, तो परिणामी विरूपण सामग्री के गुणों पर निर्भर करता है और इसे लोचदार विरूपण में विभाजित किया जा सकता है, जो ऊर्जा, या चिपचिपा विरूपण को संग्रहीत करता है, जो ऊर्जा^को नष्ट करता है। आरबीसी सहित सभी कोशिकाएं, एक विस्कोस्टिक व्यवहार प्रदर्शित करती हैं; दूसरे शब्दों में, ऊर्जा संग्रहीत और विघटित दोनों है। इस प्रकार एक कोशिका की विस्कोस्टिक प्रतिक्रिया को इसके जटिल कतरनी मापांक G* (q) = G'(q) + iG" (q) द्वारा चिह्नित किया जा सकता है, जहां G' (q) भंडारण मापांक है, जो लोचदार व्यवहार से संबंधित है, और G" (q) हानि मापांक है, जो इसकी चिपचिपाहट⁴ से संबंधित है। इसके अलावा, घटनात्मक मॉडल का उपयोग सेल प्रतिक्रियाओं का वर्णन करने के लिए किया गया है, सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले में से एक को नरम ग्लासी रियोलॉजी मॉडल⁵ कहा जाता है, जो लोड आवृत्ति के साथ जटिल कतरनी मापांक की शक्ति-कानून निर्भरता की विशेषता है।

एकल-सेल-आधारित विधियों को आरबीसी के विस्कोस्टिक गुणों को चिह्नित करने के लिए नियोजित किया गया है, बल लागू करके और लगाए गए लोड ^2,3 के कार्य के रूप में विस्थापन को मापकर। हालांकि, जटिल कतरनी मापांक के लिए, साहित्य में कुछ परिणाम पाए जा सकते हैं। गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन का उपयोग करते हुए, आरबीसी भंडारण और हानि मोडुलिन के मान 1-100 हर्ट्ज⁶ की आवृत्ति सीमा में 0.01-1 पीए से भिन्न बताए गए थे। ऑप्टिकल चुंबकीय घुमावदार साइटोमेट्री का उपयोग करके, एक स्पष्ट जटिल लोचदार मापांक⁷ प्राप्त किया गया था, और तुलना उद्देश्यों के लिए, संभवतः विसंगतियों को स्पष्ट करने के लिए एक गुणक कारक का दावा किया गया था।

हाल ही में, ऑप्टिकल ट्वीज़र्स (ओटी) पर आधारित एक नई पद्धति, डीफोकसिंग माइक्रोस्कोपी (डीएम) के साथ, समय-निर्भर भार पर मानव एरिथ्रोसाइट्स के कतरनी मोडुलिन के भंडारण और हानि को मात्रात्मक रूप से मैप करने के लिए एक एकीकृत उपकरण के रूप में, ^8,9 स्थापित किया गया था। इसके अलावा, परिणामों को फिट करने और एक शक्ति-कानून गुणांक प्राप्त करने के लिए एक नरम ग्लासी रियोलॉजी मॉडल का उपयोग किया गया था जो आरबीसी ^8,9 की विशेषता है।

कुल मिलाकर, विकसित पद्धति^8,9, जिसके लिए प्रोटोकॉल नीचे विस्तार से वर्णित है, फॉर्म फैक्टर^, एफ एफ के लिए मापा मूल्यों का उपयोग करके पिछली विसंगतियों को स्पष्ट करता है, जो आरबीसी सतह में तनाव और उपभेदों के लिए बलों और विकृतियों से संबंधित है और इसका उपयोग एक नई नैदानिक विधि के रूप में किया जा सकता है जो मात्रात्मक रूप से विभिन्न रक्त वाले व्यक्तियों से प्राप्त आरबीसी के विस्कोस्टिक मापदंडों और नरम ग्लासी विशेषताओं को निर्धारित करने में सक्षम है। विकृति। इस तरह के लक्षण वर्णन, नीचे वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, आरबीसी के व्यवहार को मेकेनोबायोलॉजिकल परिप्रेक्ष्य से समझने के लिए नई संभावनाएं खोल सकते हैं।

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Protocol

रियो डी जनेरियो के संघीय विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल 2.889.952) की अनुसंधान आचार समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार वयस्क पुरुषों और महिला स्वयंसेवकों द्वारा मानव रक्त के नमूने प्रदान किए गए थे और सीएएई संख्या 88140418.5.0000.5699 के तहत ब्राजील प्लेटफॉर्म में पंजीकृत थे। सहमति का एक लिखित रूप जारी किया गया था और सभी स्वयंसेवकों से एकत्र किया गया था। किसी भी हीमोग्लोबिनोपैथी और / या नियंत्रित दवा लेने वाले लोगों को बाहर रखा गया था। पूरी प्रक्रिया में संस्थान की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित दिशानिर्देशों का पालन किया गया।

1. नमूना धारकों की तैयारी

प्रत्येक नमूना धारक के लिए दो कवरलिप्स (24 मिमी x 60 मिमी और 24 मिमी x 32 मिमी; मोटाई = 0.13-0.17 मिमी) और एक रबर रिंग (व्यास = 10 मिमी; मोटाई = 2 मिमी) प्राप्त करें।
रबर रिंग की सतह पर सिलिकॉन ग्रीस को इस तरह से डालें जो पूरी परिधि को कवर करता है।
कवरस्लिप के सामने ग्रीस साइड के साथ कवरस्लिप पर रबर की अंगूठी रखें। उचित लगाव के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें, नमूना धारक तब सेल संस्कृति प्राप्त करने के लिए तैयार हैं।
नोट: इसके अलावा, या तो वाणिज्यिक या घर का बना ग्लास बॉटम व्यंजन भी इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसा कि पहले वर्णित¹⁰ है।

2. सेल संस्कृति

नोट: नीचे दिए गए चरण बताते हैं कि मानव रक्त से स्वस्थ आरबीसी कैसे प्राप्त करें। यह महत्वपूर्ण है कि नमूने प्रत्येक प्रयोग से पहले ताजा तैयार किए गए हैं।

1x फॉस्फेट बफर सेलाइन (पीबीएस) घोल के 250 μL में 20 μL रक्त पतला करें जिसमें 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8 mM KH₂PO₄, 10 mM ग्लूकोज, और 1 mg/mL गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) के साथ पूरक हो।
कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, एक पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें और सेल गोली को 1x PBS / BSA समाधान के 1 mL में फिर से निलंबित करें। बफर में कोशिकाओं को 2 x धोएं।
हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल घनत्व की गणना करें और चरण 1 में तैयार नमूना धारक में 50,000 से 100,000 कोशिकाओं को बीज दें। कवरस्लिप में निरर्थक सेल अनुलग्नक के लिए 10-15 मिनट तक प्रतीक्षा करें; प्रतीक्षा समय कोशिकाओं को प्रभावित नहीं करता है।
आगे के ओटी प्रयोगों के लिए 10% v/v पॉलीस्टाइनिन क्षेत्र समाधान (त्रिज्या = 1.52 ± 0.02 μm) के नमूने 0.2 μL में जोड़ें। माइक्रोस्कोप के तहत नमूने देखकर उचित मिश्रण की पुष्टि करें।
सेल सीडिंग के बाद, बस रबर रिंग के ऊपर दूसरा कवरस्लिप रखें (अटैचमेंट के लिए ग्रीस जोड़ना आवश्यक नहीं है), सेटअप बंद करें, और नमूना तैयारी पूरी करें। नमूने माइक्रोस्कोपी विश्लेषण और हेरफेर के लिए तैयार हैं।

3. ऑप्टिकल ट्वीज़र्स माइक्रोस्कोप सेटअप

नोट: ओटी ऐसे उपकरण हैं जो सूक्ष्म वस्तुओं को फंसाने के लिए एक अत्यधिक केंद्रित लेजर बीम का उपयोग करते हैं और नैनोमीटर पैमाने में पिकोनेवटन रेंज और विस्थापन में बलों को मापने के लिए। उपयोग किए जाने वाले ओटी लेजर (1064 एनएम तरंग दैर्ध्य) को ठीक से संरेखित किया जाना चाहिए, जैसा कि पहले वर्णित¹⁰ है।

संक्षेप में, कुछ सेंटीमीटर (कम से कम 10-20 सेमी) की दूरी से अलग किए गए कम से कम दो दर्पणों का उपयोग करके, एक उल्टे माइक्रोस्कोप के पिछले प्रवेश द्वार की ओर एक रैखिक रूप से ध्रुवीकृत लेजर बीम को निर्देशित करें। माइक्रोस्कोप में एक सीधी रेखा में प्रवेश करने के लिए लेजर बीम को सटीक रूप से संरेखित करें (चित्रा 1)।
फिर, ऑब्जेक्टिव लेंस की धुरी के समानांतर आगे बढ़ने और इसके पिछले प्रवेश द्वार के केंद्र के पास लेंस में प्रवेश करने के लिए, माइक्रोस्कोप में स्थापित एक डाइक्रोइक दर्पण का उपयोग करके लेजर बीम को प्रतिबिंबित करें। यह ऑप्टिकल ट्रैप (चित्रा 1) बनाने के लिए लेजर पर ध्यान केंद्रित करेगा।
इसके बाद, ओटी के साथ बलों को मापने के लिए, जाल कठोरता प्राप्त करने के लिए सिस्टम को कैलिब्रेट करें ।। ओटी अंशांकन प्रक्रिया के अधिक विस्तृत विवरण के लिए¹⁰ देखें। एक बार जब ओटी मिल जाता है, तो _ओटीसिस्टम रिओलॉजी प्रयोगों के लिए तैयार होता है।

4. डीएम सेटअप

नोट: डीएम एक ब्राइटफील्ड-आधारित ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक है जो पारदर्शी वस्तुओं को दृश्यमान होने की अनुमति देती है यदि माइक्रोस्कोप थोड़ा डीफोकस्ड^11,12 है। आरबीसी आकार¹³ प्राप्त करने के लिए ऐसी तकनीक लागू की गई है। ओटी सिस्टम के लिए नियोजित एक ही माइक्रोस्कोप का उपयोग डीएम के लिए किया जा सकता है, 3 डी पुनर्निर्माण के माध्यम से ऊंचाई प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए।

कोहलर रोशनी¹⁴ का प्रदर्शन करके माइक्रोस्कोप प्रकाश प्रणाली को समायोजित करें और बेहतर रिज़ॉल्यूशन के लिए, प्रयोगों को करने के लिए कंडेनसर-डायाफ्राम को पूरी तरह से खोलें।
जेड-अक्ष में नैनोमेट्रिक परिशुद्धता के साथ, सभी निर्देशांक में नमूने को विस्थापित करने के लिए पीजोइलेक्ट्रिक पोजिशनिंग सिस्टम का उपयोग करें। सभी अक्षों पर पीजोइलेक्ट्रिक सिस्टम का ऑटोकैलिब्रेशन करें। एक बार सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करने के बाद, माइक्रोस्कोप सिस्टम डीएम प्रयोगों के लिए तैयार है।

5. ओटी-आधारित रिओलॉजी प्रयोग और विश्लेषण

नोट: रियोलॉजी प्रयोग में अलग-अलग आवृत्तियों के छोटे दोलनों के लिए सेल की प्रतिक्रियाओं का अवलोकन करना शामिल है।

प्रयोग
1. ओटी प्रणाली का उपयोग करके, ओटी लेजर के साथ गोले को फंसाएं और फिर शीर्ष सतह के पास और सेल किनारे के करीब सेल की सतह के खिलाफ गोले को दबाकर इसे आरबीसी से संलग्न करें। इस चरण के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। फिर, एक और गोले को फंसाएं और उसी अनुलग्नक प्रक्रिया को दोहराएं लेकिन अब इसे सेल के करीब कवरस्लिप से संलग्न करें। कवरस्लिप से जुड़ा गोला संदर्भ मोती (चित्रा 2) है, जो पीजो विस्थापन का पालन करने और आरबीसी क्षेत्र के साथ तुलना करने के लिए आवश्यक है।
2. सुनिश्चित करें कि चुना गया सेल कवरस्लिप से अच्छी तरह से जुड़ा हुआ है और माप शुरू करने से पहले आरबीसी और संदर्भ क्षेत्रों ने क्रमशः आरबीसी सतह और कवरस्लिप का पालन किया है। नेत्रहीन रूप से गैर-पालन वाली कोशिकाओं की पहचान करें क्योंकि वे उच्च आसंजन दर (लगभग 80% -90%) के बावजूद समय के साथ आगे बढ़ेंगे।
3. आयाम का साइनसॉइडल फ़ंक्शन जोड़ें, _{0 =} 0.500 ± 0.001 μm और 1 Hz, 7 Hz, 14 Hz, 21 Hz, 28 Hz और 35 Hz की अलग-अलग आवृत्तियों के साथ, 6.3 rad/s, 169 rad/s, 88 rad/s, 132 rad/s, 176 rad/s, और 220 rad/s की अलग-अलग आवृत्तियों के साथ। पीजोइलेक्ट्रिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, जैसा कि पहले ^8,9 ^{प्रदर्शित किया} गया था।
4. पीजोइलेक्ट्रिक चरण का उपयोग करके, पीजोइलेक्ट्रिक विस्थापन की अनुमति देने के लिए स्टार्ट बटन दबाएं और आरबीसी क्षेत्र को जाल में रखें, नमूना को पहले से निर्धारित साइनसोइडल फ़ंक्शन का उपयोग करके आंदोलनों के चक्र में जमा करें। नमूना आंदोलन रिकॉर्ड करने के लिए 790 फ्रेम / सेकंड या उच्चतर पर छवियों का उत्पादन करने में सक्षम कैमरे का उपयोग करें। प्रयोग का एक योजनाबद्ध चित्र 2 में दिखाया गया है।
5. जबकि नमूना साइनसॉइडल आंदोलनों के लिए प्रस्तुत किया जाता है, आरबीसी सतह से जुड़े गोले को फंसाने के लिए ओटी को सक्रिय करें। प्रयोगों को करने के लिए चुने गए तापमान के बावजूद, कमरे का तापमान, 37 डिग्री सेल्सियस, या कोई अन्य तापमान, माप के दौरान भिन्नताओं से बचने के लिए तापमान की सावधानीपूर्वक निगरानी करें। ओटी बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले इन्फ्रारेड (1064 एनएम) लेजर से कोशिकाओं को लगभग कोई नुकसान या हीटिंग नहीं होती है।
विश्लेषण
1. समय के साथ प्रत्येक गोले की द्रव्यमान स्थिति के केंद्र को खोजने के लिए इमेजजे का उपयोग करके साइनसॉइडल आंदोलनों के दौरान प्राप्त छवियों का विश्लेषण करें।
  नोट: ये डेटा दोनों क्षेत्रों के बीच चरण और आयाम अंतर दिखाने में सक्षम प्लॉट उत्पन्न करने की अनुमति देते हैं। आरबीसी की विस्कोस्टिक प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए ऐसी जानकारी महत्वपूर्ण है।
2. प्रत्येक गोले के लिए द्रव्यमान का केंद्र प्राप्त करने के लिए, ImageJ सॉफ़्टवेयर खोलें। साइनसॉइडल आंदोलनों के दौरान प्राप्त पूरी फिल्म आयात करें।
3. छवि टैब में, समायोजित करें पर क्लिक करें, और तब थ्रेशोल्ड का चयन करें। थ्रेशोल्ड विंडो खुल जाएगी। B & W का चयन करें। यह पृष्ठभूमि को सफेद और गोले को काला कर देगा।
4. हिस्टोग्राम के तहत दोनों स्क्रॉलबार के साथ दहलीज को समायोजित करें ताकि दोनों गोले पिक्सेल की अधिकतम मात्रा के साथ दिखाई दें।
5. फ़ाइल > आयत पर क्लिक करके संदर्भ क्षेत्र का चयन करें। गोले का चयन करने के लिए एक आयत बनाएं। एक छवि में संदर्भ क्षेत्र का चयन करने के बाद, सुनिश्चित करें कि आयत भी फिल्म की अन्य सभी छवियों में उसी क्षेत्र का सही चयन करता है।
6. फिर, विश्लेषण टैब में, माप सेट करें पर क्लिक करें और द्रव्यमान केंद्र विकल्प का चयन करें।
7. विश्लेषण टैब पर फिर से क्लिक करें और कणों का विश्लेषण करें का चयन करें। एक नई विंडो खुलेगी। आकार और परिपत्रता को परिभाषित करें (गोले की त्रिज्या के आधार पर)। निम्न बॉक्स की जाँच करें : परिणाम प्रदर्शित करें और परिणाम साफ़ करें. अंत में, सभी छवियों को संसाधित करने के लिए ओके पर क्लिक करें।
8. द्रव्यमान के केंद्र के लिए xy निर्देशांक के साथ एक तालिका वाली एक नई विंडो दिखाई देगी। इन निर्देशांक मानों को .txt फ़ाइल के रूप में सहेजें. आरबीसी सतह से जुड़े अन्य गोले के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।
9. दोनों क्षेत्रों के लिए चरण में आयाम और अंतर प्राप्त करने के लिए, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें। पहले से प्राप्त .txt फ़ाइलें आयात करें.
10. तीन स्तंभों के साथ एक नई तालिका बनाएँ. पहले कॉलम (c0) में फ्रेम की संख्या जोड़ें, दूसरे कॉलम (c1) में संदर्भ क्षेत्र के लिए x निर्देशांक जोड़ें, और तीसरे कॉलम (c2) में, RBC सतह से जुड़े गोले के लिए x निर्देशांक जोड़ें।
  नोट: इस उदाहरण में, जैसा कि साइनसॉइडल आंदोलनों को केवल एक्स-अक्ष में किया गया था, केवल दोनों क्षेत्रों के लिए एक्स निर्देशांक का उपयोग करना आवश्यक है।
11. इसके बाद, समय के साथ फ्रेम को सहसंबंधित करें। Windows > फ़ॉर्मूला प्रविष्टि पर क्लिक करें. फॉर्मूला प्रविष्टि नामक एक नई विंडो खुल जाएगी। इस विंडो में, आठ अलग-अलग समीकरणों को स्थापित करना संभव है, उनमें से प्रत्येक एक विशिष्ट कुंजी (एफ 1 से एफ 8 तक) में है।
12. F1 का चयन करें, निम्न सूत्र टाइप करें:
  c 3 = c0 / (कैमरा एफपीएस)
  रन पर क्लिक करें। यह तालिका (कॉलम 4) में एक समय के लिए एक नया कॉलम बनाएगा।
13. प्रत्येक फ़्रेम के x निर्देशांक मान को उसके संबंधित माध्य मान से घटाएँ। ऐसा करने के लिए, सूत्र प्रविष्टि पर किन्हीं दो कुंजियों को निर्दिष्ट करें और प्रत्येक कुंजी के लिए निम्न समीकरण टाइप करें:
  c 4 = (c 1 - माध्य (c 1)) और c 5 = (c 2 - माध्य (c2))
  रन बटन पर क्लिक करें। परिणाम क्रमशः संदर्भ और आरबीसी क्षेत्रों के लिए कॉलम 5 और 6 में दिखाई देंगे।
14. द्रव्यमान मानों के केंद्र को पिक्सेल से माइक्रोमीटर में परिवर्तित करें। इसके लिए, सूत्र प्रविष्टि पर किसी अन्य कुंजी का उपयोग करें और निम्न समीकरण टाइप करें:
  c 4 = c 4 / रूपांतरण संख्या
  कॉलम 5 के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएं।
  नोट: रूपांतरण एक माइक्रोमीटर स्केल / रूलर का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है और माप के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही माइक्रोस्कोप सेटअप के साथ इसकी छवि प्राप्त करता है (एक ही उद्देश्य लेंस सहित)। यह प्रक्रिया माइक्रोस्कोप अंशांकन के दौरान की जा सकती है। इस प्रकार एक पिक्सेल/माइक्रोमीटर संबंध प्राप्त किया जाता है।
15. y-अक्ष पर दोनों गोलों के द्रव्यमान के केंद्र और x-अक्ष पर समय के साथ एक भूखंड उत्पन्न करें। इसके लिए गैलरी > लीनियर एंड स्कैटर पर क्लिक करें। एक नई विंडो खुलेगी। x-अक्ष के लिए समय स्तंभ का चयन करें और y-अक्ष में संदर्भ और RBC गोले दोनों के लिए माइक्रोमीटर में द्रव्यमान के केंद्र के स्तंभों का चयन करें।
16. प्लॉट में, केवल पहली कोणीय आवृत्ति (6.3 rad/s) से संबंधित डेटा का चयन करें। चित्रा 3 में इंगित उपकरणों का उपयोग करें।
17. वह समीकरण परिभाषित करें जो संदर्भ क्षेत्र के लिए डेटा वक्र समायोजित करता है. इसके लिए कर्व फिट > जनरल और फिट 1 पर क्लिक करें, संदर्भ क्षेत्र की स्थिति से संबंधित डेटा के बॉक्स का चयन करें, और फिर परिभाषित करें पर क्लिक करें। समीकरण को परिभाषित करने के लिए एक नई विंडो खुल जाएगी। संदर्भ क्षेत्र की स्थिति (t) का वर्णन किसके द्वारा किया गया है?
  ξ(t) = ξ₀cos(ωt)
  जहां नमूने का साइनसॉइडल आंदोलन है, वहीं कोणीय आवृत्ति है और टी एस में समय है। इस समीकरण को विश्लेषण सॉफ्टवेयर में स्थानांतरित करना, यह निम्नानुसार दिखेगा:
  , जहां m1 है, m2 f है, m0 समय t है, और m3 t = 0 के लिए कोसाइन फ़ंक्शन का चरण है।
18. प्लॉट से m1, m2, और m3 के मानों का अनुमान लगाएं। समीकरण को परिभाषित करने के बाद, ओके पर क्लिक करें। डेटा समीकरण के आधार पर फिट किया जाएगा और एक छोटे वर्ग के साथ एक वक्र m1, m2 और m3 के मानों के साथ ग्राफ ़ में दिखाई देगा।
19. उस समीकरण को परिभाषित करें जो RBC क्षेत्र के लिए डेटा वक्र समायोजित करता है. इसके लिए, कर्व फिट > जनरल पर क्लिक करें और उस समीकरण को परिभाषित करें जो डेटा के लिए वक्र को समायोजित करेगा। RBC गोले की स्थिति (t) किसके द्वारा दी गई है?
  
  जहां 'चरण-आयाम से बाहर है, और φ चरण कोण से बाहर है। इस सूत्र को विश्लेषण सॉफ्टवेयर में ट्रांसपोज़ करना, यह निम्नानुसार दिखेगा:
  , जहां एम 1, एम 2, और एम 3 संदर्भ क्षेत्र के वक्र फिट में प्राप्त मान हैं। m4 का मान '' है और m5 का φ है।
20. प्लॉट से m4 और m5 के मानों का अनुमान लगाएं। सूत्र को परिभाषित करने के बाद, OK पर क्लिक करें। डेटा समीकरण के आधार पर फिट किया जाएगा, और एक छोटे वर्ग के साथ एक वक्र ग्राफ में m4 और m5 के मानों के साथ दिखाई देगा।
21. इसके बाद, वक्र फिटिंग से प्राप्त डेटा को उनके संबंधित कॉलम में जोड़ने के लिए एक नई तालिका बनाएं। निम्नलिखित मापदंडों के लिए पांच अलग-अलग कॉलम परिभाषित करें: कोणीय आवृत्ति, आयाम (संदर्भ क्षेत्र), प्रारंभिक समय, आयाम (आरबीसी क्षेत्र), और चरण कोण से बाहर। अन्य सभी आवृत्तियों के लिए एक ही प्रक्रिया निष्पादित करें।
22. भंडारण (K') और हानि स्थिरांक (K") ज्ञात करने के लिए निम्न समीकरणों का उपयोग करें:
  
  जहां ओटी_ओटीलोचदार स्थिरांक है और स्टोक्स ड्रैग गुणांक β है। समीकरणों को विश्लेषण सॉफ्टवेयर में स्थानांतरित करना, यह निम्नानुसार दिखेगा:
  और
  
  , जहां β और �_ओटीको सिस्टम में पाए जाने वाले मूल्यों द्वारा प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता है।
23. K के लिए x-अक्ष और K के लिए y-अक्ष का उपयोग करके एक ग्राफ़ पर परिणामों को प्लॉट करें (चित्र 4)।

6. समग्र सेल फॉर्म फैक्टर प्राप्त करने के लिए डीएम प्रयोग और विश्लेषण।

वीडियो अधिग्रहण
1. कवरस्लिप से जुड़े एक पृथक सेल की खोज के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पीजोइलेक्ट्रिक चरण को xy दिशा में ले जाएं। आरबीसी सतह पर ज्ञात व्यास के पॉलीस्टाइनिन गोले को फंसाएं और संलग्न करें। पीजोइलेक्ट्रिक चरण का उपयोग करके, कोशिका को विकृत करने के लिए, आरबीसी सतह से जुड़े फंसे मोती को थोड़ा स्थानांतरित करें, और फिर मोती को कवरस्लिप से संलग्न करें।
  नोट: ओटी माप से एक ही सेल का उपयोग करना भी संभव है।
2. केंद्रित छवि खोजने के लिए जेड-अक्ष स्थिति बदलें, जहां फोकस प्लेन चुने हुए सेल के बीच में है। यह छवि सेल के केंद्र में ग्रे स्तर के साथ छोटे कंट्रास्ट को प्रस्तुत करती है जो सेल (पृष्ठभूमि) के बाहर ग्रे स्तर के बराबर होती है।
3. जब स्थिति तय हो जाती है, तो 25 एफपीएस की फ्रेम दर पर 8-बिट और 256 पिक्सेल x 256 पिक्सेल पर लगभग 5,000 छवियों के साथ पूरे सेल की एक फिल्म बनाने के लिए कैमरा सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। फिर, चुने हुए सेल के लिए एक डीफोकस्ड छवि प्राप्त करने के लिए जेड-अक्ष स्थिति 2 μm नीचे या ऊपर ले जाएं। इस स्थिति के लिए चलचित्र बनाने के लिए पैरामीटर्स दोहराएँ.
4. अंत में, जेड-अक्ष स्थिति को बदलने के बिना, एक ही प्रक्रिया को दोहराने और छवि पृष्ठभूमि की एक फिल्म बनाने के लिए कोशिकाओं के बिना एक क्षेत्र की खोज करें।
विपरीत छवि अधिग्रहण।
1. तीन फिल्मों में से प्रत्येक को तीन औसत छवियों में परिवर्तित करें। इमेजजे का उपयोग करके, फिल्मों में से एक का चयन करें, जेड प्रोजेक्ट > इमेज > स्टैक्स पर क्लिक करें और औसत तीव्रता विकल्प चुनें। अन्य फिल्मों के लिए अपनी संबंधित छवियों को प्राप्त करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
2. सभी प्राप्त छवियों को 8-बिट्स से फ्लोट पॉइंट 32-बिट्स में बदलें। ImageJ का उपयोग करके, छवि > टाइप > 32-बिट्स पर क्लिक करें। फिर, माप का विश्लेषण करें > सेट करें पर क्लिक करें और माध्य ग्रे मान विकल्प चुनें। अंत में, माप का विश्लेषण करें पर फिर > क्लिक करें।
3. इसके बाद, प्रोसेस > इमेज कैलकुलेटर पर क्लिक करें और फोकस की गई छवि को पृष्ठभूमि छवि से विभाजित करें। इस परिणाम के लिए, केंद्रित छवि के ग्रे स्तर के औसत मूल्य को गुणा करें। प्रक्रिया > गणित गुणा पर क्लिक करके औसत मान प्राप्त >।
4. औसत मान प्राप्त करने के लिए, फ़ोकस की गई छवि चुनें, और उसके बाद माप का विश्लेषण करें पर क्लिक >. प्रतिनिधि छवि के लिए, ग्रे स्तर का औसत मूल्य 69,199 है। डीफोकस्ड छवि के लिए उपरोक्त प्रक्रियाओं को दोहराएं। इस मामले में, ग्रे स्तर का औसत मूल्य 69,231 है। चित्रा 5 प्रक्रिया से पहले और बाद में केंद्रित और डीफोकस्ड छवियों को दर्शाता है।
5. ऑपरेशन के दौरान छवियां दृश्य कंट्रास्ट खो सकती हैं। छवियों को बेहतर ढंग से विज़ुअलाइज़ करने के लिए, इमेज > > ब्राइटनेस /कंट्रास्ट समायोजित करें पर क्लिक करें और ऑटो विकल्प का चयन करें।
6. इसके बाद, छवि कंट्रास्ट खोजने के लिए, निम्न संबंध का उपयोग करें:
  , जहां एन _{आईएमजी} सेल का ग्रे स्तर है, एन₀ सेल के बाहर ग्रे स्तर है, और शून्य प्रकाश तीव्रता के लिए ग्रे स्तर के अनुरूप एक निरंतर पैरामीटर है जो कैमरे पर निर्भर करता है।
7. मान बी खोजने के लिए, प्रकाश की तीव्रता को मापने के लिए एक पावर मीटर का उपयोग करें। प्रकाश तीव्रता के प्रत्येक मान के लिए, एक वीडियो रिकॉर्ड किया जाना चाहिए; इस प्रकार, विभिन्न तीव्रता मान ग्रे के विभिन्न स्तरों से संबंधित हो सकते हैं। अंत में, एक रैखिक फिट प्राप्त करें और बी को शून्य प्रकाश तीव्रता¹⁵ से संबंधित करें।
8. N₀ का मान ज्ञात कीजिए, बहुभुज चयन चिह्न पर क्लिक करें और चित्र 6 में दिए गए बहुभुज की तरह बहुभुज आरेखित करें। फिर, विश्लेषण टैब पर क्लिक करें और चयनित क्षेत्र के लिए औसत ग्रे स्तर खोजने के लिए माप का चयन करें। प्रत्येक छवि पिक्सेल के एक सेट द्वारा बनाई जाती है और प्रत्येक पिक्सेल में एक निश्चित ग्रे स्तर होता है। छवि बनाने वाले सभी पिक्सेल के कारण सभी ग्रे स्तरों का सेट एन_{आईएमजी} से मेल खाता है।
9. N _Img - N_o निर्धारित करने के लिए कंट्रास्ट समीकरण का उपयोग करें और प्रक्रिया > गणित > घटाव का चयन करके इसे निष्पादित करें। परिणाम को N₀ - B से विभाजित करें। अंत में, केंद्रित (सी 0) और डीफोकस्ड छवि (सी1) के लिए कंट्रास्ट खोजें।
ऊंचाई प्रोफ़ाइल प्राप्त करना
1. ऊंचाई प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए, पहले से वर्णित विधि¹³ का उपयोग करें। संक्षेप में, आरबीसी मोटाई प्राप्त करने के लिए हार्टले ट्रांसफॉर्म (एफएचटी) का उपयोग करें। ImageJ में, प्रक्रिया > FFT > FFT विकल्प पर क्लिक करें, और फिर FHT चुनें।
2. प्रक्रिया > गणित का उपयोग करके इमेजजे में छवियों C0 और C1 को घटाएं > निम्न प्रक्रिया के लिए छवि प्राप्त करने के लिए घटाएं , C = C0 - C1।
3. छवि सी के लिए, एफएफटी विकल्प > प्रक्रिया > एफएफटी पर क्लिक करें, और फिर छवि के हार्टले परिवर्तन करने के लिए एफएचटी चुनें। फिर, कस्टम-निर्मित प्लगइन डिवाइडक्यू 2 का उपयोग करके स्थानिक आवृत्ति क्यू² से विभाजित करें। प्लगइन > डिवाइडक्यू 2 पर क्लिक करें।
  नोट: फ़ाइल DivideQ2.class प्लगइन्स निर्देशिका में कॉपी किया जाना चाहिए जहां ImageJ स्थापित है। प्लगइन इमेजजे के प्लगइन फ़ोल्डर में शामिल होने के लिए एक .class फ़ाइल (पूरक फ़ाइल 1) के रूप में प्रदान किया जाता है।
4. फिर, सेल की ऊंचाई के आनुपातिक ग्रे स्तर के साथ एक छवि प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया > एफएफटी > एफएफटी का उपयोग करके व्युत्क्रम ट्रांसफॉर्म एफएचटी करें।
5. अंत में, निम्नलिखित स्थिरांक का उपयोग करके परिणामी छवि को गुणा करने के लिए प्रक्रिया > गणित > गुणा पर क्लिक करें:
  
  जिसे छवियों, नमूने और प्रयोगात्मक सेटअप¹³ की विशेषताओं के आधार पर परिभाषित किया गया है। यहाँ, n = 1.51 तेल अपवर्तक सूचकांक है, p = 0.0721 μm छवियों के माइक्रोमीटर और पिक्सेल के बीच संबंध है, त्रिभुज n = 0.058 RBC और जलीय मध्यम अपवर्तक सूचकांकों के बीच का अंतर है, फोकसिंग और डीफोकसिंग छवियों के बीच की दूरी (Z f1 - Z_f2) = 2μm, और छवियों का आकार, N 2 = 256 pxl².
6. ऊंचाई प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए परिणामी छवि का उपयोग करें (चित्रा 7)। परिणामी छवि का उपयोग इमेजजे में विभिन्न ऊंचाई प्रोफाइल का निरीक्षण करने के लिए किया जाता है। यह इस बात पर निर्भर करता है कि सेल में पीले ऊर्ध्वाधर रेखा को कहां रखा गया है, उदाहरण के लिए, चित्रा 7 में ऊर्ध्वाधर रेखा द्वारा सीमित ऊंचाई प्रोफ़ाइल प्राप्त की जाती है, Ctrl + K दबाकर इसका निरीक्षण करें।
फॉर्म फैक्टर
1. आरबीसी ऊंचाई प्रोफ़ाइल वाली छवि को खोजने के बाद, इमेजजे में दो छवियों का एक सेट बनाने के लिए 2 μm डिफोकस्ड कंट्रास्ट का उपयोग करें। छवि > ढेर पर क्लिक करें, और उसके बाद स्टैक करने के लिए छवियों विकल्प का चयन करें। प्रपत्र कारक ढूँढने के लिए, स्टैक का विश्लेषण करने के लिए ImageJ अनुकूलित मैक्रो का उपयोग करें. ImageJ अनुकूलित मैक्रो पूरक फ़ाइल 2 के रूप में डाउनलोड के लिए उपलब्ध है।
  नोट: प्रोग्राम सेल किनारों को निर्धारित करने के लिए डीफोकसिंग छवि का उपयोग करता है। यह तब प्रत्येक क्षैतिज स्थिति के लिए ऊंचाई प्रोफ़ाइल वाली छवि का उपयोग करके परिधि निर्धारित करता है। किनारों के अलावा, यह परिधि को निर्धारित करता है, साथ ही परिधि का व्युत्क्रम भी। व्युत्क्रम परिधि मानों का योग, पिक्सेल मोटाई से गुणा किया जाता है, जो फॉर्म कारक के व्युत्क्रम से मेल खाता है।
2. प्रोग्राम में पिक्सेल/माइक्रोमीटर संबंध सम्मिलित करें. माइक्रोस्कोप उद्देश्य अंशांकन प्रयोग से इस मान को प्राप्त करें। उपयोग किए गए उदाहरण में, मान 13.87 पिक्सेल /
3. स्टैक की पहली छवि में पीली रेखा डालने के लिए क्षैतिज प्रारंभिक स्थिति चुनें। सेल की शुरुआत से पहले लाइन शुरू करें और इसे सेल की ऊर्ध्वाधर सीमाओं से परे खींचें। उदाहरण में, पीली रेखा की लंबाई 153 पिक्सेल है और प्रारंभिक स्थिति i = 70, y1 = 80 और i = 70, और y2 = 195 के बीच है। फिर, पीली रेखा को क्षैतिज रूप से तब तक हिलाएं जब तक कि अंतिम स्थिति f = 245, y1 = 80 और f = 245, और y2 = 195 न हो।
4. अंत में, सेल किनारों, परिधि और परिधि के व्युत्क्रम को खोजने के लिए, मैक्रो टैब का चयन करें और मैक्रो चलाएं पर क्लिक करें। मैक्रो किनारों की स्थिति, परिधि और परिधि के व्युत्क्रम और विश्लेषण किए गए सेल की एक छवि के साथ एक तालिका प्रदान करेगा। जाँचें कि क्या इस छवि के किनारे चित्रा 7 के किनारों के समान हैं, अन्यथा, प्रक्रिया को दोहराएं।
5. प्रपत्र गुणांक⁸ ज्ञात करने के लिए परिधि के व्युत्क्रम के योग का उपयोग करें।

7. नरम ग्लासी रिओलॉजी मॉडल और प्रयोगात्मक विश्लेषण

एक तालिका में प्रयोगात्मक डेटा को व्यवस्थित करना
1. फ़ाइल टैब पर क्लिक करके विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में एक नई तालिका बनाएँ। निम्नलिखित मापदंडों के लिए 10 अलग-अलग कॉलम (c0 से c9 तक) निर्धारित करें: कोणीय आवृत्तियों का उपयोग (rad/s): c0; प्रत्येक कोणीय आवृत्ति के लिए प्राप्त K' (pN/μm) मान: c1; ErrK': c2; प्रत्येक कोणीय आवृत्ति के लिए प्राप्त K" (pN/μm) मान: c3; ErrK": c4; प्रत्येक कोणीय आवृत्ति के लिए प्राप्त G'(Pa) मान: c5; ErrG': c6; प्रत्येक कोणीय आवृत्ति के लिए प्राप्त जी " (पीए) मान: सी 7; ErrG": c8 और F_f अपनी संबंधित त्रुटि के साथ: c9 (चित्रा 8)। निम्न स्तंभों को पॉप्युलेट करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें:
  c5 = (3 x c1) / (8 x 1.28 x 0.087)
  c6 = (3 / (8 x 0.087 x 1.28)) x sqrt (c2^2 + (c1 x 0.01 / 1.28)^2 + (c1 x 0.008 / 0.087) ^ 2)
  c7 = (3 x c3) / (8 x 1.28 x 0.087)
  C8 = (3 / (8 x 0.087 x c4)) x sqrt (c4^2 + (c3 x 0.01 / 1.28)^2 + (c3 x 0.008 / 0.087)^2)
वक्र G ' (q) बनाम G " (q) का प्लॉटिंग
1. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में वक्र G' बनाम G' (q) उत्पन्न करने के लिए, पिछली तालिका से डेटा का उपयोग करें। गैलरी > रैखिक पर क्लिक करें और स्कैटर प्लॉट प्रारूप चुनें।
2. एक नई विंडो खुलेगी। X-अक्ष के रूप में G" स्तंभ और y-अक्ष के रूप में G' स्तंभ का चयन करें। अंत में, ग्राफ प्राप्त करने के लिए प्लॉट बटन पर क्लिक करें।
3. प्लॉट में त्रुटि पट्टियाँ जोड़ने के लिए, प्लॉट विंडो पर क्लिक करें, और फिर प्लॉट > त्रुटि पट्टियाँ पर क्लिक करें। एक नई विंडो खुलेगी। सबसे पहले, Y Err विकल्प चिह्नित करें। एक और विंडो, जिसे एरर बार सेटिंग्स कहा जाता है, खुल जाएगी।
4. मान के % पर क्लिक करें, डेटा स्तंभ का चयन करें, और फिर स्तंभ ErrG पर क्लिक करें। अंत में, ओके > प्लॉट पर क्लिक करें, वाई-मानों के लिए त्रुटि पट्टियाँ दिखाई देंगी। अब एक्स एर्र वर्ग और ईआरजी के लिए सही कॉलम का चयन करके एक्स-अक्ष मानों के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएं"। अंतिम प्लॉट चित्र 9 में दिखाए गए के समान होगा।
नरम ग्लासी रियोलॉजी मॉडल के लिए मापदंडों को फिट करना
नोट: डेटा विश्लेषण को दो भागों में विभाजित किया गया है: 1) पैरामीटर Γ और जी _एम प्राप्त करने के लिए जी ' () बनाम जी " प्लॉट को फिट करने वाला वक्र; 2) शक्ति विधि प्रतिपादक α प्राप्त करने के लिए आवृत्ति के फलन के रूप में वक्र फिटिंग G' (q) और G ' (q)।
1. पैरामीटर Γ और G _m को प्राप्त करने के लिए G ' (q) बनाम G " () प्लॉट को फिट करना।
  1. कर्व फिट टैब पर क्लिक करें, फिट 1 का चयन करें। एक नई विंडो खुलेगी। वर्ग का चयन करें और परिभाषित करें बटन पर क्लिक करें। सामान्य वक्र फिट परिभाषा नामक एक विंडो दिखाई देगी। निम्न समीकरण टाइप करें:
    m1 + m0/m2
    जहां m1 = 61.576; m2 = 1, 1 x ^10-5 की स्वीकार्य त्रुटि के साथ। यहाँ m0 G का प्रतिनिधित्व करता है", m1 G_m का प्रतिनिधित्व करता है और m2 Γ का प्रतिनिधित्व करता है।
    नोट: एम 1 और एम 2 के लिए वक्र फिट परिभाषा के दौरान उनके संबंधित मूल्यों का अनुमान लगाना आवश्यक है। ऊपर दिए गए अनुमान दिखाए गए उदाहरण प्रयोग पर आधारित थे। प्रयोगों में, प्लॉट में देखे गए मूल्यों के अनुसार संख्याओं का अनुमान लगाएं।
  2. दोनों खिड़कियों में ओके बटन पर क्लिक करें और फिटिंग दिखाई देगी, जैसा कि चित्र 10 में दिखाया गया है - एक काला वक्र। प्लॉट के साथ दिखाई देने वाली वक्र फिट तालिका में सूचीबद्ध m1 और m2 के लिए सही मानों की जाँच करें।
2. वक्र फिटिंग G ' और G " कोणीय आवृत्ति के फलन के रूप में
  1. इसके बाद, दो अन्य प्लॉट बनाएं, अर्थात्, G' का फलन ' और 'G' का फलन ' त्रुटि पट्टियों को केवल y-अक्ष पर रखें, जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था।
  2. वक्र फिटिंग प्रक्रिया को दोहराएं लेकिन अब वक्र फिट चयन में, जी " विकल्प का चयन करें, और फिर जनरल फिट > कर्व परिभाषा में, निम्नलिखित समीकरण लिखें:
    
    इस मामले में, m1 को G " का मान माना जाता है" (?) = 23.683 Pa, जब ⇒ = 6.3 rad/s; एम 2 को 0.5 होने का अनुमान लगाया गया था (याद रखें कि एम 2 प्रतिपादक α है और 0 और 1 के बीच भिन्न होता है)। चित्र 10 में m2 के परिणाम के अनुसार Γ = 2.0293 का मान सम्मिलित करें।
  3. विकल्प वजन डेटा चिह्नित करें। इन सभी प्रक्रियाओं के बाद, ओके पर क्लिक करें, और चित्र 11 में एक के समान एक वक्र फिटिंग - एक नीला वक्र दिखाई देगा। α, α = 0.63 ± 0.02 और G 0, G 0 = (3.7 ± _0.3)Pa के मान दिखाई देंगे। अगले वक्र को फिट करने के लिए इन मानों का उपयोग करें, G' (?)।
  4. अगले वक्र पर क्लिक करें, वक्र-फिटिंग प्रक्रिया को दोहराएं लेकिन अब जनरल फिट कर्व परिभाषा में, निम्नलिखित समीकरण लिखें:
    
    इस मामले में, एम 3 पहले से प्राप्त मूल्य की पुष्टि करने के लिए α का अनुमानित मूल्य है। G ₀ = 3.703 और G ' (q) = 23.683 Pa के मान का प्रयोग करें जब ⇒ = 6.3 rad/s हो।
  5. फिर, स्वीकार्य त्रुटि के रूप में 1 x ^10-5 जोड़ें और विकल्प वजन डेटा चिह्नित करें। इन सभी प्रक्रियाओं के बाद, ओके पर क्लिक करें, और चित्र 11 में एक के समान एक वक्र फिटिंग - एक हरा वक्र दिखाई देगा।

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Representative Results

चित्रा 1 रियोलॉजी माप के लिए उपयोग किए जाने वाले ओटी सिस्टम के योजनाबद्धता का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 2 दोनों क्षेत्रों के साथ माइक्रोरियोलॉजी प्रयोग के योजनाबद्धता को दर्शाता है और एक प्रतिनिधि आरबीसी भी दिखाया गया है। चित्रा 3 समय के कार्य के रूप में दोनों क्षेत्रों के आयामों के लिए एक विशिष्ट वक्र दिखाता है जब साइनसॉइडल आंदोलनों को पीजोइलेक्ट्रिक चरण द्वारा उत्पादित किया जाता है। जबकि संदर्भ क्षेत्र (चित्रा 3 - लाल वक्र) चरण आंदोलन के बाद झूलता है, आरबीसी क्षेत्र (चित्रा 3 - एक नीला वक्र) एक अलग आयाम और चरण के साथ झूलता है। इन मापदंडों को मापकर, नमूने में विभिन्न आरबीसी के लिए जटिल लोचदार स्थिरांक के * () निर्धारित करना संभव है। चित्र 4 भंडारण लोचदार स्थिरांक K के लिए एक विशिष्ट भूखंड दिखाता है जो हानि लोचदार स्थिरांक K " () के एक कार्य के रूप में है। देखी गई रैखिक निर्भरता दर्शाती है कि आरबीसी सतह को एक नरम कांच की सामग्री माना जा सकता है। इसके बाद, समग्र सेल फॉर्म फैक्टर, एफ प्राप्त करने के लिए, एक डीएम प्रक्रिया आवश्यक है और चित्रा 5, चित्रा 6 और चित्रा 7 में उद्देश्य के लिए कुछ आवश्यक चरण शामिल हैं। फिर, बलों और विकृतियों को तनाव और उपभेदों में बदलने के लिए, K * (?) को G * () में बदलना आवश्यक है।

जटिल आरबीसी लोचदार स्थिरांक को K* (q) = K ' (q) + iK " (q) के रूप में परिभाषित किया गया है। इसके अलावा, K* (q) RBC जटिल कतरनी मापांक G* (q) = G' (q) + iG" (q) से संबंधित है। G' (q) और G ' (q) क्रमशः RBC कतरनी भंडारण और हानि मोडुलिन हैं। K* और G* के बीच का संबंध किसके द्वारा दिया गया है?

Equation 12

जहां एफ_एफ एक फॉर्म फैक्टर है जो आरबीसी ज्यामिति पर निर्भर करता है, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, और ζ आरबीसी झिल्ली मोटाई है, जिसे पहले ζ = (0.087 ± 0.009) μm ^8,15 के रूप में निर्धारित किया गया था।

इसके अलावा, ^8,9 समीकरणों के माध्यम से भंडारण G' (q) और G " (q) हानि कतरनी मोडुलिन क्रमशः भंडारण K ' (q) और हानि K " () लोचदार स्थिरांक से संबंधित हैं।

Equation 13 और Equation 14

निम्नलिखित समीकरण^8,9 के अनुसार, क्रमशः G' और G' (q), Err G' और Err G' के लिए मानक त्रुटियों का पता लगाने के लिए^, K' (q) और K ' (q) के परिणामों के साथ अनिश्चितता समीकरणों के प्रसार का उपयोग करें:

Equation 15
Equation 16 .

नरम ग्लासी रिओलॉजी सिद्धांत के अनुसार, आरबीसी इमल्शन, पेस्ट और स्लरी ^8,9 जैसे विस्कोस्टिक सामग्री की तरह व्यवहार करते हैं और उनका भंडारण और हानि मोडुलिन निम्नलिखित समीकरणों का पालन करते हैं:
Equation 17

इस प्रकार, Equation 18 जहां जी _एम कोशिका झिल्ली कतरनी मापांक है, जी 0 कम आवृत्ति भंडारण मापांक है, Γ अनुपात Equation 19 है, α नरम ग्लासी रियोलॉजी मॉडल का शक्ति-कानून प्रतिपादक है, और 0_{= 1}रैड / एस ^8,9।

एफ _एफ के लिए पाए गए मान और आरबीसी सतह मोटाई ζ का भी उपयोग किया गया था (87 ± 8 एनएम ^8,9,15 पर अनुमानित)। परिणाम चित्रा 8, चित्रा 9, और चित्रा 10 में दिखाए गए हैं। फिर, जी और जी " के बीच रैखिक निर्भरता इस परिकल्पना के अनुरूप है कि आरबीसी सतहों को नरम कांच की सामग्री के रूप में मॉडलिंग किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्लॉट के रैखिक फिट से, जी _एम का मान प्राप्त किया जा सकता है, और इस मान को जी के नरम ग्लासी रिओलॉजी वक्र फिट में पेश करके, जी₀ और α के मान निर्धारित किए जाते हैं (चित्रा 11 - एक नीला वक्र)। इसके अलावा, जी ₀ के लिए प्राप्त परिणाम का उपयोग करने और इसे जी के नरम ग्लासी रिओलॉजी वक्र फिट में जोड़ने के बाद, प्रतिपादक के लिए एक ही मूल्य त्रुटि सलाखों (चित्रा 11 - एक हरा वक्र) के भीतर प्राप्त किया जाता है।

चित्रा 1: ओटी माइक्रोस्कोप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। पूरी प्रणाली एक एंटी-कंपन टेबल पर बनाई गई है। लेजर को कम से कम दो अलग-अलग डाइक्रोइक दर्पणों (सफेद) का उपयोग करके संरेखित किया जाता है और एक अन्य डाइक्रोइक दर्पण (हल्के नीले) का उपयोग करके माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस के पीछे के प्रवेश द्वार पर निर्देशित किया जाता है। एक पीजोइलेक्ट्रिक चरण और कंप्यूटर से जुड़ा एक डिजिटल वैज्ञानिक कैमरा भी आवश्यक है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 2: माइक्रोरियोलॉजी प्रयोग के योजनाबद्ध। संदर्भ क्षेत्र (गहरे भूरे रंग का) कवरस्लिप से जुड़ा होता है और आरबीसी क्षेत्र (नीला) एरिथ्रोसाइट सतह (लाल) से जुड़ा होता है और ओटी द्वारा फंस जाता है (लेजर चालू होने पर आड़ू त्रिकोण द्वारा इंगित किया जाता है)। जाल में आरबीसी गोले की संतुलन स्थिति है; नमूने का साइनसॉइडल आंदोलन है और एक्स सेल विरूपण है। योजनाबद्ध छवि बायोरेंडर में बनाई गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 3: समय के साथ दोनों क्षेत्रों के आयामों (μm) को दर्शाते हुए प्लॉट जब साइनसॉइडल आंदोलन पीजोइलेक्ट्रिक चरण द्वारा उत्पन्न होते हैं। संदर्भ क्षेत्र (लाल वक्र) चरण आंदोलन के बाद झूलता है, जबकि आरबीसी क्षेत्र (नीला वक्र) एक अलग आयाम और चरण के साथ झूलता है। दाईं ओर हरा तीर डेटा चयन उपकरण को इंगित करता है जबकि पीला तीर ज़ूम चयन उपकरण को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 4: आरबीसी माइक्रोरियोलॉजी परिणाम। नमूने में विभिन्न आरबीसी के लिए हानि लोचदार स्थिरांक के कार्य के रूप में लोचदार स्थिरांक स्टोर करें (एन = तीन अलग-अलग नमूनों से 10 अलग-अलग कोशिकाएं)। डेटा बिंदु प्रयोगात्मक सेटअप में उपयोग की जाने वाली प्रत्येक कोणीय आवृत्ति के लिए प्राप्त उनके संबंधित त्रुटि सलाखों (माध्य की मानक त्रुटि) के साथ K ' (y-अक्ष) और K " (x-अक्ष) दोनों के माध्य मानों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 5: DM एक RBC पर लागू होता है। (A) डिफोकस्ड छवि, आकार = 2 μm. (B) फ़ोकस में छवि. (सी) पृष्ठभूमि छवि। प्रत्येक छवि (ए) और (बी) को पृष्ठभूमि छवि (सी) से विभाजित करना, और फिर प्रत्येक छवि के औसत ग्रे मान से गुणा करना, छवियों (डी) और (ई) को प्राप्त करना संभव है। स्केल बार: 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 6: पृष्ठभूमि ग्रे स्तर एन₀। इमेजजे (ए) में प्रतिनिधि छवि खोलने के बाद, पृष्ठभूमि ग्रे स्तर और परिणाम (बी) के औसत मूल्य को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले क्षेत्र (आरबीसी सेल के चारों ओर पीला ज्यामितीय आंकड़ा) का चयन करें। ए में पीला चयन करने के लिए, छवि जे के बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करें (हरे तीर के साथ इंगित)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 7: विकृत आरबीसी के लिए ऊंचाई प्रोफ़ाइल। ऊंचाई प्रोफ़ाइल (बाएं) छवि की ऊर्ध्वाधर पीली रेखा (दाएं) के साथ दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 8: विश्लेषण सॉफ्टवेयर में परिणामों की एक विशिष्ट तालिका का प्रतिनिधि स्क्रीनशॉट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 9: आरबीसी विस्कोस्टिक पैरामीटर। नमूने में विभिन्न आरबीसी के लिए हानि कतरनी मापांक के एक फ़ंक्शन के रूप में कतरनी मापांक स्टोर करें (एन = तीन अलग-अलग नमूनों से 10 अलग-अलग कोशिकाएं)। डेटा बिंदु प्रयोगों में उपयोग की जाने वाली प्रत्येक कोणीय आवृत्ति के लिए प्राप्त उनकी संबंधित त्रुटि पट्टियों (माध्य की मानक त्रुटि) के साथ दोनों, जी ' (वाई-अक्ष) और जी " (एक्स-अक्ष) के माध्य मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 10: जी " (पीए) के एक फ़ंक्शन के रूप में जी ' (पीए) का वक्र फिट। रैखिक काली रेखा डेटा बिंदुओं के लिए फिट वक्र है। एन = तीन अलग-अलग नमूनों से 10 अलग-अलग कोशिकाएं। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 11: परिणामों के लिए नरम ग्लासी रियोलॉजी मॉडल को समायोजित करना। नमूने में विभिन्न आरबीसी के लिए कोणीय आवृत्ति के एक फ़ंक्शन के रूप में जटिल कतरनी मापांक (जी *)। प्लॉट में हरे रंग के घेरे जी के माध्य मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि नीले सर्कल जी के माध्य मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो उनके संबंधित त्रुटि सलाखों के साथ प्लॉट किए गए हैं। निरंतर हरी और नीली रेखाएं नरम ग्लासी रियोलॉजी मॉडल के लिए वक्र फिटिंग का प्रतिनिधित्व करती हैं। प्लॉट में पैरामीटर m 1, m 2 और m3 को दर्शाया गया है। जबकि m 1, G₀ है, m 2 और m3 प्रतिपादक हैं, α. N = तीन अलग-अलग नमूनों से 10 अलग-अलग कोशिकाएँ हैं। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: इमेजजे प्लगइन डिवाइडक्यू 2.class। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: ImageJ ने प्रपत्र कारक प्राप्त करने के लिए मैक्रो अनुकूलित किया. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, आरबीसी के विस्कोस्टिक गुणों को मात्रात्मक रूप से मैप करने के लिए ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और डीफोकसिंग माइक्रोस्कोपी पर आधारित एक एकीकृत विधि प्रस्तुत की जाती है। भंडारण और हानि कतरनी मोडुलिन के परिणाम, स्केलिंग प्रतिपादक के साथ जो आरबीसी के नरम ग्लासी रिओलॉजी की विशेषता है, निर्धारित किए जाते हैं। विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए इस प्रोटोकॉल का अनुप्रयोग, जैसे कि शारीरिक स्थिति⁸ में या पी फाल्सीपेरम इंट्रा-एरिथ्रोसाइटिक चक्र⁹ के प्रत्येक चरण के साथ पहले ही किया जा चुका है।

साहित्य में संदर्भ आरबीसी रिओलॉजी में विसंगतियों की ओर इशारा करते हैं, आंशिक रूप से सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है जो माप ^6,7 के दौरान ठीक से ध्यान में नहीं रखा जाता है। गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन का उपयोग करते हुए, आरबीसी भंडारण और हानि मोडुलिन के मान 1-100 हर्ट्ज⁶ की आवृत्ति सीमा में 0.01-1 पीए से रिपोर्ट किए गए थे। एक अन्य अध्ययन में, ऑप्टिकल चुंबकीय घुमावदार साइटोमेट्री का उपयोग करके, स्पष्ट जटिल लोचदार मापांक⁷ निर्धारित किया गया था, लेकिन गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन मूल्यों से अलग हो गया; इस प्रकार, तुलनात्मक उद्देश्यों के लिए 84 के गुणक कारक का उपयोग किया गया था। वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद, इन अंतरों को एक नॉनइनवेसिव डिफोकसिंग माइक्रोस्कोपी तकनीक^11,12,13 का उपयोग करके आरबीसी फॉर्म फैक्टर को^{चिह्नित करके स्पष्ट} किया गया था। जटिल कतरनी मापांक, जो सेल सतहों की विशेषता है, केवल तभी प्राप्त किया जा सकता है जब ज्यामिति को^16,17 माना जाता है और यह हमेशा ठीक से नहीं किया जाता था।

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत एकीकृत पद्धति एक ही एकल सेल के लिए एक के बाद एक दोनों विधियों (ओटी माप और डीएम माप) को करने की अनुमति देती है। यह एक आबादी में विभिन्न कोशिकाओं के लिए ओटी माप करने की अनुमति देता है, और फिर एक ही सेल आबादी में अन्य कोशिकाओं के लिए डीएम माप करता है। अंतिम विकल्प शायद दोनों परिणामों में अधिक परिवर्तनशीलता पेश करेगा, लेकिन त्रुटियों को तदनुसार प्रचारित किया जा सकता है, इस तरह से कि परिणाम एक विशेष प्रयोगात्मक स्थिति के अनुरूप कोशिकाओं की दी गई आबादी में समग्र आरबीसी विस्कोस्टिक गुणों के साथ समग्र आरबीसी आकृति विज्ञान को सहसंबंधित करेंगे।

इस प्रोटोकॉल को निष्पादित करने के लिए मुख्य सीमा विधि को निष्पादित करने में आंतरिक कठिनाई है क्योंकि यह ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और डिफोकसिंग माइक्रोस्कोपी का एकीकरण है; इस प्रकार, वर्णित सभी चरणों को करने के लिए उपकरणों की उपलब्धता एक चुनौती हो सकती है। हालांकि, अगर किसी के पास ओटी सुविधा तक पहुंच है, तो अंततः प्रयोगों को करने के लिए सुविधा को अनुकूलित करना अधिक संभव है। यही वह जगह है जहां वर्तमान प्रोटोकॉल फिट बैठता है, न केवल माप और विश्लेषण करने के लिए हर कदम का विवरण देता है, बल्कि लोगों को स्क्रैच से सेटअप बनाने के बजाय इन ओटी सिस्टम को पहचानने और अपनाने में भी मदद करता है।

इसके अलावा, कवरलिप्स के लिए आरबीसी लगाव एक सीमित कारक बन जाता है क्योंकि वे गैर-अनुयायी कोशिकाएं हैं और ऐसे कदम माप में कठिनाइयों का परिचय दे सकते हैं, क्योंकि कुछ आरबीसी अलग हो सकते हैं। इस प्रकार, एक अच्छी तरह से पालन किए गए आरबीसी का चयन करना महत्वपूर्ण है। यह जांचने का एक तरीका है कि विकल्प सफल था या नहीं, माप के लिए नमूना तैयार करने के समय हो सकता है। ओटी-फंसे आरबीसी गोले को सेल की सतह पर रखने के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए नमूने को थोड़ा हिलाएं कि सेल मजबूती से तय है और ओटी-फंसे मोती के बाद स्थिति नहीं बदली है। यदि हां, तो नमूने में एक और सेल की तलाश करें। भविष्य में सुधार जैसे कि आरबीसी को एक साथ फंसाने और एक ही समय में रियोलॉजी माप करने के लिए दोहरी-बीम ओटी का उपयोग भी किया जा सकता है।

इसके अलावा, आरबीसी की एकल सेल-आधारित मात्रात्मक विस्कोस्टिक जानकारी निकालने की संभावना विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों को सक्षम करती है जो अभी ^8,9 का पता लगाना शुरू कर रहे हैं। इस प्रकार, प्रस्तुत विधि को अन्य फिजियो-पैथोलॉजिकल स्थितियों जैसे लोहे की कमी वाले एनीमिया और मधुमेह या आनुवंशिक रक्त रोगों जैसे सिकल सेल रोग और थैलेसीमिया के तहत आरबीसी यांत्रिक व्यवहार के लक्षण वर्णन तक बढ़ाया जा सकता है, उदाहरण के लिए। इस तरह का एक एकीकृत उपकरण विभिन्न विकृति वाले व्यक्तियों के रक्त प्रवाह में संशोधन के साथ आरबीसी विस्कोस्टिक गुणों में परिवर्तन को सहसंबंधित करने में सक्षम नवीन नैदानिक विधियों के विकास के लिए आधार प्रदान कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास इस पांडुलिपि में वर्णित उत्पादों में कोई वित्तीय हित नहीं है और खुलासा करने के लिए कुछ और नहीं है।

Acknowledgments

लेखक सभी महत्वपूर्ण सहायता के लिए CENABIO उन्नत माइक्रोस्कोपी सुविधा के सभी सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को ब्राजील की एजेंसियों कॉन्सेल्हो नेसियोनल डी डेसेनवोल्विमेंटो साइंटिफिको और टेक्नोलोजिको (सीएनपीक्यू), कोर्डेनाको डी एपरफेइकोमेंटो डी पेस्सोअल डी निवेल सुपीरियर (सीएपीएस) - फाइनेंशियल कोड 001, फंडाकाओ डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डो रियो डी जनेरियो (एफएपीईआरपी) और इंस्टीट्यूटो नेसियोनल डी सिओनोलोजिको और टेक्नोलोगिया डी फ्लुडोस कॉम्प्लेक्सोस (आईएनसीटी-एफसीएक्स) द्वारा समर्थित किया गया था। बीपी को एफएपीईआरजे से जेसीएनई अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm culture dishes	Corning	430165
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418
Coverslips	Knittel Glass	VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01
Glass-bottom dishes	MatTek Life Sciences	P35G-0-10-C
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
Immersion oil	Nikon	MXA22165
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE300
KaleidaGraph	Synergy Software	https://www.synergy.com/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	P5655
Microscope camera	Hamamatsu	C11440-10C
Na₂HPO₄	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich	BR717805-1EA
Objective lens	Nikon	PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2
Optical table	Thorlabs	T1020CK
OT laser	IPG Photonics	YLR-5-1064-LP
Polystyrene microspheres	Polysciences	17134-15
rubber ring	Forever Seals	NBR O-Ring
Silicone grease	Dow Corning	Z273554
Stage positioning	PI	P-545.3R8S
Pipette	Gilson	P1000

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References

Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).
Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).
Boal, D. Mechanics of the Cell. 2 edn. , Cambridge University Press. (2012).
Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).
Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).
Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).
Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).
Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).
Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).
Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5 (2016).
Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).

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Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

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Materials

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