Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Elektroporeringsmediert levering av Cas9 ribonukleoproteiner og mRNA i nyisolerte primære musehepatocytter

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63828
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Bioengineering, Clemson University, 2Godley Snell Research Center, Clemson University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver teknikker for å isolere primære musehepatocytter fra leveren og elektroporere CRISPR-Cas9 som ribonukleoproteiner og mRNA for å forstyrre et terapeutisk målgen assosiert med en arvelig metabolsk sykdom i leveren. Metodene som er beskrevet resulterer i høy levedyktighet og høye nivåer av genmodifisering etter elektroporering.

Abstract

Denne protokollen beskriver en rask og effektiv metode for å isolere primære musehepatocytter etterfulgt av elektroporeringsmediert levering av CRISPR-Cas9 som ribonukleoproteiner (RNPs) og mRNA. Primære musehepatocytter ble isolert ved hjelp av en tre-trinns retrograd perfusjonsmetode som resulterte i høye utbytter på opptil 50 × 106 celler per lever og cellens levedyktighet på >85%. Denne protokollen gir detaljerte instruksjoner for plating, farging og dyrking av hepatocytter. Resultatene indikerer at elektroporering gir en høy transfeksjonseffektivitet på 89%, målt ved prosentandelen av grønne fluorescerende protein (GFP) -positive celler og beskjeden celle levedyktighet på >35% i musehepatocytter.

For å demonstrere nytten av denne tilnærmingen ble CRISPR-Cas9 rettet mot hydroksyfenylpyruvatdioksygenasegenet elektroporert i primære musehepatocytter som proof-of-principle genredigering for å forstyrre et terapeutisk gen relatert til en arvelig metabolsk sykdom (IMD) i leveren. En høyere on-target redigering på 78% ble observert for RNPs sammenlignet med 47% redigeringseffektivitet med mRNA. Funksjonaliteten til hepatocytter ble evaluert in vitro ved hjelp av en albuminanalyse som indikerte at levering av CRISPR-Cas9 som RNPs og mRNA resulterer i sammenlignbar celle levedyktighet i primære musehepatocytter. En lovende applikasjon for denne protokollen er genereringen av musemodeller for humane genetiske sykdommer som påvirker leveren.

Introduction

IMDs i leveren er genetiske lidelser preget av mangel på et avgjørende leverenzym involvert i metabolisme som fører til akkumulering av toksiske metabolitter. Uten behandling resulterer IMDs i leveren i organsvikt eller for tidlig død 1,2. Det eneste kurative alternativet for pasienter med IMD i leveren er ortotopisk levertransplantasjon, som er begrenset på grunn av den lave tilgjengeligheten av donororganer og komplikasjoner fra immunsuppressiv behandling etter prosedyren 3,4. Ifølge nyere data samlet inn av Organ Procurement and Transplantation Network, mottar bare 40% -46% av voksne pasienter på ventelisten for levertransplantasjon et organ, mens 12,3% av disse pasientene dør mens de er på venteliste5. Videre har bare 5% av alle sjeldne leversykdommer en FDA-godkjent behandling6. Det er klart at det er et kritisk behov for nye behandlinger for IMDs i leveren. Imidlertid er det nødvendig med passende sykdomsmodeller for å utvikle nye terapeutiske alternativer.

Modellering av menneskelige sykdommer ved bruk av in vitro og in vivo systemer er fortsatt et hinder for å utvikle effektive terapier og studere patologien til IMDs i leveren. Hepatocytter fra pasienter med sjeldne leversykdommer er utfordrende å få7. Dyremodeller er avgjørende for å utvikle en forståelse av sykdomspatologi og for å teste terapeutiske strategier. Et hinder er imidlertid å generere modeller fra embryoer som bærer dødelige mutasjoner. For eksempel, forsøk på å lage musemodeller av Alagille syndrom (ALGS) med embryoer som inneholder homozygote delesjoner av en 5 kb sekvens nær 5'-enden av Jag1 genet resulterte i tidlig død av embryoer8. I tillegg kan generering av musemodeller ved genredigering i embryonale stamceller være tids- og ressurskrevende9. Til slutt vil mutasjoner vises utenfor det målrettede vevet, noe som fører til forvirrende variabler som kan hindre studier av sykdommen9. Somatisk genredigering vil muliggjøre enklere redigering i levervev og omgår utfordringene knyttet til å generere modeller ved hjelp av embryonale stamceller.

Elektroporering muliggjør levering av CRISPR-Cas9 direkte inn i kjernen ved å bruke høyspenningsstrømmer for å permeabilisere cellemembranen og er kompatibel med mange celletyper, inkludert de som er uforsonlige med transfeksjonsteknikker, for eksempel humane embryonale stamceller, pluripotente stamceller og nevroner 10,11,12 . Imidlertid er lav levedyktighet en potensiell ulempe ved elektroporering; optimalisering av prosedyren kan gi høye nivåer av levering mens du begrenser toksisitet13. En nylig studie demonstrerer muligheten for elektroporering av CRISPR-Cas9-komponenter i primære mus og humane hepatocytter som en svært effektiv tilnærming14. Ex vivo elektroporering i hepatocytter har potensial til å bli brukt til å generere nye musemodeller for humane IMDs i leveren.

Denne protokollen gir en detaljert trinnvis prosedyre for å isolere musehepatocytter fra leveren og deretter elektroporere CRISPR-Cas9 som RNP-komplekser, bestående av Cas9-protein og syntetisk enkeltguide-RNA (sgRNA), eller Cas9 mRNA kombinert med sgRNA for å oppnå høye nivåer av genredigering på målet. I tillegg gir protokollen metoder for å kvantifisere genredigeringseffektivitet, levedyktighet og funksjonalitet etter elektroporering av CRISPR-Cas9 i nyisolerte musehepatocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøkene ble alle utført i samsvar med retningslinjene fra Institutional Animal Care and Use Committee og godkjente protokoller ved Clemson University. Kirurgiske inngrep ble utført hos bedøvede villtype C57BL/6J mus mellom 8 og 10 uker gamle.

1. Dyrekirurgi

  1. Forberedelse av løsninger og instrumenter
    MERK: Perfusjonsløsninger og anestesicocktailoppskrifter er vist i materialtabellen.
    1. Klargjør perfusjonsløsning 1 (HEPES, EGTA og EBSS), perfusjonsløsning 2 (HEPES, EGTA, EBSS, CaCl2 og MgSO4) og perfusjonsløsning 3 (løsning 2 og liberase). Forsikre deg om at løsningene er godt blandet.
    2. Sett vannbadet til 42 °C og førvarm Perfusjonsløsninger 1, 2 og 3 i minst 30 minutter før du starter prosedyren, og oppbevar dem i vannbadet.
      MERK: Perfusjonsløsninger 1 og 2 vil chelatere kalsiumet og skylle ut blodet i leveren. Perfusjonsløsning 3 inneholder fordøyelsesenzymet liberase for å dissosiere den ekstracellulære matriksen.
    3. Plasser 150 ml DMEM + 10% føtalt bovint serum (FBS) i koniske rør og hold dem på is.
      MERK: Dette mediet vil bli brukt til å frigjøre cellene fra leverkapselen og vaske de isolerte hepatocytter i henholdsvis trinn 2.1 og 2.2.
    4. Sett sentrifugen til 4 °C.
    5. Steriliser pumpeslangen ved å plassere begge ender av slangen i en kolbe fylt med 70% etanol og sykle etanolen tre ganger.
    6. Vask slangen med destillert vann og tøm den.
    7. Fyll slangen med førvarslet 30 ml perfusjonsløsning 1, etterfulgt av 8 ml perfusjonsløsning 2. Hvis slangen fortsatt har plass til mer væske, fyll resten av slangen med Perfusjonsløsning 3. Stopp pumpen når du bytter til en annen perfusjonsløsning for å unngå å føre luftbobler inn i slangen.
    8. Plasser overflødig slange i vannbadet på 42 °C for å holde perfusjonsløsningene varme.
    9. Plasser enden av pumpeslangen i det koniske slangen som inneholder Perfusjonsløsning 3, mens den oppbevares i vannbadet.
      MERK: Dette trinnet er nødvendig for at pumpen kontinuerlig skal kunne fylles med Perfusjonsløsning 3 under perfusjon.
  2. Dyr forberedelse
    1. Bedøv musen ved å injisere bedøvelsescocktailen intraperitonealt i en dose på 10-11,7 μL / g kroppsvekt. Bedøvelsescocktailen har en endelig konsentrasjon på 7,5 mg/ml ketamin, 0,25 mg/ml acepromazin og 1,5 mg/ml xylazin.
    2. Overvåk musens pust og kontroller at musen ikke reagerer på smerte. Vent til musen har en pustefrekvens på ~ 55-65 pust per min, reagerer ikke på å få tærne klemt, og har en slapp hale. I tillegg må du kontrollere den palpebrale (blinkende) refleksen ved å berøre huden lett på den mediale siden av det lukkede øyet. Hvis musen blinker eller øyemuskulaturen rykker, øker du dosen av hele bedøvelsescocktailen med 5-10 μL.
    3. Plasser musen på ryggen i en liggende stilling og fest lemmene til overflaten ved hjelp av pinner eller tape (supplerende figur S1).
    4. Spray magen med 70% etanol og klapp den tørr med en bomullsdott.
  3. Lever perfusjon
    1. Lag et U-formet lateralt snitt i bukhuden ved hjelp av saks og utvid hullet gjennom sidene.
    2. Fortsett å åpne huden til ribbe buret.
    3. Bruk saks, kutt gjennom bukhinnen for å eksponere bukhulen opp til ribbe buret, vær forsiktig så du ikke hakker noen organer. Flytt tarmene til høyre side ved hjelp av baksiden av tang eller den stumpe overflaten av saks. Identifiser den nedre vena cava og portalvenen (Supplerende figur S1).
    4. Start pumpen for å skylle forvarmet perfusjonsløsning gjennom kateteret.
    5. Stopp pumpen og fjern kateteret når all luft er spylt gjennom systemet. Sett spissen av nålen som er koblet til kateteret inn i den nedre vena cava i en 10 ° -20 ° vinkel mot venen. Fjern nålen fra kateteret og skyv kateteret forsiktig inn i venen i en bevegelse parallelt med venen.
      MERK: Brukeren bør observere flashback av blod i kateteret for å verifisere riktig kanylering i venen.
    6. Koble slangen til kateteret uten å flytte kateteret lenger inn i venen.
    7. Start pumpen med en strømningshastighet på 2 ml/min. Se etter leveren som umiddelbart blir blek som et tegn på at perfusjonen er vellykket.
    8. Klipp portalvenen med saks.
    9. Øk gradvis strømningshastigheten til 5 ml / min.
    10. Påfør trykk med jevne mellomrom på portalvenen på det omtrentlige kuttstedet i 3 s ved hjelp av tang eller en bomullspinne for å blokkere dreneringen og legge til rette for god perfusjon.
    11. Når Perfusion Solution 3 strømmer gjennom, må du nøye overvåke leverens elastisitet. For å avgjøre om leveren er myknet, trykk forsiktig på leveren med en bomullspinne eller tang og kontroller om det dannes innrykk på leveren. Vær forsiktig så du ikke overperfuse for å unngå tap av cellens levedyktighet.
    12. Når leveren er myknet (oppstår etter at 30-50 ml Perfusjonsløsning 3 har strømmet gjennom), stopper pumpen, fjerner kateteret og dissekerer leveren forsiktig. Plasser leveren i en 100 mm petriskål som inneholder iskald DMEM + 10% FBS medium. Excise galleblæren, vær forsiktig så du ikke søler innholdet. Virvle petriskålen for forsiktig å fjerne mulige blodpropper.
    13. Overfør leveren til en ny petriskål som inneholder iskald DMEM + 10% FBS medium.

2. Hepatocytt isolasjon

  1. Frigjør celler fra leverkapselen.
    1. Legg petriskålen på is og bruk to par steril tang, riv forsiktig leverkapselen på alle lobene. Virvle leveren forsiktig rundt i mediet ved hjelp av en celleløfter eller en tang for å frigjøre hepatocytter. Fortsett denne bevegelsen til leveren blir svært liten og suspensjonen blir brun og ugjennomsiktig.
    2. Fjern restene av levervevet fra platen og bruk en 25 ml serologisk pipette satt til lav hastighet, overfør cellesuspensjonen forsiktig til et 50 ml konisk rør (prekjølt på is) utstyrt med en 100 μm cellesil.
    3. Tilsett fersk, iskald DMEM + 10% FBS-medium til petriskålen for å vaske ut og samle de resterende cellene fra overflaten og overfør til 50 ml konisk rør. Gjenta dette trinnet til alle cellene er samlet inn.
  2. Vask og rens hepatocytter fra ikke-parenkymale celler.
    1. Sentrifuger cellene samlet i 50 ml konisk rør ved 50 × g ved 4 ° C i 5 minutter ved lav retardasjon eller uten bremser.
    2. Kast supernatanten som inneholder rusk og ikke-parenkymale celler og resuspender pelleten i den gjenværende supernatanten ved å virvle røret forsiktig. Etter at pelleten er resuspendert, tilsett 30 ml frisk, iskald DMEM + 10% FBS medium.
    3. Gjenta sentrifugering (trinn 2.2.1) og vasking (trinn 2.2.3) tre ganger.
    4. Resuspender den endelige cellepelleten i 10 ml iskald DMEM + 10% FBS medium.
      MERK: Volumet av medium som brukes til å resuspendere pelleten avhenger av pelletsstørrelsen. Hvis pelleten er betydelig mindre enn 15 mm, bruk 1-5 ml iskald DMEM + 10% FBS medium.
  3. Kvantifisering av cellens levedyktighet
    1. I et mikrofugerør tilsettes 50 μL 0,4% Trypan Blue-oppløsning til 350 μL hepatocytt plating medium (PM). Tilsett deretter 100 μL cellesuspensjon for å gjøre en endelig 1:5 fortynning og pipette opp og ned flere ganger for å blande.
    2. Telle celletetthet og levedyktighet ved hjelp av et hemocytometer. Mens du teller, plasser hepatocyttsuspensjonen på is, og legg deretter isbøtta på en orbital shaker satt til 30 o / min for å holde hepatocytter fra å bosette seg.
    3. Følg trinnene for percollbehandling og sentrifugering nedenfor hvis cellens levedyktighet er <70 %.
      1. Fortynn Percoll med 10x fosfatbufret saltvann (PBS) i forholdet 9:1.
      2. Bland hepatocyttsuspensjonen med den fortynnede Percoll i forholdet 1:1.
      3. Sentrifuge ved 200 × g ved 4 °C i 10 min.
      4. Kast supernatanten som inneholder døde celler. Resuspender pelleten i iskald DMEM + 10% FBS medium.
      5. Tell cellene på nytt.
  4. Testing av hepatocytter for plateabilitet
    1. Plate noen av cellene på kollagen I-belagte 6-brønns plater med en tetthet på 0,5 × 106 celler per ml ved bruk av 1,5 ml forvarmet PM.
    2. Hold de resterende cellene på is mens du er på en orbital shaker til den er klar til å utføre elektroporering.
    3. Plasser celleplaten i en vannkappet CO2-inkubator ved 37 C. Flytt platen horisontalt og vertikalt forsiktig i en nord-til-sør og øst-til-vest-bevegelse for å sikre homogen plating. Gjenta bevegelsen to ganger hver 1,5 time.
    4. Kontroller cellevedlegget ved 3 timer etter plating.
      MERK: Minst 60% av cellene skal holde seg til platen som en indikator på hepatocytter av god kvalitet.
    5. Bytt medium til prewarmed Hepatocyte Maintenance Medium (MM) ved 24 timer etter plating for å opprettholde cellene i kultur.
  5. Glykogenfarging
    1. Etter at cellene har festet seg til de 6-brønns kollagen I-belagte platene, fjern det brukte mediet fra de dyrkede cellene.
    2. Fest cellene i 10-15 minutter i iskald etanol.
    3. Vask grundig med sterilt vann.
    4. Inkuber i 1% vandig periodisk syre i 5 minutter og vask deretter med sterilt vann.
    5. Inkuber i 100% Schiff Reagent i 30 min.
      MERK: Schiff-reagenset må ikke fortynnes før det tilsettes cellene.
    6. Vask med vann tre ganger i løpet av 10 min.
    7. Monter i monteringsmedium.
    8. Bilde ved hjelp av et mikroskop på brightfield innstilling.

3. Design sgRNA for CRISPR-Cas9 genredigering

MERK: Denne delen beskriver utformingen av et sgRNA rettet mot musens hydroksyfenylpyruvatdioksygenase (Hpd) -gen som bevis på prinsippgenredigering for å forstyrre et terapeutisk målgen relatert til en IMD i leveren.

  1. Utform veiledningssekvensen rettet mot Hpd ved hjelp av den refererte programvaren15.
  2. Bekreft sekvensen for Hpd med Ensembl Genome Browser.
  3. Bruk følgende parametere for å designe gRNA: enkel føringslengde på 20 nukleotider og en NGG (N kan være hvilken som helst nukleotid) protospacer-tilstøtende motiv (PAM) sekvens.
  4. Velg et målområde fra ekson 3 i Hpd.
  5. Generer en liste over veiledningssekvenser fra målområdet med mål- og ikke-målpoeng.
    MERK: Målpoengsummen indikerer forventet redigeringseffektivitet i mål for den gitte utformingen: en høyere poengsum er korrelert med høyere redigeringseffektivitet. Off-Target Score korrelerer med spesifisiteten til veiledningssekvensen: en høyere poengsum indikerer lavere sannsynlighet for redigering utenfor målet. Ideelt sett bør begge poengsummene være høye: målpoengsummen >60 og utenfor målpoengsummen >50.
  6. Velg veiledningssekvensen med de høyeste poengsummene på og utenfor målet. Få sgRNA som inneholder guidesekvensen kjemisk syntetisert.

4. Elektroporering og cellekultur

  1. Fremstilling av CRISPR-Cas9 substrater, media, celler og elektroporeringsinstrumentet
    1. Tilsett hele det medfølgende tilskuddet til PM og varm i vannbadet på 37 °C i 10 minutter.
    2. Slå på elektroporeringsenheten ved å trykke på strømknappen og stille inn elektroporeringsprogrammet ved å trykke på x-knappen og deretter pil ned til programmet T-028 vises på skjermen.
    3. Forbered destinasjonsbrønnene for elektroporerte hepatocytter ved å tilsette 1,5 ml PM til seksbrønns kollagen I-belagte plater. Inkuber platene i en inkubator på 37 °C til de er klare til bruk.
    4. Tilsett hele det medfølgende tilskuddet til elektroporeringsbufferløsningen og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter.
      MERK: Merk utløpsdatoen for elektroporeringsbufferen på hetteglasset (3 måneder etter datoen for tillegg).
    5. Fjern elektroporeringsbeholderne fra emballasjen og merk dem for hver prøve.
    6. I PCR split-strip rør, forberede Cas9 RNP komplekser ved å kombinere 30 μg sgRNA med 300 pmol av Cas9 protein og inkubere kompleksene ved romtemperatur i 10 minutter. Forbered Cas9 mRNA ved å kombinere 30 μg sgRNA med 4 μL Cas9 mRNA (1 μg / μL). Oppbevar mRNA-sgRNA-blandingen på is til elektroporering. Lag separat et rør som inneholder 1,0 μg eGFP mRNA for å verifisere vellykket elektroporering ved hjelp av fluorescensmikroskopi.
    7. Sentrifuge 1,2 × 106 celler per elektroporeringsreaksjon ved 100 × g i 2 minutter ved 4 °C.
    8. Fjern supernatanten fra cellepelleten og tilsett 100 μL elektroporeringsløsning per reaksjon langs siden av rørveggen. Resuspender hepatocytter i elektroporeringsløsningen ved å gynge røret forsiktig for hånd.
  2. Elektroporering av CRISPR-Cas9 RNPs og mRNA til hepatocytter
    1. Når hepatocytter vises jevnt dispergert i elektroporeringsløsningen, overføres 100 μL av hepatocyttsuspensjonen til striperørene som inneholder Cas9-kompleksene.
      MERK: Bruk pipettespisser med bred boring når du overfører hepatocytter for å bevare cellens levedyktighet.
    2. Overfør innholdet i stripbrønnen til et elektroporeringsbeholder.
    3. Plasser nukleovettebeholderen i sporet på elektroporeringsenheten. Elektroporate hepatocytter ved å trykke på x-knappen . Etter elektroporering, vent til en skjerm dukker opp på enheten som sier OK. Trykk på x-knappen igjen og fjern beholderen.
    4. Inkubere det elektroporerte fartøyet på is i 15 minutter.
    5. Tilsett 500 μL forvarmet PM til elektroporeringsbeholderen.
    6. Overfør 300 μL av elektroporeringsreaksjonen til hver destinasjonsbrønn på den forvarmede platen.
      MERK: Det skal være to destinasjonsbrønner per elektroporeringsreaksjon. En brønn vil bli brukt til å kvantifisere genredigeringseffektivitet; den andre brønnen vil bli brukt til MTT- og albuminanalysene.
    7. For å forhindre at hepatocytter akkumuleres i midten av brønnen, spre cellene ved forsiktig å flytte plater horisontalt og vertikalt i en nord-til-sør og øst-til-vest-bevegelse. Sørg for at platen holder kontakten med inkubatorhyllen mens den flyttes. Gjenta denne bevegelsen på 15, 30, 45, 60 og 90 minutter etter plating av elektroporerte hepatocytter.
    8. Inkuber platene over natten ved 37 °C.
    9. Fjern mediet fra brønnene som er utpekt for genredigeringsanalyse 24 timer etter plating av cellene, og erstatt med 0,25 mg / ml kjellermembranmatriseoverlegg.
      MERK: Hvis den oppbevares i fryseren, overfører du membranmatrisen til 4 °C og lar den tine. Fordi kjellermembranmatrisen er solid over 10 °C, er det avgjørende at kjellermembranmatrisen forblir på is eller ved 4 °C til den er klar til bruk.

5. Beregn volumet av membranmatrisen som skal blandes med MM for å gi en endelig konsentrasjon på 0,25 mg/ml

MERK: For en plate med 6 brønner er det nødvendig med 2 ml overlegg per brønn.

6. Tilsett det beregnede volumet av membranmatrisen til iskald MM og bland ved pipettering opp og ned 10 ganger

  1. Pipetter overleggsblandingen sakte på toppen av cellene, og plasser platen tilbake i inkubatoren på 37 °C.
  2. Bytt ut mediet med nytt vedlikeholdsmedium hver 24.
  3. Ved 24 timer etter plating, overfør det betingede mediet fra brønnen som er utpekt for MTT- og albuminanalyser. Oppbevar det kondisjonerte mediet i et mikrofugerør til det er klart til å utføre albuminanalysen. Fortsett til trinn 7.1 for MTT-analysen.
    MERK: Oppbevar det betingede mediet ved 4 °C for korttidslagring (mindre enn et døgn). For lengre lagring, oppbevar mediet ved -80 °C.

7. Analyse av leveringseffektivitet, levedyktighet og on-target redigering i elektroporerte musehepatocytter

  1. Måling av levedyktighet ved bruk av MTT-analyse
    1. Klargjør 12 mM MTT stamløsning ved å tilsette 1 ml PBS til ett 5 mg hetteglass med MTT.
    2. Tilsett 150 μL av MTT-lagerløsningen til brønnene og inkuber i 24 timer.
    3. Etter inkubering tilsettes 1,5 ml natriumdodecylsulfathydroklorid (SDS-HCl) oppløsning til hver brønn og deretter pipette for å blande.
    4. Inkuber platen i 4 timer ved 37 ° C og se etter en endring i fargen på mediet fra klar til lilla for å indikere levedyktige celler.
    5. Bland hver prøve igjen med en pipette og les absorbansen ved 570 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
    6. Beregn normalisert levedyktighet for Cas9-behandlede prøver ved hjelp av Eq (1):
      Equation 1 (1)
  2. Albuminanalyse for å evaluere hepatocyttfunksjonalitet
    1. Overfør 50 μL av det betingede mediet til brønnene i platen som leveres av albuminsettet. Dekk brønnene og inkuber i 2 timer ved romtemperatur.
    2. Vask brønnene 5x med 200 μL vaskebuffer.
    3. Snu platen for å tømme hver brønn på silkepapir og banke et par ganger.
    4. Etter vask, tilsett 50 μL av det biotinylerte antistoffet som er gitt i albuminanalysesettet til hver brønn og inkuberes ved romtemperatur i 1 time.
    5. Gjenta trinn 5.2.2-5.2.3 for å vaske brønnene.
    6. Tilsett 50 μL streptavidin-peroksidase som følger med i albuminanalysesettet til hver brønn og inkuberes ved romtemperatur i 30 minutter.
    7. Gjenta trinn 5.2.2.
    8. Tilsett 50 μL av kromogensubstratet som leveres i albuminanalysesettet per brønn og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Bank forsiktig på platen for å sikre jevn blanding. Fjern eventuelle luftbobler med pipettespissen.
    9. Til slutt, legg til 50 μL stoppløsning til hver brønn og se etter en fargeendring fra gul til blå for å indikere funksjonelle celler.
    10. Fortsett umiddelbart for å lese absorbansen ved 450 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
  3. Beregn leveringseffektiviteten i brønner som er elektroporert med eGFP mRNA.
    1. Ta fasekontrast og grønne fluorescensbilder av hepatocytter 24 timer etter elektroporering. Ta tre bilder på forskjellige steder i brønnen.
    2. Last opp bilder av cellene til ImageJ. Under Bilde-fanen velger du Skriv inn | 16-biters for å konvertere bildet til gråtoner.
    3. Hvis du vil utheve cellestrukturer i bildet, velger du Juster | Terskel. Juster glidebryteren for å utheve celler.
    4. Under Prosess-fanen velger du Trekk fra bakgrunn for å fjerne bakgrunnsstøy.
    5. Tell cellene ved å klikke kategorien Analyser , og velg deretter Analyser partikler. Klikk OK for å generere en liste over talte partikler.
    6. Beregn prosentandelen av GFP-positive celler ved å dele antall talte partikler i de grønne fluorescensbildene med antall talte partikler i det tilsvarende fasekontrastbildet.
  4. Analyse av on-target Cas9 aktivitet
    1. Ekstragenomisk DNA fra elektroporerte celler.
      1. Fjern medium fra platen 3 dager etter elektroporering, og tilsett 500 μL 0,25% trypsin. Rug ved 37 °C i 5 minutter. Pipette flere ganger etter inkubering for å sikre at hepatocytter har løsnet fra platen.
      2. Overfør den trypsiniserte cellesuspensjonen til mikrosentrifuger og spinn i en bordtentrifuge ved 800 × g i 10 minutter ved romtemperatur. Etter spinning, undersøk rørene for pellets.
      3. Fjern supernatanten som inneholder trypsin ved pipettering. Pass på at du ikke forstyrrer pelleten. Resuspender pelleten i 80 μL DNA-ekstraksjonsløsning. Hvis pelleten er vanskelig å se, resuspenderer innholdet i røret i 50 μL DNA-ekstraksjonsløsning.
      4. Vortex i 30 s for å sikre at pelleten blir resuspendert. Overfør suspensjonen til PCR-rør med delt stripe og plasser dem i den termiske syklisten. Løp i 15 min ved 95 °C og 8 min ved 68 °C.
    2. PCR-forsterke lokuset på målet.
    3. Følg prosedyren beskrevet nedenfor for å forsterke Hpd on-target-regionen ved bruk av DNA-polymerase.
      1. Forbered en reaksjon som inneholder 0,5 μL av 10 mM dNTPs, 0,5 μL av 10 μM Forward primer, 0,5 μL av 10 μM Omvendt primer, 0,125 μL Taq polymerase, 5 μL genomisk DNA ekstrahert fra hepatocytter og 18,375 μL nukleasefritt vann. Se tilleggstabell S1 for primersekvenser.
      2. Virvle kort og sentrifuger PCR-blandingen raskt for å sikre at løsningen er i bunnen av røret.
      3. Plasser PCR-blandingen i en termisk syklus og forsterk under disse forholdene: 94 °C i 30 s for denaturering, 30 sykluser på 94 °C i 30 s, 57 °C i 45 s for gløding, 68 °C i 1 minutt og en siste forlengelse på 68 °C i 5 minutter.
        MERK: Glødetemperaturen for PCR-reaksjonen vil variere avhengig av sammensetningen av primerne. Vurder å bruke en smeltetemperaturkalkulator før du utfører PCR.
      4. For å bekrefte riktig produktstørrelse, bland 3 μL av PCR-produktene med 2 μL vann og 1 μL 6x fargestoff. Kjør på en 1,5% agarosegel og bekreft riktig produktstørrelse.
    4. Rens DNA ved hjelp av magnetiske perler.
      MERK: Spinnkolonner kan også brukes til PCR-opprydding. Nedenfor er prosedyrer for rensing av PCR-produkter ved bruk av magnetiske perler.
      1. Fjern magnetiske perler fra 4 °C og la dem nå romtemperatur.
      2. Kort virvel og sentrifuger raskt PCR-blandingen.
      3. Tilsett et volum perler lik 1,8× volumet av PCR-blandingen. Pipetter PCR-dråpeblandingen 10x for å sikre at oppløsningen blandes likt.
      4. Rug ved romtemperatur i 10 minutter.
      5. Overfør PCR-dråpeblandingen til en PCR-plate og legg den på en magnetisk plate.
      6. Inkuber platen på magneten i 5 min. Etter 5 minutter må du kontrollere at oppløsningen er klar, og at kulene er bundet til magneten før du går videre til neste trinn.
      7. Kast supernatanten.
      8. Tilsett 200 μL 70% etanol til brønnen og inkuber i 30 s.
        MERK: 70% etanol bør tilberedes kort tid før du utfører opprydding for å forhindre DNA-tap.
      9. Kast supernatanten og gjenta trinn 7.4.4.8.
      10. Fjern supernatanten og la den tørke i 3 minutter ved romtemperatur for å fjerne spor av etanol.
      11. Fjern platen fra magneten og tilsett 22 μL vann til prøven. Pipette opp og ned 10x for å blande vann og perler.
      12. Inkuber prøvene i 3 minutter ved romtemperatur.
      13. Overfør platen tilbake til magneten og rug i 3 minutter eller til oppløsningen er klar.
      14. Overfør 20 μL av prøven til et PCR-rør. Pass på at ingen perler overføres.
    5. Sekvensrenset DNA-amplikon ved Sanger-sekvensering.
    6. Last opp .ab1 sekvensfiler for behandlede og kontroll (ubehandlede) prøver til Sporing av indels ved dekomponering (TIDE)16 for å kvantifisere indels på målstedet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering av plateable primære hepatocytter fra leveren
Den generelle prosessen med leverperfusjon og hepatocyttisolering er illustrert i figur 1. I dette eksperimentet ble villtype, 8-10 uker gamle C57BL6 / 6J mus brukt. Prosedyren forventes å gi 20-50 × 106 celler per mus med en levedyktighet mellom 85% og 95%. Hvis levedyktigheten er <70%, bør percollbehandling følges for å fjerne døde celler. Nyisolerte hepatocytter skal være belagt på kollagen I-belagte eller nitrogenholdige vevskulturplater. Innen 3-12 timer etter plating forventes hepatocytter å feste seg til platen, og cellemorfologien antar et typisk polygonalt eller sekskantet utseende innen 24 timer (figur 2). Hepatocytter er de eneste cellene i leveren som lagrer glukose i form av glykogen. For å verifisere renheten til de isolerte cellene, utføres glykogenfarging ved bruk av periodisk syre-Schiff-reagens ved 24 timer etter plating. Cytoplasmaet til de fargede hepatocytter fremstår magenta (figur 3).

Elektroporering av CRISPR-Cas9 RNPs og mRNA til isolerte musehepatocytter
Nylig isolerte musehepatocytter ble elektroporert med eGFP mRNA, Cas9 mRNA sammen med Hpd-målrettet sgRNA eller Cas9-protein kompleks med Hpd-sgRNA (RNP). Hpd-sgRNA ble kjemisk modifisert med 2′-O-metylfosforotioatforbindelser til de første og tre siste påfølgende nukleotidene på 5 'og 3' ender14. Streptococcus pyogenes Cas9 ble brukt til eksperimenter. Hepatocytter ble avbildet 24 timer etter elektroporering ved hjelp av et fluorescensmikroskop, og prosentandelen GFP-positive celler ble talt i bildene (figur 4A). I gjennomsnitt var 89,8 % [område 87,1 %-92,4 %] av hepatocyttene GFP-positive. 3 dager etter elektroporering ble Cas9-induserte innsettinger og delesjoner (indels) i Hpd-lokus analysert ved hjelp av TIDE16. Resultatene viser on-target indels på 47,4% i hepatocytter elektroporert med CRISPR-Cas9 mRNA og 78,4% indels for Cas9 RNP (figur 4B). MTT- og albuminanalyser ble utført for å evaluere hepatocyttens levedyktighet og funksjonalitet etter elektroporering av CRISPR-Cas9. MTT-resultatene viser en levedyktighet på henholdsvis 35,4% og 45,9% i hepatocytter behandlet med CRISPR-Cas9 mRNA og RNP (figur 4C). I samsvar med MTT-resultatene var de normaliserte albuminnivåene 31,8 % i hepatocytter behandlet med Cas9 mRNA og 34,5 % for Cas9 RNP (figur 4D).

Figure 1
Figur 1 Skjematisk av hepatocyttperfusjons- og isolasjonsprotokollen. Etter kanylering av den dårligere vena cava, blir portalvenen kuttet, og Perfusion Solutions 1, 2 og 3 pumpes gjennom leveren. Leverkapselen brister, og celler frigjøres ved hjelp av en celleløfter. Frigjorte celler er anstrengt og sentrifugert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Nyisolerte primære hepatocytter. Hepatocytter isolert fra C57BL/6J mus ble belagt på kollagen I-belagte 6-brønns plater med Hepatocyte Plating Media. Bilder tatt ved 24 timer etter plating. Skalalinje = 400 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Glykogenfarging. Nyisolerte primære musehepatocytter ble farget for glykogen for å bekrefte renhet. Farging ble gjort ved hjelp av Schiff Reagent ved 24 timer etter plating. Cytoplasma av de fargede hepatocytter virker magenta. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Elektroporering av HPD-målrettet CRISPR-Cas9 til nyisolerte primære musehepatocytter. (A) Fasekontrast og grønn fluorescensmikroskopibilder av nyisolerte musehepatocytter ved 24 timer etter elektroporering. Bilder i øvre rad er hepatocytter transfisert med eGFP mRNA og bildene i nedre rad er utransfiserte kontrollhepatocytter. Skalastenger = 400 μm. (B) On-target indels for musehepatocytter elektroporert med Cas9 mRNA kombinert med sgRNA eller RNP. (C) Levedyktighet normalisert til utransfiserte kontrollhepatocytter i MTT-analyse ved 24 timer etter elektroporering. (D) Albuminnivåer i betinget medium normalisert til utransfiserte kontrollhepatocytter målt ved 24 timer etter elektroporering (n = 3) med to tekniske replikasjoner. Statistisk analyse ble utført ved uparrede t-tester. Dette tallet ble endret fra 14. Forkortelser: Hpd = 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase; CRISPR = gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner; Cas9 = CRISPR-assosiert protein 9; sgRNA = enkelt guide RNA; RNP = ribonukleoprotein; INDEL = innsetting-sletting; MTT = 3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5 difenyltetrazoliumbromid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Feilsøking for protokollen for leverperfusjon og hepatocyttisolering. Denne tabellen fremhever vanlige problemer som oppstår under protokollen og foreslår mulige løsninger. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende figur S1: Mus i bukhulen under operasjonen. Kateter settes inn i nedre vena cava (blå prikk) før nyregrenene (ikke sett). Forkortelser: L = Liver; K = Nyre; I = Tynntarm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S1: Cas9-guide og PCR-primersekvenser. Guidesekvensen og PAM for sgRNA rettet mot Hpd, og PCR-primersekvenser for forsterkning av Hpd. Forkortelser: Hpd = 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase; CRISPR = gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner; Cas9 = CRISPR-assosiert protein 9; sgRNA = enkelt guide RNA; PAM = protospacer-tilstøtende motiv. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trinnene som er skissert i protokollen for hepatocyttisolasjon er utfordrende og krever øvelse for ferdigheter. Det er flere viktige trinn for vellykket hepatocyttisolasjon fra leveren. For det første er riktig kanylering av den dårligere vena cava avgjørende for fullstendig leverperfusjon. Fravær av blanchering i leveren etter perfusjon indikerer forskyvning av kateteret (tab 1). Den nedre vena cava (retrograd perfusjon) ble kanylert i prosedyren fordi den er enklere og mer tilgjengelig enn portalvenen (antegrad perfusjon)17,18. Noen protokoller bruker suturer for å sikrekateteret 19; Suturer kompliserer imidlertid prosessen. Suturering av kateteret kan føre til uønskede utfall, for eksempel feilplassering av kateteret og gjør det umulig å justere posisjonen. I tillegg er det mulig å utføre kanyleringen i leveren uten å fjerne nålen, noe som kan forenkle leveren perfusjon ytterligere. Det er unødvendig å koble pumpen til kateteret med nålen i venen. I tillegg er det redusert mulighet for ved et uhell å trekke ut kateteret og danne blodpropper. Å sette inn bare spissen av kateteret med en flat vinkel i forhold til venen forbedret kanyleringen. Den dårligere vena cava har flere grener, så å sette kateteret på feil sted vil forårsake perfusjon i en annen del av kroppen og ikke leveren (tabell 1). Dermed er det viktig å plassere kateteret på et sted som unngår grenene. Den vaskulære strukturen vil variere litt mellom forskjellige mus; Derfor er det viktig å undersøke venene før kanylering for å bestemme det beste stedet for injeksjon av kateteret. Tilbakestrømningen av blod inne i kateteret etter fjerning av nålen er en utmerket indikasjon på riktig kanylering. Riktig kanylering kan også kontrolleres ved å se etter hevelse i leveren når trykket påføres portalvenen et øyeblikk (trinn 1.3.13).

Ved isolering av hepatocytter er det andre kritiske trinnet å gjenkjenne når fullstendig leverfordøyelse har skjedd. Enzymkvaliteten og konsentrasjonen er avgjørende for riktig fordøyelse. I motsetning til protokollene som finnes i 20,21, foreslår denne protokollen å bruke Liberase, bestående av to kollagenaseisoformer, fordi det gir bedre konsistens i enzymaktivitet og redusert batch-til-batch-variasjon enn vanlig kollagenase22. Variasjoner i fordøyelsesenzymkvalitet og aktivitet kan forårsake inkonsekvenser i isolasjonen. Det er viktig å overvåke leveren under fordøyelsen og stoppe fordøyelsen umiddelbart etter at leveren har myknet. En fordøyd lever vil være fleksibel og vise et tap i elastisitet verifisert ved å deprimere leveren ved hjelp av tang eller bomullspinner for å bekrefte at innrykk dannes uten at vevet spretter tilbake. I denne protokollen er den maksimale mengden Liberase-oppløsning anbefalt per lever 50 ml; et høyere volum vil resultere i over fordøyelsesbesvær. Hvis kanyleringen er perfekt utført, er 30 ml av Liberase-løsningen tilstrekkelig for å oppnå riktig fordøyelse. De siste kritiske trinnene i prosedyren er isolasjons- og vasketrinnene. Etter å ha dissekert leveren og overført den til en steril petriskål som inneholder iskald DMEM med FBS, er det avgjørende å unngå å kutte leveren i stykker. På dette stadiet, bruk en celleløfter for å frigjøre cellene forsiktig og maksimere cellens levedyktighet. Å vippe parabolen for å senke leveren i DMEM letter frigjøringen av celler fra kapselen til suspensjon og må gjøres sakte og på is. Det skal være lett å forstyrre Glissons kapsel under frigjøringstrinnet, og mediet skal bli overskyet og brunt. Vanskeligheter ved forstyrrelse av kapselen er en indikator på dårlig fordøyelse (tabell 1).

Denne protokollen er egnet for å generere høye nivåer av CRISPR-Cas9-redigeringer i nyisolerte musehepatocytter. Indels generert av Cas9 RNP og mRNA ble sammenlignet i studien. Høyere nivåer av genredigering ble observert i hepatocytter elektroporert med Cas9 RNP enn mRNA, noe som stemmer overens med funn fra andre studier 14,23,24. Fordelen med Cas9 RNP over mRNA er at det gir lavere off-target redigering siden Cas9-proteinet eksisterer i cellen i kortere perioder enn mRNA23,24. Fordi effektiviteten til sgRNA varierer basert på design og målsted, bør flere sgRNA utformes og testes for redigeringseffektivitet ved genet av interesse. Velg design med høyere spesifisitetspoeng når du velger mellom sgRNA som har høy geneffektivitet. Hvis genredigering er konsekvent lav, bør du vurdere å levere en reporter, for eksempel eGFP mRNA, for å bekrefte levering. Lave nivåer av eGFP-positive celler etter elektroporering kan indikere utløpt elektroporeringsbuffer, problemer med elektroporeringsanordningen eller luftbobler i reaksjonen. Hvis det er høyt antall eGFP-positive celler, men lav redigeringseffektivitet, kan du teste sgRNA-designet i en cellelinje for å bekrefte redigeringsaktivitet og justere mengdene Cas9 og sgRNA som er elektroporert i celler. Til slutt, vurder metoden som brukes til å evaluere redigeringsaktivitet. Gelbaserte analyser, for eksempel T7 Endonuklease I, kan underrapportere genredigering på grunn av lav følsomhet for 1 bp mismatches på kuttstedet. Dyp sekvensering er den mest nøyaktige metoden for å kvantifisere Cas9-genredigering, spesielt for hendelser med lav redigering på off-target-steder.

Et annet utfordrende aspekt ved protokollen er dyrking av nyisolerte hepatocytter etter elektroporering. Brukere må håndtere celler forsiktig under hvert trinn i protokollen for å oppnå levedyktige, plateable hepatocytter etter elektroporering. Unngå å spre hepatocytter ved virvel; I stedet vugger hetteglasset med celler forsiktig inntil cellene blir resuspendert. Ved overføring av hepatocytter, bruk pipettespisser med bred boring for å opprettholde levedyktigheten. Inkubering av kyvettene på is i 15 minutter etter elektroporering gjør at cellemembranen kan reseal og forbedre levedyktigheten. Etter plating, plasser platen i inkubatoren og flytt platen forsiktig horisontalt og vertikalt i en nord-til-sør og øst-til-vest-bevegelse for å sikre at hepatocyttene sprer seg jevnt og opprettholder cellens levedyktighet. Hvis hepatocytter ikke klarer å feste seg til platen, bør du vurdere å øke antall celler til 1,3 × 106 i elektroporeringsreaksjonen.

En lovende applikasjon for protokollen er genereringen av musemodeller av menneskelige IMDer i leveren. Musehepatocytter som er positive for genkodingen for fumarylacetoacetathydrolase (Fah) har vist seg å effektivt transplantere og repopulere leveren etter transplantasjon hos Fah-mangelfulle (Fah-/-) mus25. En ny tilnærming for å utvikle musemodeller av IMDs i leveren er ved å elektroporere CRISPR-Cas9 i villtype mushepatocytter for å introdusere redigeringer assosiert med en sykdom, etterfulgt av transplantasjon av genredigerte hepatocytter i Fah-/- mus. De Cas9-redigerte hepatocytter ville ha en naturlig selektiv fordel etter transplantasjon sammenlignet med de innfødte Fah-mangelfulle cellene for å repopulere leveren.

Avslutningsvis utstyrer denne protokollen brukere med kapasitet til å isolere primære hepatocytter fra muselever, etterfulgt av genredigering ved hjelp av CRISPR-Cas9 mRNA og RNPs. Protokollen kan modifiseres for bruk i forskjellige stammer av mus for å studere ulike typer genetiske sykdommer som påvirker leveren in vitro og in vivo og teste terapeutiske tilnærminger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å avsløre.

Acknowledgments

RNC mottok finansiering fra South Carolina Bioengineering Center of Regeneration and Formation of Tissues Pilot grant støttet av National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) fra National Institutes of Health, American Association for the Study of Liver Diseases Foundation og American Society of Gene &Cell Therapy under tilskuddsnummer P30 GM131959, 2021000920, og 2022000099, henholdsvis. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til American Society of Gene &Cell Therapy eller American Association for the Study of Liver Diseases Foundation. Skjemaet for figur 1 ble opprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural USA Scientific 1402-4700
6-well Collagen Plates Advanced Biomatrix 5073
accuSpin Micro 17R Fisher Scientific 13-100-675
All-in-one Fluorescent Microscope Keyence BZ-X810
Analog Vortex Mixer VWR 97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL ThermoFisher Scientific 2079GPK
Automated Cell Counter Bio-Rad Laboratories TC20
Blue Wax Dissection Tray Braintree Scientific Inc. DTW1 9" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifter Argos Technologies UX-04396-53 Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL) Fisher Scientific 339650
Conical tubes (50 mL) Fisher Scientific 14-432-22
Cotton applicators Fisher Scientific 22-363-170
Curved scissors Cooper Surgical 62131
Disposable Petri Dishes Falcon 351029 100mm,sterile
Disposable Petri Dishes VWR 25373-100 35mm, sterile
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Instruments 250082
Falcon Cell strainer (70 µm) Fisher Scientific 08-771-2
Forceps Cooper Surgical 61864 Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters  BD 382612 24 G x 0.75 in
IV infusion set Baxter 2C6401
MyFuge 12 Mini Centrifuge Benchmark Scientific 1220P38
Needles Fisher Scientific 05-561-20 25 G
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001 Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic Pump Masterflex  HV-77120-42 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubing Masterflex HV-96410-14 25 ft, silicone
Primaria Culture Plates Corning Life Sciences 353846 Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL) Fisher Scientific 12-567-604
Syringes BD 329464 1 mL, sterile
T100 Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories 1861096
Water bath ALT 27577 Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 IDT 1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL Fisher Scientific NC9959336
CleanCap Cas9 mRNA Trilink Biotechnologies L-7606-100
CleanCap EGFP mRNA Trilink Biotechnologies L-7201-100
Corning Matrigel Matrix Corning Life Sciences 356234
DMEM ThermoFisher Scientific 11885076 Low glucose, pyruvate
Ethanol 70% VWR 71001-652
Fetal bovine serum Thermoscientific 26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM) Lonza MM250
Hepatocyte Plating Medium (PM) Lonza MP100
Mouse Albumin ELISA Kit Fisher Scientific NC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit Lonza VPL-1004
OneTaq HotStart DNA Polymerase New England Biolabs M0481L
PBS 10x pH 7.4  Thermoscientific 70011-044 No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution) Santa Cruz Biotechnology sc-500790A
Periodic acid Sigma-Aldrich P7875-25G
Permount Mounting Medium VWR 100496-550
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen Corporation QE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagent Sigma-Aldrich S5133
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher Scientific 25200056 Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability Assay ThermoFisher Scientific V13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)  Stable at 4 °C for 2 months
EBSS Fisher Scientific 14155063 Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M) Bioworld 40520008-1 200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M) ThermoFisher Scientific AAJ16924AE 2 mL 
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)  Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM) Sigma C7902-500G 360 µL of 1 M stock 
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) Fisher Scientific 14-155-063 Complete to 200 mL
HEPES (1 M) ThermoFisher Scientific AAJ16924AE 2 mL 
MgSO4·7H20 (0.8 mM) Sigma 30391-25G 160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3  Prepared fresh prior to use
Solution 2 50 mL
Liberase Roche 5401127001 0.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail 
Acepromzine 0.25 mg/mL final concentration
Ketamine 7.5 mg/mL final concentration
Xylazine 1.5 mg/mL final concentration
Software URL
Benchling https://www.benchling.com/
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decomposition https://tide.nki.nl/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
  2. Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
  3. Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
  4. Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
  5. OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver. , Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019).
  6. Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
  7. Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
  8. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  9. Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).
  10. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  11. Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
  13. Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
  14. Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
  15. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2022).
  16. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  17. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  18. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
  19. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  20. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
  21. Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
  22. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  23. Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
  24. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  25. Grompe, M. Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. Tanguay, R. M. , Springer International Publishing. 215-230 (2017).

Tags

Bioteknologi utgave 184
Elektroporeringsmediert levering av Cas9 ribonukleoproteiner og mRNA i nyisolerte primære musehepatocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rathbone, T., Ates, I., Stuart, C.,… More

Rathbone, T., Ates, I., Stuart, C., Parker, T., Cottle, R. N. Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes. J. Vis. Exp. (184), e63828, doi:10.3791/63828 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter