Utvärdering av fotosyntetisk effektivitet i fotorespiratoriska mutanter genom klorofyllfluorescensanalys

Summary

Vi beskriver ett tillvägagångssätt för att mäta förändringar i fotosyntetisk effektivitet i växter efter behandling med låg_CO2 med klorofyllfluorescens.

Abstract

Fotosyntes och fotorespiration representerar de största kolflödena i växtens primära metabolism och är nödvändiga för växtöverlevnad. Många av de enzymer och gener som är viktiga för fotosyntes och fotorespiration har studerats väl i årtionden, men vissa aspekter av dessa biokemiska vägar och deras överhörning med flera subcellulära processer är ännu inte helt förstådda. Mycket av det arbete som har identifierat de gener och proteiner som är viktiga för växternas ämnesomsättning har utförts under mycket kontrollerade miljöer som kanske inte bäst representerar hur fotosyntes och fotorespiration fungerar under natur- och jordbruksmiljöer. Med tanke på att abiotisk stress resulterar i nedsatt fotosyntetisk effektivitet är utvecklingen av en skärm med hög genomströmning som kan övervaka både abiotisk stress och dess inverkan på fotosyntesen nödvändig.

Därför har vi utvecklat en relativt snabb metod för att screena för abiotiska stressinducerade förändringar av fotosyntetisk effektivitet som kan identifiera okarakteriserade gener med roller i fotorespiration med hjälp av klorofyllfluorescensanalys och låg CO_2-screening . Denna artikel beskriver en metod för att studera förändringar i fotosyntetisk effektivitet i överförda DNA (T-DNA) knockout-mutanter i Arabidopsis thaliana. Samma metod kan användas för screening av etylmetanesulfonat (EMS)-inducerade mutanter eller suppressorscreening. Genom att använda denna metod kan man identifiera genkandidater för vidare studier i växtens primära metabolism och abiotiska stressreaktioner. Data från denna metod kan ge insikt i genfunktion som kanske inte känns igen förrän exponering för ökade stressmiljöer.

Introduction

Abiotiska stressförhållanden som vanligtvis ses på jordbrukarens fält kan påverka avkastningen negativt genom att minska fotosyntetisk effektivitet. Skadliga miljöförhållanden som värmeböljor, klimatförändringar, torka, och jordens salthalt kan orsaka abiotiska påfrestningar som förändrar CO_{2-tillgängligheten} och minskar en växts svar på hög ljusstress. De två största markbundna kolflödena är fotosyntes och fotorespiration, som är avgörande för växttillväxt och grödor. Många av de viktiga proteiner och enzymer som är involverade i dessa processer har karakteriserats under laboratorieförhållanden och identifierats på genetisk nivå¹. Även om stora framsteg har gjorts när det gäller att förstå fotosyntes och fotorespiration, förblir många steg, inklusive transport mellan växtorganeller, okarakteriserade ^2,3.

Fotorespiration, det näst största kolflödet i växter efter fotosyntes, börjar när enzymet Rubisco fixerar syre istället för koldioxid till ribulos-1,5 bisfosfat (RuBP), vilket genererar den hämmande föreningen 2-fosfoglykolat (2PG)¹. För att minimera de hämmande effekterna av 2PG och för att återvinna det tidigare fasta kolet har C3-växter utvecklat den multiorganellära processen för fotorespiration. Photorespiration omvandlar två molekyler av 2PG till en molekyl av 3-fosfoglycerat (3PGA), som kan återinträda i C3-kolfixeringscykeln¹. Således omvandlar fotorespiration endast 75% av det tidigare fixerade kolet från genereringen av 2PG och förbrukar ATP i processen. Som ett resultat är fotorespirationsprocessen ett signifikant 10%-50% drag på den fotosyntetiska processen, beroende på vattentillgänglighet och växtsäsongstemperaturer⁴.

Enzymerna som är involverade i fotorespiration har varit ett forskningsområde i årtionden, men endast ett litet antal transportproteiner har karakteriserats på genetisk nivå, även om minst 25 transportsteg är involverade i processen ^5,6,7. De två transportproteiner som är direkt involverade i rörelsen av kol som genereras i fotorespirationsprocessen är plastidglykolat/ glycerattransportören PLGG1 och gallsyranatriumsymportern BASS6, som båda är involverade i exporten av glykolat från kloroplasten ^5,6.

Under omgivande [CO₂] fixerar Rubisco en syremolekyl till RuBP ungefär 20% av tiden¹. När växter utsätts för låg [CO 2] ökar fotorespirationshastigheterna, vilket gör låg [CO₂] till en idealisk miljö att testa för mutanter som kan vara viktiga under förhöjd fotorespirationsstress. Testning av ytterligare förmodade kloroplasttransportprotein T-DNA-linjer under låg CO₂ i 24 timmar och mätning av förändringar i klorofyllfluorescens ledde till identifiering av bas6-1-växtlinjer som visade en fotorespirationsmutant fenotyp⁵. Ytterligare karakterisering visade att BASS6 är en glykolattransportör i kloroplastens inre membran.

Detta dokument beskriver i detalj ett protokoll som liknar det som ursprungligen användes för att identifiera BASS6 som en fotorespirationstransportör, som kom från en lista över förmodade transportproteiner belägna i kloroplastmembranet⁸ Detta protokoll kan användas i ett experiment med hög genomströmning som karakteriserar Arabidopsis T-DNA-mutanter eller EMS-genererade mutanta växter som ett sätt att identifiera gener som är viktiga för att upprätthålla fotosyntetisk effektivitet under en rad abiotiska spänningar såsom värme, hög ljusstress, torka och CO_{2-tillgänglighet} . Screening av växtmutanter med klorofyllfluorescens har tidigare använts för att snabbt identifiera gener som är viktiga för primär metabolism⁹. Med så mycket som 30% av Arabidopsis-genomet som innehåller gener som kodar för proteiner med okänd eller dåligt karakteriserad funktion, kan stressinducerad analys av fotosyntetisk effektivitet ge insikt i molekylära funktioner som inte observerats under kontrollerade förhållanden i mutanta växter¹⁰. Målet med denna metod är att identifiera mutanter av den fotorespiratoriska vägen med hjälp av en låg CO_2-screening . Vi presenterar en metod för att identifiera mutanter som stör fotorespiration efter exponering för låg CO₂. En fördel med denna metod är att det är en screening med hög genomströmning för plantor som kan göras på relativt kort tid. Videoprotokollavsnitten ger detaljer om fröberedning och sterilisering, växttillväxt och låg CO_2-behandling , konfigurationen av fluorescensavbildningssystemet, mätning av kvantutbyte för de behandlade proverna, representativa resultat och slutsatser.

Protocol

1. Fröberedning och sterilisering

OBS: Fröberedning består av fröimitation och frösterilisering. Det är viktigt att notera att alla dessa steg ska utföras i en laminär flödeshuv för att upprätthålla sterila förhållanden. Alla nödvändiga material, reagenser och tillväxtmedier måste autoklaveras (se materialförteckningen).

1. Fröimbibation och stratifiering
   OBS: De frölinjer som används är plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) och vild typ (WT, Col-0).
   1. Fördela fröna i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Imbibe fröna i sterilt vatten i en laminär flödeshuva och stratifiera vid 4 ° C i mörkret i 2 dagar.
2. Frö sterilisering
   1. Under sterila förhållanden, bered 10 ml 50% (v / v) blekmedelslösning och tillsätt cirka 20 μl Tween 20. För frösterilisering, ta bort vatten från de imbibed frön, tillsätt 1 ml blekmedellösning i mikrocentrifugrören och inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
   2. Ta bort blekmedelslösningen med en pipett.
   3. Skölj fröna i 1 ml sterilt vatten för att återuppliva. Ta bort vattnet när fröna har lagt sig till botten. Upprepa steg 1.6 och steg 1.7 sju gånger.
   4. Återsuspendera fröna i steril 0,1% agaroslösning.
3. Fröplätering
   1. Gör en 1 L volym Murashige & Skoog Basal Medium med vitaminer och 1,0 g / L 2-(N-morfon)etansulfonsyra (MS) genom att tillsätta 5,43 g av pulvret till 500 ml destillerat vatten. Justera pH-värdet mellan 5,6 och 5,8 med kaliumhydroxid (KOH). Fyll till 1 liter med destillerat vatten.
      1. Dela vätskelösningen i 500 ml och placera varje halva i en 1 liters kolv som innehåller en magnetisk omrörningsstång. Tillsätt 5 g agarpulver för att få en 1% agar w/v lösning för varje kolv.
      2. Autoklav vid 121 °C och 15 psi i 30 minuter; Placera sedan vid rumstemperatur under långsam omrörning. När den kyls, häll 25 ml MS-agar i en fyrkantig petriskål. Låt det stelna.
         OBS: Dessa Murashige & Skoog Basal Medium-plattor innehåller 1% MS-medium med vitaminer och 1% agar för odling av testmutanterna.
   2. Skär en 200 μL pipettspets med ett rakblad. Placera ett frö i mitten av det angivna fyrkantiga rutnätet för varje testmutant eller genotyp (1 cm² kvadrat) på en fyrkantig MS-platta (figur 1) med en 200 μl mikropipett.
      OBS: Det fyrkantiga rutnätet på 1 cm x 1 cm hjälper till att hålla ett jämnt avstånd mellan plantorna och undvika överlappning, vilket kommer att vara viktigt vid senare fluorescensavbildning och analys.
   3. När fröna har pläterats, linda med kirurgisk tejp runt locket för att täta och placera det i tillväxtkammaren under förhållanden som beskrivs nedan.

2. Växttillväxt och låg CO_2-behandling

1. Odla växterna i 7-9 dagar vid 20 ° C under en 8 timmars ljuscykel på 120 μmol · m ^{− 2 s-1} och 16 h mörker vid 18 ° C. Kontrollera växterna den 6: e dagen för att avgöra om de är tillräckligt stora för avbildning. På den 8: e dagen efter plätering utsätter du växterna för låg CO₂.
2. Låg CO_2-behandling
   1. Efter 7-9 dagar, placera fyra av de åtta plattorna från de omgivande tillväxtkammarförhållandena till fotorespiratoriska förhållanden på 20 ° C, kontinuerliga ljusnivåer på 200 μmol · m − 2 s ^{− 1} och låg CO₂ i 12 timmar.
   2. Konstruera det låga CO_{2-tillståndet} med en lufttät transparent behållare med 100 g sodakalk placerad i behållarens botten. Placera behållaren i samma tillväxtkammare som kontrollen. Håll kontrollanläggningarna under 120 μmol·m−2 s⁻¹ i omgivande CO2 i ¹²timmar.

3. Konfigurera fluorescensavbildningssystemet

1. Placera en testplatta (beredd enligt avsnitt 1 och avsnitt 2) centrerad under kameran på ett fast avstånd i fluorescensavbildningssystemet.
2. I instrumentets programvara navigerar du till Live Window och markerar rutan Blinkar för att slå på icke-aktiniska mätblixtar.
3. Klicka på zoom- och fokusverktygen tills en komplett och skarp bild är synlig. För detta ändamål, använd ett steg eller en hylla för att justera avståndet mellan växterna och kameran. Håll zoomen, fokuset och avståndet från kameran konstant under hela experimentet.
4. Ställ in värdet på El. Slutare till 0 och justera känsligheten för att få en fluorescerande signal i intervallet 200-500 digitala enheter.
   OBS: Ett lägre el. slutarvärde (0-1) säkerställer att mätblixtarna är icke-aktiniska, medan ett högre värde (2) förbättrar bildens upplösning.
5. Placera en ljusmätare i samma position som används för att justera kamerainställningarna.
6. I Live-fönstret markerar du rutan Super för att starta en mättande puls som varar i 800 ms. Kom ihåg att kryssa i rutan varje gång för en ny puls.
7. Använd skjutreglaget för att justera procentandelen av den relativa effekten för superpulsen tills ljusmätaren läser 6 000-8 000 μmol · m − ²s ^{− 1}.

4. Designa kvantutbytesprogrammet

1. Importera standardverktyg för bildsystemet.
   Inkludera default.inc
   Inkludera light.inc
   OBS: Programsyntaxen som används som referens i detta experiment är för ett FluorCam-bildsystem.
2. Definiera följande globala variabler enligt de konfigurerade ljusinställningarna:
   Slutare = 0
   Känslighet = 40
   Super = 65
3. Inkludera tidssteget för loggning av data:
   TS = 20ms
4. Samla in Fo-mätningen genom att ta prov på fluorescens i ett mörkeranpassat tillstånd.
   F0duration = 2s;
   F0period = 200ms;
   OBS: F0duration definierar det tidsintervall över vilket den mörkanpassade fluorescensen registreras. F0period definierar det tidsintervall under vilket den mörkanpassade fluorescensmätningen upprepas.
5. Registrera Fo-mätningarna i datatabeller.
   <0,F0period.. F0duration>=>mfmsub
   <0s>->checkpoint,"startFo"
   =>checkpoint,"endFo";
   Där < representerar > uppsättningen fluorescensvärden indexerade efter tid; => lagrar mätningar i en systemfil; mfmsub representerar hela datauppsättningen för experimentet; och kontrollpunkt skapar en delmängd för data från specifika mätningar som startFo.
6. Samla in och lagra Fm-mätningen genom att ta prov på fluorescens efter en mättande puls.
   PulseDuration = 960ms; ##
   a1=F0duration + 40ms
   a2 = a1 + 480 ms;
   =>SatPulse(PulseDuration);
   =>mfmsub
   =>mfmsub;
   =>kontrollpunkt,"startFm"
   =>checkpoint,"endFm"
   =>checkpoint,"timeVisual";
   Där a1 och a2 är variabler för att samordna provtagningstiden med den mättande pulsen; a1 representerar starttiden för Fm-mätningen; och a2 representerar pulsens mittpunktstid.

5. Mätning av kvantutbytet för de behandlade proverna

1. Direkt efter behandling, täck plattorna med aluminiumfolie i 15 minuter för mörk anpassning. Ta bort folien för att mäta kvantutbytet för fotosystem II med en pulsamplitudmodifierad fluorometer. Placera sedan plantplattan direkt under kameran och kör kvantavkastningsprotokollet som finns i GitHub-lagringsplatsen.
2. Ladda ner quantum_yield-protokollet från GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) eller använd ett liknande utformat program från avsnitt 4. Använd fluorometerns programvara för att öppna programfilen genom att klicka på mappikonen och navigera till filplatsen.
3. Kör kvantutbytesprogrammet genom att klicka på den röda blixtikonen.
4. När protokollet är klart navigerar du till föranalysfönstret . Dela upp plattan i enskilda plantor med hjälp av markeringsverktygen för att markera alla pixlar för varje planta på plåtbilden. Klicka på Bakgrundsuteslutning om du vill ta bort alla markerade bakgrundspixlar och bara lämna plantområdet.
5. Klicka på Analysera för att generera fluorescensdata för varje planta på tallriksbilden. Justera fluorescensvärdeintervallet manuellt för att visa konsekventa minimi- och maximivärden bland alla plattor.
6. Klicka på Numeriskt medelvärde från fliken Experiment | Exportera | Numeriskt. Välj Alla data och efter kolumn och klicka på Ok för att generera en textfil som innehåller QY-mått för varje planta.

6. Öppna datafilen

1. Öppna textfilen i ett kalkylblad för analys. Av rubrikerna som visar areanummer, storlek på pixlar, Fm, Ft, Fq och QY, identifiera arealnumret för kärngenotypen (WT eller testmutant) och QYmax. Utför ett parvis t-test med avseende på vild typ för att bestämma betydelse. Data tolkas som väsentligt annorlunda när p-värdena är under 0,05.

Representative Results

Resultaten visar plattbilder av rå- och fluorescensbilder från omgivande och låg CO_2-screening av WT och testmutanter. Varje plantlet är märkt med arealnummer, med motsvarande fluorescensavläsningar angivna som QY. Data exporteras som en textfil och kan öppnas i ett kalkylblad för analys (se Kompletterande tabell S1). Mutantlinjerna plgg1-1 och abcb26 valdes för att visa positiv och negativ identifiering av gener associerade med fotorespiratorisk stress. PLGG1-koder för den första transportören i vägen efter syresättningen av RuBP⁶, medan ABCB26 tros koda för en antigentransportör som inte är känd för att vara involverad i fotorespiration¹¹. De mörkanpassade Fv/Fm QY-verkningarna hos WT och mutanter visualiseras av box- och morrhårsdiagram. För att testa den statistiska skillnaden mellan WT- och testmutanterna användes ett parvis t-test med ett p-värde < 0,05. Här använde vi fotorespiratoriska mutantlinjer med reducerad QY Fv/Fm som testmutanter för att kontrollera screeningmetodens effektivitet. Resultaten visar att testmutanterna har en signifikant lägre QY-effektivitet än WT. Figur 3B visar en signifikant minskning av förhållandet mellan variabel och maximal fluorescens (Fv/Fm) för plgg1-1 men inte abcb26 vid låg CO₂. Detta resultat överensstämmer med PLGG1: s roll som en transportör som är involverad i fotorespiration, medan abcb26 inte visar en fenotyp som skiljer sig från WT-kontrollen under låga CO_{2-förhållanden} . Således kan denna screeningmetod identifiera fotorespiratoriska mutanter med hjälp av låg CO_2-screening .

Bild 1: Exempel på schema över fröplattans layout. Två tekniska replikat visas med sex frön placerade i rad. WT-kontrollfrön placerade ovanför mutanta frön. Förkortning: WT = vild typ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Mörkanpassade F_v/F_m-bilder av 9 dagar gamla plantor. Kontrollen av vildtyp jämförs med T-DNA-mutantlinjer vid omgivande och låg CO₂. Färgskalan representerar medelvärdet av F_v/F_m för varje planta. Skalstreck = 1 cm. Förkortningar: Fv / Fm = förhållandet mellan variabel och maximal fluorescens; WT = vild typ; plgg1-1 = plastidal glykolat/glycerattranslokator 1; abcb26 = ATP-bindande kassett B26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Fluorescensobservationer. Mätningar av maximal kvantutbyte (Fv/Fm) gjorda på plantor vid (A) omgivande och (B) låga CO_{2-förhållanden} . Rutorna representerar intervallet mellan de inre kvartilerna, linjerna i rutorna representerar medianerna och morrhåren representerar de maximala och minimala observationerna. * Indikerar signifikant skillnad baserat på ett parvis t-test i förhållande till WT (n > 44, p < 0,05; Kompletterande tabell S2). Förkortningar: Fv / Fm = förhållandet mellan variabel och maximal fluorescens; WT = vild typ; plgg1-1 = plastidal glykolat/glycerattranslokator 1; abcb26 = ATP-bindande kassett B26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande tabell S1: Sammanställda fluorescerande data från alla plantplattor som användes i experimentet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell S2: Statistik rapporteras från ett t-test mellan vild typ och båda mutanta genotyperna. Mutanter anses skilja sig avsevärt från vild typ när p-värdet är lägre än 0,05. Tabell A representerar t-tester som utförts på växter som odlas i omgivande CO 2, medan tabell B representerar t-tester som utförts på växter som odlas i låg CO₂. t-Test: två-prov som antar lika varianser. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

De experimentella metoder som beskrivs i detta dokument har vissa fördelar och begränsningar. En fördel är att denna metod kan screena många växtplantor, även om vissa försiktighetsåtgärder måste vidtas för att förhindra förorening av växtmedieplattan under pläterings- och odlingsprocessen. Därför är det viktigt att försegla Arabidopsis-plattorna med kirurgisk tejp. En annan fördel med detta experiment är att det har en kortare 12 h fotorespiratorisk stressperiod jämfört med det tidigare publicerade arbetet⁸. Minskningen av behandlingstiden var för att bättre skilja skillnader i Fv / Fm mellan WT och utvalda mutanter. Behandlingstiden kan behöva varieras beroende på fenotypens svårighetsgrad i muterade stammar och nivån av_CO2 i experimentuppställningen. En begränsning är dock att denna metod kräver en bladyta som är tillräckligt stor för att fluorometern ska kunna mäta och för att Fv/Fm-värden ska kunna beräknas. Justering av den initiala odlingstiden för testade plantor säkerställer att fluorometeravläsaren har tillräcklig bladyta för att mäta för varje planta utan att bladen överlappar varandra under avbildning. Plantorna måste avbildas vid de första riktiga bladen för att hålla bladstorleken och bladvinklarna enhetliga. Bildens upplösning kan förbättras genom att öka kamerans slutartid och känslighet. Angränsande pixlar kommer att särskiljas bättre; Att öka känsligheten för mycket kommer dock att överexponera kameran och leda till falska fluorescensmaximum. Optimering och felsökning kan vara nödvändig för att balansera upplösnings- och fluorescensvärdena.

Möjligheten att screena för fotosyntetiska mutanter i ett standardiserat förfarande är viktigt. Det kan möjliggöra en konsekvent metod med hög genomströmning för att identifiera fotorespirationsmutanter med gener av intresse för fotosyntes och fotorespirationsmetabolism. Sammantaget tar screening för Fv / Fm i denna analys cirka 30 s per platta av växtplantor, vilket möjliggör screening av över 1,000 plantor per dag. Klorofyllfluorescensanalys möjliggör identifiering av fotorespiratoriska mutanter med hjälp av en låg CO_2-screening , vilket är viktigt för att upprätthålla fotorespiratorisk effektivitet. Med tanke på det stora antalet okända transportörer som teoretiseras för att vara i fotorespirationsvägen³, kan denna metod användas för att snabbt utvärdera effekten genotypen har på fotosyntetisk effektivitet. Dessutom kan fluorometrar mäta andra aspekter av fotosyntetisk effektivitet, såsom icke-fotokemisk släckning och fotosystem II-driftseffektivitet. Dessa tilläggsprotokoll tar längre tid per plantplatta men kan användas för ytterligare och känsligare analys i motsats till denna snabba högkapacitetsskärm av mutanter. Denna metod är inte begränsad till Arabidopsis och kan också justeras för att screena för T-DNA-mutanter i en rad andra abiotiska stressförhållanden som höga och låga temperaturer, hög ljusstress och torkförhållanden för att identifiera gener som är viktiga för fotosyntes och fotorespiration. Eventuella ytterligare ändringar måste optimeras individuellt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	VWR	10810-070	container for seed sterilization
agarose	VWR	9012-36-6	chemical used to suspend seeds for ease of plating
Arabidopsis thaliana seeds (abcb26)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085232	arabidopsis seeds used as experimental group
Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_053469C	parental arabidopsis seeds
Arabidopsis thaliana seeds (WT)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	Col-0	arabidopsis wild type seeds used as a control group
bleach	clorox	generic bleach	chemical used to sterilize seeds
Carbolime absorbent	Medline products	S232-104-001	CO2 absorbent
Closed FluorCam	Photon Systems Instruments	FC 800-C	Fluorescence imager
FluoroCam FC 800-C	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence imager
FluoroCam7	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence image analysis software
Gelzan (plant agar)	Phytotech labs	71010-52-1	chemical used to solidify MS media as plates
glass flask 1 L	Fisherbrand	FB5011000	container for making and autoclaving MS media
growth chamber	caron	7317-50-2	growth chamber used to grow plants
Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS)	Phytotech labs	M5531	growth media for arabidopsis seedlings
potassium Hydroxide (KOH)	Phytotech labs	1310-58-3	make as 1 M solution for ph adjustment
spider lights	Mean Well Enterprises	XLG-100-H-AB	lights used in the light assay
Square Petri Dish with Grid, sterile	Simport Scientific	D21016	used to hold MS media for arabidopsis seedlings
surgical tape	3M	1530-1	tape used to seal plates
tween 20	biorad	9005-64-5	surfactant used to assist seed sterilization