Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Cas9 Ribonükleoproteinlerin ve mRNA'nın Yeni İzole Edilmiş Primer Fare Hepatositlerine Elektroporasyon Aracılı Verilmesi

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63828
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Bioengineering, Clemson University, 2Godley Snell Research Center, Clemson University
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, primer fare hepatositlerini karaciğerden izole etme ve karaciğerin kalıtsal bir metabolik hastalığı ile ilişkili terapötik bir hedef geni bozmak için CRISPR-Cas9'u ribonükleoproteinler ve mRNA olarak elektroporasyon tekniklerini açıklar. Tarif edilen yöntemler, elektroporasyondan sonra yüksek canlılık ve yüksek düzeyde gen modifikasyonu ile sonuçlanır.

Abstract

Bu protokol, primer fare hepatositlerini izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntemi ve ardından CRISPR-Cas9'un ribonükleoproteinler (RNP'ler) ve mRNA olarak elektroporasyon aracılı olarak verilmesini açıklar. Primer fare hepatositleri, karaciğer başına 50 × 106 hücreye kadar yüksek verim ve% >85 hücre canlılığı ile sonuçlanan üç aşamalı retrograd perfüzyon yöntemi kullanılarak izole edildi. Bu protokol, hepatositlerin kaplanması, boyanması ve kültürlenmesi için ayrıntılı talimatlar sağlar. Sonuçlar, elektroporasyonun, yeşil floresan protein (GFP)-pozitif hücrelerin yüzdesi ve fare hepatositlerinde% >35'lik mütevazı hücre canlılığı ile ölçüldüğü gibi% 89'luk yüksek bir transfeksiyon verimliliği sağladığını göstermektedir.

Bu yaklaşımın yararlılığını göstermek için, hidroksifenilpiruvat dioksijenaz genini hedef alan CRISPR-Cas9, karaciğerin kalıtsal bir metabolik hastalığı (IMD) ile ilgili terapötik bir geni bozmak için prensip kanıtı gen düzenlemesi olarak birincil fare hepatositlerine elektroporate edildi. RNP'ler için% 78'lik daha yüksek bir hedef üzerinde düzenleme, mRNA ile% 47 düzenleme verimliliğine kıyasla gözlenmiştir. Hepatositlerin işlevselliği, CRISPR-Cas9'un RNP'ler ve mRNA olarak verilmesinin, primer fare hepatositlerinde karşılaştırılabilir hücre canlılığı ile sonuçlandığını gösteren bir albümin testi kullanılarak in vitro olarak değerlendirildi. Bu protokol için umut verici bir uygulama, karaciğeri etkileyen insan genetik hastalıkları için fare modellerinin üretilmesidir.

Introduction

Karaciğerin IMD'leri, toksik metabolitlerin birikmesine yol açan metabolizmada rol oynayan çok önemli bir hepatik enzimin eksikliği ile karakterize genetik bozukluklardır. Tedavi olmadan, karaciğerin IMD'leri organ yetmezliği veya erken ölümle sonuçlanır 1,2. Karaciğer IMD'leri olan hastalar için tek küratif seçenek, donör organların düşük mevcudiyeti ve prosedürü takiben immünsüpresif tedaviden kaynaklanan komplikasyonlar nedeniyle sınırlı olan ortopik karaciğer transplantasyonudur 3,4. Organ Tedarik ve Transplantasyon Ağı tarafından toplanan son verilere göre, karaciğer nakli bekleme listesindeki yetişkin hastaların sadece% 40-46'sı bir organ alırken, bu hastaların% 12.3'ü bekleme listesindeyken ölmektedir5. Ayrıca, tüm nadir karaciğer hastalıklarının sadece% 5'inde FDA onaylı bir tedavivardır 6. Karaciğerin IMD'leri için yeni tedavilere kritik bir ihtiyaç olduğu açıktır. Bununla birlikte, yeni tedavi seçenekleri geliştirmek için uygun hastalık modelleri gereklidir.

İn vitro ve in vivo sistemleri kullanarak insan hastalıklarının modellenmesi, etkili tedavilerin geliştirilmesi ve karaciğerin IMD'lerinin patolojisinin incelenmesi için bir engel olmaya devam etmektedir. Nadir karaciğer hastalığı olan hastalardan hepatositlerin elde edilmesi zordur7. Hayvan modelleri, hastalık patolojisi hakkında bir anlayış geliştirmek ve terapötik stratejileri test etmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, bir engel, ölümcül mutasyonlar taşıyan embriyolardan modeller üretmektir. Örneğin, Jag1 geninin 5′ ucuna yakın 5 kb'lik bir dizinin homozigot delesyonlarını içeren embriyolarla Alagille Sendromu'nun (ALGS) fare modellerini oluşturma girişimleri, embriyoların erken ölümüyle sonuçlandı8. Ek olarak, embriyonik kök hücrelerde gen düzenleme ile fare modelleri oluşturmak zaman ve kaynak yoğunolabilir 9. Son olarak, mutasyonlar hedeflenen dokunun dışında ortaya çıkacak ve hastalığın incelenmesini engelleyebilecek kafa karıştırıcı değişkenlere yol açacaktır9. Somatik gen düzenleme, karaciğer dokusunda daha kolay düzenlemeye izin verir ve embriyonik kök hücreleri kullanarak modeller üretmekle ilgili zorlukları atlar.

Elektroporasyon, hücre zarını geçirgenleştirmek için yüksek voltajlı akımlar uygulayarak CRISPR-Cas9'un doğrudan çekirdeğe verilmesini sağlar ve insan embriyonik kök hücreleri, pluripotent kök hücreler ve nöronlar gibi transfeksiyon tekniklerine aykırı olanlar da dahil olmak üzere birçok hücre tipiyle uyumludur10,11,12 . Bununla birlikte, düşük canlılık, elektroporasyonun potansiyel bir dezavantajıdır; prosedürün optimize edilmesi, toksisiteyi sınırlarken yüksek düzeyde doğum sağlayabilir13. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, CRISPR-Cas9 bileşenlerinin birincil fare ve insan hepatositlerine elektroporasyonunun fizibilitesini oldukça verimli bir yaklaşım olarak göstermektedir14. Hepatositlerde Ex vivo elektroporasyon, karaciğerin insan IMD'leri için yeni fare modelleri üretmek için uygulanma potansiyeline sahiptir.

Bu protokol, fare hepatositlerini karaciğerden izole etmek ve daha sonra Cas9 proteini ve sentetik tek kılavuzlu RNA'dan (sgRNA) oluşan RNP kompleksleri olarak CRISPR-Cas9'u elektroporize etmek için ayrıntılı bir adım adım prosedür sağlar veya Cas9 mRNA, yüksek düzeyde hedef gen düzenlemesi elde etmek için sgRNA ile birleştirilmiştir. Ek olarak, protokol, CRISPR-Cas9'un yeni izole edilmiş fare hepatositlerine elektroporasyonunu takiben gen düzenleme verimliliğini, canlılığını ve işlevselliğini ölçmek için yöntemler sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan deneylerinin tümü, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi yönergelerine ve Clemson Üniversitesi'ndeki onaylanmış protokollere uygun olarak gerçekleştirildi. Cerrahi prosedürler anestezi uygulanan vahşi tip C57BL/6J farelerde 8-10 haftalıkken yapıldı.

1. Hayvan cerrahisi

  1. Çözeltilerin ve aletlerin hazırlanması
    NOT: Perfüzyon solüsyonları ve anestezi kokteyli tarifleri Malzeme Tablosunda gösterilmiştir.
    1. Perfüzyon Çözeltisi 1 (HEPES, EGTA ve EBSS), Perfüzyon Çözeltisi 2'yi (HEPES, EGTA, EBSS, CaCl 2 ve MgSO4) ve Perfüzyon Çözeltisi 3'ü (Çözüm2 ve Liberaz) hazırlayın. Çözeltilerin iyi karıştırıldığından emin olun.
    2. Su banyosunu 42 ° C'ye ayarlayın ve işleme başlamadan önce Perfüzyon Çözeltileri 1, 2 ve 3'ü en az 30 dakika ısıtın ve su banyosunda tutun.
      NOT: Perfüzyon Çözeltileri 1 ve 2, kalsiyumu şelatlayacak ve karaciğerdeki kanı temizleyecektir. Perfüzyon Çözeltisi 3, hücre dışı matrisi ayrıştırmak için sindirim enzimi liberaz içerir.
    3. Konik tüplere 150 mL DMEM + %10 fetal sığır serumu (FBS) yerleştirin ve buz üzerinde tutun.
      NOT: Bu ortam, hücreleri karaciğer kapsülünden serbest bırakmak ve izole hepatositleri sırasıyla adım 2.1 ve 2.2'de yıkamak için kullanılacaktır.
    4. Santrifüjü 4 °C'ye ayarlayın.
    5. Borunun her iki ucunu %70 etanol ile dolu bir şişeye yerleştirerek ve etanolün dönüşümünü üç kez yaparak pompa borusunu sterilize edin.
    6. Boruyu damıtılmış suyla yıkayın ve boşaltın.
    7. Boruyu önceden ısıtılmış 30 mL Perfüzyon Çözeltisi 1, ardından 8 mL Perfüzyon Çözeltisi 2 ile doldurun. Boruda hala daha fazla sıvı için yer varsa, borunun geri kalanını Perfüzyon Çözeltisi 3 ile doldurun. Boruya hava kabarcıkları girmesini önlemek için farklı bir perfüzyon çözeltisine geçerken pompayı durdurun.
    8. Perfüzyon çözeltilerini sıcak tutmak için fazla boruyu 42 °C su banyosuna yerleştirin.
    9. Pompa borusunun ucunu, su banyosunda tutulurken Perfüzyon Çözeltisi 3 içeren konik tüpe yerleştirin.
      NOT: Bu adım, pompanın perfüzyon sırasında Perfüzyon Çözeltisi 3 ile sürekli olarak dolmasını sağlamak için gereklidir.
  2. Hayvan hazırlığı
    1. Anestezik kokteyli intraperitoneal olarak 10-11.7 μL / g vücut ağırlığı dozunda enjekte ederek fareyi anestezi altına alın. Anestezik kokteyl 7.5 mg / mL ketamin, 0.25 mg / mL asepromazin ve 1.5 mg / mL ksilazin nihai konsantrasyonuna sahiptir.
    2. Farenin nefes almasını izleyin ve farenin ağrıya tepki vermediğini kontrol edin. Farenin dakikada ~ 55-65 nefes alma hızına sahip olmasını, ayak parmaklarının sıkışmasına tepki vermemesini ve sarkık bir kuyruğu olmasını bekleyin. Ek olarak, kapalı gözün medial tarafındaki cilde hafifçe dokunarak palpebral (yanıp sönme) refleksini kontrol edin. Fare yanıp sönerse veya göz kasları seğirirse, tüm anestezik kokteylin dozunu 5-10 μL arttırın.
    3. Fareyi sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve uzuvları pimler veya bant kullanarak yüzeye sabitleyin (Ek Şekil S1).
    4. Karnı% 70 etanol ile püskürtün ve bir pamuk topu kullanarak kurulayın.
  3. Karaciğer perfüzyonu
    1. Makas kullanarak karın derisinde U şeklinde bir yanal kesi yapın ve deliği yanlardan genişletin.
    2. Cildi göğüs kafesine açmaya devam edin.
    3. Makas kullanarak, karın boşluğunu göğüs kafesine kadar maruz bırakmak için periton boyunca kesin, herhangi bir organı kesmemeye dikkat edin. Forsepsin arkasını veya makasın künt yüzeyini kullanarak bağırsakları sağ tarafa hareket ettirin. İnferior vena kava ve portal veni tanımlayın (Ek Şekil S1).
    4. Önceden ısıtılmış perfüzyon solüsyonunu kateterden temizlemek için pompayı çalıştırın.
    5. Pompayı durdurun ve tüm hava sistemden atıldıktan sonra kateteri çıkarın. Katetere bağlı iğnenin ucunu inferior vena kavaya damara 10°-20° açıyla yerleştirin. İğneyi kateterden çıkarın ve kateteri damara paralel bir hareketle yavaşça damarın içine itin.
      NOT: Kullanıcı, damardaki uygun kanülasyonu doğrulamak için kateterdeki kanın geri dönüşünü gözlemlemelidir.
    6. Kateteri damarın içine daha fazla hareket ettirmeden tüpü kateterle bağlayın.
    7. Pompayı 2 mL/dak debi ile çalıştırın. Perfüzyonun başarılı olduğunun bir işareti olarak karaciğerin hemen soluklaşmasını bekleyin.
    8. Portal damarı makas kullanarak kesin.
    9. Akış hızını kademeli olarak 5 mL / dak'ya yükseltin.
    10. Drenajı engellemek ve iyi perfüzyonu kolaylaştırmak için forseps veya pamuklu çubuk kullanarak yaklaşık kesim bölgesindeki portal vene periyodik olarak 3 s basınç uygulayın.
    11. Perfüzyon Çözeltisi 3 aktıktan sonra, karaciğerin elastikiyetini dikkatlice izleyin. Karaciğerin yumuşayıp yumuşamadığını belirlemek için, karaciğeri pamuklu çubukla veya forseps ile hafifçe bastırın ve karaciğerde girintilerin oluşup oluşmadığını kontrol edin. Hücre canlılığının kaybını önlemek için aşırı perfüzyon yapmamaya dikkat edin.
    12. Karaciğer yumuşatıldıktan sonra (30-50 mL Perfüzyon Çözeltisi 3 aktıktan sonra meydana gelir), pompayı durdurun, kateteri çıkarın ve karaciğeri dikkatlice diseke edin. Karaciğeri buz gibi soğuk DMEM +% 10 FBS ortamı içeren 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Safra kesesini tüketin, içeriğini dökmemeye dikkat edin. Olası kan pıhtılarını nazikçe çıkarmak için Petri kabını döndürün.
    13. Karaciğeri buz gibi soğuk DMEM +% 10 FBS ortamı içeren yeni bir Petri kabına aktarın.

2. Hepatosit izolasyonu

  1. Karaciğer kapsülünden hücreleri serbest bırakın.
    1. Petri kabını buz üzerine yerleştirin ve iki çift steril forseps kullanarak, karaciğer kapsülünü tüm loblarda yavaşça parçalayın. Hepatositleri serbest bırakmak için bir hücre kaldırıcı veya forseps kullanarak karaciğeri ortamda yavaşça döndürün. Karaciğer çok küçülene ve süspansiyon kahverengi ve opak hale gelene kadar bu harekete devam edin.
    2. Karaciğer dokusunun kalıntılarını plakadan çıkarın ve düşük hıza ayarlanmış 25 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu 100 μm'lik bir hücre süzgeci ile donatılmış 50 mL'lik bir konik tüpe (buz üzerinde önceden soğutulmuş) dikkatlice aktarın.
    3. Petri kabına taze, buz gibi soğuk DMEM +% 10 FBS ortamı ekleyerek kalan hücreleri yüzeyden yıkayın ve toplayın ve 50 mL konik tüpe aktarın. Tüm hücreler toplanana kadar bu adımı yineleyin.
  2. Hepatositleri parankimal olmayan hücrelerden yıkayın ve saflaştırın.
    1. 50 mL konik tüpte toplanan hücreleri, düşük yavaşlamada veya herhangi bir fren olmadan 5 dakika boyunca 4 ° C'de 50 × g'da santrifüj yapın.
    2. Enkaz ve parankimal olmayan hücreler içeren süpernatantı atın ve tüpü yavaşça döndürerek kalan süpernatanttaki peleti yeniden askıya alın. Pelet yeniden askıya alındıktan sonra, 30 mL taze, buz gibi soğuk DMEM +% 10 FBS ortamı ekleyin.
    3. Santrifüjlemeyi (adım 2.2.1) ve yıkamayı (adım 2.2.3) üç kez tekrarlayın.
    4. Son hücre peletini 10 mL buz gibi soğuk DMEM + %10 FBS ortamında yeniden askıya alın.
      NOT: Peletin yeniden askıya alınması için kullanılan ortamın hacmi, pelet boyutuna bağlıdır. Pelet 15 mm'den önemli ölçüde küçükse, 1-5 mL buz gibi soğuk DMEM +% 10 FBS ortamı kullanın.
  3. Hücre canlılığı ölçümü
    1. Bir mikrofüj tüpünde, 350 μL Hepatosit Kaplama Ortamına (PM) 50 μL% 0.4 Tripan Mavisi çözeltisi ekleyin. Ardından, son 1:5 seyreltme yapmak için 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet ekleyin.
    2. Bir hemositometre kullanarak hücre yoğunluğunu ve canlılığını sayın. Sayma sırasında, hepatosit süspansiyonunu buzun üzerine yerleştirin ve ardından hepatositlerin yerleşmesini önlemek için buz kovasını 30 rpm'ye ayarlanmış bir yörüngesel çalkalayıcıya yerleştirin.
    3. Hücre canlılığı% <70 ise, aşağıdaki Percoll tedavisi ve santrifüjleme adımlarını izleyin.
      1. Percoll'u 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 9: 1 oranında seyreltin.
      2. Hepatosit süspansiyonunu seyreltilmiş Percoll ile 1: 1 oranında karıştırın.
      3. 10 dakika boyunca 200 × g'da 4 ° C'de santrifüj.
      4. Ölü hücreler içeren süpernatantı atın. Peleti buz gibi soğuk DMEM +% 10 FBS ortamında yeniden askıya alın.
      5. Hücreleri tekrar sayın.
  4. Hepatositlerin plakalanabilirlik açısından test edilmesi
    1. Kollajen I kaplı 6 delikli plakalar üzerindeki hücrelerin bir kısmını 0.5 × 106 hücre yoğunluğunda 1.5 mL önceden ısıtılmış PM kullanarak mL başına plakalayın.
    2. Elektroporasyon yapmaya hazır olana kadar kalan hücreleri yörüngesel bir çalkalayıcıdayken buz üzerinde tutun.
    3. Hücre plakasını 37 C'de su ceketli bir CO2 inkübatöre yerleştirin Homojen kaplama sağlamak için plakayı kuzeyden güneye ve doğudan batıya doğru yatay ve dikey olarak yavaşça hareket ettirin. Hareketi her 1,5 saatte bir iki kez daha tekrarlayın.
    4. Kaplamadan sonra 3 saatte hücre bağlantısını doğrulayın.
      NOT: Hücrelerin en az% 60'ı, kaliteli hepatositlerin bir göstergesi olarak plakaya yapışmalıdır.
    5. Hücreleri kültürde tutmak için kaplamadan sonra 24 saatte ortamı önceden ısıtılmış Hepatosit Bakım Ortamına (MM) değiştirin.
  5. Glikojen boyama
    1. Hücreler 6 delikli kollajen I kaplı plakalara bağlandıktan sonra, harcanan ortamı kültürlenmiş hücrelerden çıkarın.
    2. Hücreleri buz gibi soğuk etanolde 10-15 dakika sabitleyin.
    3. Steril su ile iyice yıkayın.
    4. 5 dakika boyunca% 1 sulu periyodik asit içinde inkübe edin ve daha sonra steril suyla yıkayın.
    5. % 100 Schiff Reaktifinde 30 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Schiff reaktifi, hücrelere eklenmeden önce seyreltilmemelidir.
    6. 10 dakika boyunca üç kez suyla yıkayın.
    7. Montaj ortamına monte edin.
    8. Parlak alan ayarında mikroskop kullanarak görüntü.

3. CRISPR-Cas9 gen düzenlemesi için sgRNA'lar tasarlayın

NOT: Bu bölümde, karaciğerin IMD'si ile ilgili terapötik bir hedef geni bozmak için prensip kanıtı gen düzenlemesi olarak fare hidroksifenilpiruvat dioksijenaz (Hpd) genini hedef alan bir sgRNA'nın tasarımı açıklanmaktadır.

  1. Başvurulan yazılım15'i kullanarak Hpd'yi hedefleyen kılavuz dizisini tasarlayın.
  2. Ensembl Genome Browser ile Hpd dizisini doğrulayın.
  3. gRNA'yı tasarlamak için aşağıdaki parametreleri kullanın: 20 nükleotidin tek kılavuz uzunluğu ve bir NGG (N herhangi bir nükleotid olabilir) protospacer-bitişik motif (PAM) dizisi.
  4. Hpd'deki ekzon 3'ten bir hedef bölge seçin.
  5. Hedef bölgeden Hedef ve Hedef Dışı Puanlarla kılavuz dizilerinin bir listesini oluşturun.
    NOT: Hedef Üzerinde Puan, verilen tasarım için öngörülen hedef üzerinde düzenleme verimliliğini gösterir: daha yüksek bir puan, daha yüksek düzenleme verimliliği ile ilişkilidir. Hedef Dışı Puan, kılavuz dizisinin özgüllüğü ile ilişkilidir: daha yüksek bir puan, hedef dışı düzenleme olasılığının daha düşük olduğunu gösterir. İdeal olarak her iki puan da yüksek olmalıdır: Hedef Üstü Puan >60 ve Hedef Dışı Puan >50.
  6. En yüksek Hedef İçi ve Hedef Dışı Puanlara sahip kılavuz dizisini seçin. Kılavuz dizisini içeren sgRNA'nın kimyasal olarak sentezlenmesini sağlayın.

4. Elektroporasyon ve hücre kültürü

  1. CRISPR-Cas9 substratlarının, ortamlarının, hücrelerinin ve elektroporasyon cihazının hazırlanması
    1. Beraberindeki tüm takviyeyi PM'ye ekleyin ve 37 ° C su banyosunda 10 dakika boyunca ısıtın.
    2. Güç düğmesine basarak elektroporasyon cihazını açın ve ekranda T-028 programı görünene kadar x düğmesine ve ardından aşağı ok düğmesine basarak elektroporasyon programını ayarlayın.
    3. Altı kuyucuklu kollajen I kaplı plakalara 1,5 mL PM ekleyerek elektroporatörlü hepatositler için hedef kuyuları hazırlayın. Plakaları kullanıma hazır olana kadar 37 °C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
    4. Beraberindeki tüm takviyeyi elektroporasyon tampon çözeltisine ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Elektroporasyon tamponunun son kullanma tarihini şişe üzerinde etiketleyin (ek ekleme tarihinden 3 ay sonra).
    5. Elektroporasyon kaplarını ambalajdan çıkarın ve her numune için etiketleyin.
    6. PCR bölünmüş şeritli tüplerde, 30 μg sgRNA'yı 300 pmol Cas9 proteini ile birleştirerek Cas9 RNP komplekslerini hazırlayın ve kompleksleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Cas9 mRNA'yı, 30 μg sgRNA'yı 4 μL Cas9 mRNA (1 μg / μL) ile birleştirerek hazırlayın. mRNA-sgRNA karışımını elektroporasyona kadar buz üzerinde saklayın. Floresan mikroskobu kullanarak başarılı elektroporasyonu doğrulamak için ayrı ayrı 1.0 μg eGFP mRNA içeren bir tüp hazırlayın.
    7. Santrifüj 1.2 × 4 ° C'de 2 dakika boyunca 100 × g'da elektroporasyon reaksiyonu başına 106 hücre.
    8. Süpernatantı hücre peletinden çıkarın ve tüp duvarının yan tarafı boyunca reaksiyon başına 100 μL elektroporasyon çözeltisi ekleyin. Elektroporasyon çözeltisindeki hepatositleri, tüpü elle hafifçe sallayarak yeniden askıya alın.
  2. CRISPR-Cas9 RNP'lerin ve mRNA'nın hepatositlere elektroporasyonu
    1. Hepatositler elektroporasyon çözeltisinde eşit olarak dağılmış olarak göründüğünde, hepatosit süspansiyonunun 100 μL'sini Cas9 komplekslerini içeren şerit tüplere aktarın.
      NOT: Hücre canlılığını korumak için hepatositleri aktarırken geniş delikli pipet uçları kullanın.
    2. Şeridin içeriğini bir elektroporasyon kabına iyice aktarın.
    3. Nükleovette kabını elektroporasyon cihazındaki yuvaya yerleştirin. X düğmesine basarak hepatositleri elektroporat yapın. Elektroporasyondan sonra, cihazda Tamam yazan bir ekranın açılmasını bekleyin. X düğmesine tekrar basın ve kabı çıkarın.
    4. Elektroporated kabı 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
    5. Elektroporasyon kabına 500 μL önceden ısıtılmış PM ekleyin.
    6. Elektroporasyon reaksiyonunun 300 μL'sini, önceden ısıtılmış plaka üzerindeki her bir hedefe iyi bir şekilde aktarın.
      NOT: Elektroporasyon reaksiyonu başına iki hedef kuyu bulunmalıdır. Gen düzenleme verimliliğini ölçmek için bir kuyu kullanılacaktır; diğer kuyu MTT ve albümin tahlilleri için kullanılacaktır.
    7. Hepatositlerin kuyunun merkezinde birikmesini önlemek için, plakaları kuzeyden güneye ve doğudan batıya doğru yatay ve dikey olarak hafifçe hareket ettirerek hücreleri dağıtın. Plakanın hareket ettirilirken inkübatör rafı ile teması koruduğundan emin olun. Elektropoze hepatositleri kapladıktan sonra bu hareketi 15, 30, 45, 60 ve 90 dakikada tekrarlayın.
    8. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    9. Hücreleri kapladıktan 24 saat sonra gen düzenleme analizi için belirlenen kuyucuklardan ortamı çıkarın ve 0.25 mg / mL bazal membran matris kaplaması ile değiştirin.
      NOT: Dondurucuda saklanırsa, membran matrisini 4 °C'ye aktarın ve çözülmesine izin verin. Bodrum membran matrisi 10 ° C'nin üzerinde katı olduğundan, bazal membran matrisinin kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde veya 4 ° C'de kalması çok önemlidir.

5. 0.25 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyon vermek için MM ile karıştırılacak membran matrisinin hacmini hesaplayın

NOT: 6 delikli bir plaka için, kuyu başına 2 mL kaplama gereklidir.

6. Membran matrisinin hesaplanan hacmini buz gibi soğuk MM'ye ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın

  1. Bindirme karışımını yavaşça hücrelerin üzerine pipetleyin ve plakayı 37 °C inkübatöre geri yerleştirin.
  2. Ortamı her 24 saatte bir taze bakım ortamıyla değiştirin.
  3. Kaplamadan sonra 24 saatte, şartlandırılmış ortamı MTT ve albümin tahlilleri için iyi belirlenmiş olandan aktarın. Albümin tahlilini yapmaya hazır olana kadar şartlandırılmış ortamı bir mikrofüj tüpünde saklayın. MTT testi için adım 7.1'e geçin.
    NOT: Kısa süreli depolama için (bir günden az) şartlandırılmış ortamı 4 °C'de saklayın. Daha uzun süre saklamak için, ortamı -80 ° C'de saklayın.

7. Elektroporated fare hepatositlerinde teslimat verimliliği, canlılık ve hedef üzerinde düzenleme analizi

  1. MTT testi kullanılarak canlılık ölçümü
    1. Bir 5 mg MTT şişesine 1 mL PBS ekleyerek 12 mM MTT stok çözeltisi hazırlayın.
    2. Kuyucuklara 150 μL MTT stok çözeltisi ekleyin ve 24 saat boyunca inkübe edin.
    3. Kuluçkadan sonra, her bir oyuğa 1,5 mL sodyum dodesil sülfat-hidroklorür (SDS-HCl) çözeltisi ve ardından karıştırmak için pipet ekleyin.
    4. Plakayı 37 ° C'de 4 saat boyunca inkübe edin ve canlı hücreleri belirtmek için ortamın renginde berraktan mora doğru bir değişiklik olup olmadığına bakın.
    5. Her numuneyi bir pipet kullanarak tekrar karıştırın ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak emiciliği 570 nm'de okuyun.
    6. Eq (1) kullanarak Cas9 ile işlenmiş numuneler için normalleştirilmiş canlılığı hesaplayın:
      Equation 1 (1)
  2. Hepatosit fonksiyonelliğini değerlendirmek için albümin testi
    1. Şartlandırılmış ortamın 50 μL'sini, albümin kiti tarafından sağlanan plakadaki kuyucuklara aktarın. Kuyuları örtün ve oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya yatırın.
    2. Kuyucukları 200 μL yıkama tamponu ile 5 kat yıkayın.
    3. Her bir kuyucuğu kağıt mendil üzerine boşaltmak için plakayı ters çevirin ve birkaç kez dokunun.
    4. Yıkadıktan sonra, albümin tahlil kitinde sağlanan biyotinillenmiş antikorun 50 μL'sini her bir oyuğa ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
    5. Kuyuları yıkamak için 5.2.2-5.2.3 adımlarını tekrarlayın.
    6. Her bir kuyucuğa albümin tahlil kitinde sağlanan 50 μL streptavidin-peroksidaz ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    7. Adım 5.2.2'yi yineleyin.
    8. Albümin tahlil kitinde sağlanan kromojen substratından kuyu başına 50 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Eşit karıştırmayı sağlamak için plakaya hafifçe dokunun. Pipet ucu ile hava kabarcıklarını çıkarın.
    9. Son olarak, her bir kuyucuğa 50 μL durdurma çözeltisi ekleyin ve fonksiyonel hücreleri belirtmek için sarıdan maviye bir renk değişikliği arayın.
    10. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak emiciliği 450 nm'de okumaya hemen devam edin.
  3. eGFP mRNA ile elektroporated kuyucuklarda dağıtım verimliliğini tahmin edin.
    1. Elektroporasyondan 24 saat sonra hepatositlerin faz kontrastını ve yeşil floresan görüntülerini yakalayın. Kuyunun farklı yerlerinde üç fotoğraf çekin.
    2. Hücrelerin resimlerini ImageJ'ye yükleyin. Görüntü sekmesinin altında, görüntüyü gri tonlamaya dönüştürmek için Type | 16-bit (16 bit) seçeneğini belirleyin.
    3. Görüntüdeki hücre yapılarını vurgulamak için, Görüntü sekmesinin altında | Ayarla'yı seçin Eşik. Hücreleri vurgulamak için kaydırıcıyı ayarlayın.
    4. İşlem sekmesi altında, arka plan gürültüsünü gidermek için Arka Planı Çıkar'ı seçin.
    5. Analiz sekmesini tıklatarak hücreleri sayın ve ardından Parçacıkları analiz et'i seçin. Sayılan parçacıkların listesini oluşturmak için Tamam'ı tıklatın.
    6. Yeşil floresan görüntülerindeki sayılan parçacıkların sayısını, karşılık gelen faz kontrast görüntüsündeki sayılan parçacıkların sayısına bölerek GFP-pozitif hücrelerin yüzdesini hesaplayın.
  4. Hedef üzerindeki Cas9 aktivitesinin analizi
    1. Elektroporatörlü hücrelerden genomik DNA'yı ayıklayın.
      1. Elektroporasyondan 3 gün sonra plakadan ortamı çıkarın ve 500 μL% 0.25 tripsin ekleyin. 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Hepatositlerin plakadan ayrılmasını sağlamak için inkübasyondan sonra birkaç kez pipet.
      2. Tripsinize hücre süspansiyonunu mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 800 × g'da bir masa üstü santrifüjde döndürün. Eğirdikten sonra, tüpleri pelet için inceleyin.
      3. Tripsin içeren süpernatantı pipetle çekerek çıkarın. Pelet'i rahatsız etmediğinizden emin olun. Peleti 80 μL DNA ekstraksiyon çözeltisinde yeniden askıya alın. Peletin görülmesi zorsa, tüpün içeriğini 50 μL DNA ekstraksiyon çözeltisinde yeniden askıya alın.
      4. Peletin yeniden askıya alınmasını sağlamak için 30 sn boyunca vorteks. Süspansiyonu PCR bölünmüş şeritli tüplere aktarın ve termal döngüleyiciye yerleştirin. 95 °C'de 15 dakika ve 68 °C'de 8 dakika boyunca çalıştırın.
    2. Hedef lokusu PCR-yükseltin.
    3. DNA polimeraz kullanarak Hpd hedef bölgesini yükseltmek için aşağıda açıklanan prosedürü izleyin.
      1. 0.5 μL 10 mM dNTP, 0.5 μL 10 μM İleri astar, 0.5 μL 10 μM Ters astar, 0.125 μL Taq polimeraz, hepatositlerden ekstrakte edilen 5 μL genomik DNA ve 18.375 μL nükleaz içermeyen su içeren bir reaksiyon hazırlayın. Astar dizileri için Ek Tablo S1'e bakınız.
      2. Çözeltinin tüpün dibinde olduğundan emin olmak için PCR karışımını kısaca vorteks yapın ve hızlı bir şekilde santrifüj yapın.
      3. PCR karışımını bir termal döngüye yerleştirin ve şu koşullar altında yükseltin: denatürasyon için 30 s için 94 °C, 30 s için 94 °C'lik 30 döngü, tavlama için 45 s için 57 °C, 1 dakika için 68 °C ve 5 dakika için 68 °C'lik son uzatma.
        NOT: PCR reaksiyonu için tavlama sıcaklığı, astarların bileşimine bağlı olarak değişecektir. PCR yapmadan önce bir erime sıcaklığı hesaplayıcısı kullanmayı düşünün.
      4. Doğru ürün boyutunu onaylamak için, PCR ürünlerinin 3 μL'sini 2 μL su ve 1 μL 6x boya ile karıştırın. % 1,5'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın ve doğru ürün boyutunu onaylayın.
    4. Manyetik boncuklar kullanarak DNA'yı arındırın.
      NOT: Spin sütunları PCR temizliği için de kullanılabilir. Aşağıda manyetik boncuklar kullanarak PCR ürünlerini saflaştırmak için prosedürler bulunmaktadır.
      1. Manyetik boncukları 4 ° C'den çıkarın ve oda sıcaklığına ulaşmalarını sağlayın.
      2. Kısaca vorteks yapın ve PCR karışımını hızlı bir şekilde santrifüj edin.
      3. PCR karışımının hacmine× 1.8'e eşit bir boncuk hacmi ekleyin. Çözeltinin eşit şekilde karıştırıldığından emin olmak için PCR-boncuk karışımını 10x pipetleyin.
      4. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
      5. PCR-boncuk karışımını bir PCR plakasına aktarın ve manyetik bir plakaya yerleştirin.
      6. Mıknatıs üzerindeki plakayı 5 dakika boyunca inkübe edin. 5 dakika sonra, çözeltinin net olduğunu ve bir sonraki adıma geçmeden önce boncukların mıknatısa bağlandığını kontrol edin.
      7. Süper natantı atın.
      8. Kuyuya 200 μL% 70 etanol ekleyin ve 30 s boyunca inkübe edin.
        NOT: DNA kaybını önlemek için% 70 etanol, temizliği yapmadan kısa bir süre önce hazırlanmalıdır.
      9. Üst öğeyi atın ve adım 7.4.4.8'i yineleyin.
      10. Süpernatantı çıkarın ve etanol izlerini gidermek için oda sıcaklığında 3 dakika kurumaya bırakın.
      11. Plakayı mıknatıstan çıkarın ve numuneye 22 μL su ekleyin. Su ve boncukları karıştırmak için 10 kat yukarı ve aşağı pipet.
      12. Numuneleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe edin.
      13. Plakayı mıknatısa geri aktarın ve 3 dakika boyunca veya çözelti temizlenene kadar inkübe edin.
      14. Numunenin 20 μL'sini bir PCR tüpüne aktarın. Boncukların taşınmamasına dikkat edin.
    5. Sanger dizilimi ile DNA amplikonunu saflaştırdı.
    6. Hedef bölgedeki delleri ölçmek için işlenen ve kontrol edilen (işlenmemiş) örnekler için .ab1 dizi dosyalarını Ayrıştırma Yoluyla Kutucukların İzlenmesi (TIDE)16'ya yükleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kaplanabilir primer hepatositlerin karaciğerden izolasyonu
Karaciğer perfüzyonu ve hepatosit izolasyonunun genel süreci Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu deneyde vahşi tip, 8-10 haftalık C57BL6/6J fareler kullanıldı. Prosedürün% 85 ila% 95 arasında bir canlılığa sahip fare başına 20-50 × 106 hücre vermesi beklenmektedir. Canlılık% <70 ise, ölü hücreleri çıkarmak için perkollasyon tedavisi izlenmelidir. Yeni izole edilmiş hepatositler kollajen I kaplı veya azot içeren doku kültürü plakaları üzerine kaplanmalıdır. Kaplamadan sonraki 3-12 saat içinde, hepatositlerin plakaya yapışması beklenir, hücre morfolojisi 24 saat içinde tipik bir çokgen veya altıgen görünüm alır (Şekil 2). Hepatositler, karaciğerde glikozu glikojen formunda depolayan tek hücrelerdir. İzole hücrelerin saflığını doğrulamak için, glikojen boyama, kaplamadan sonra 24 saatte Periyodik asit-Schiff reaktifi kullanılarak gerçekleştirilir. Lekeli hepatositlerin sitoplazması macenta görünür (Şekil 3).

CRISPR-Cas9 RNP'lerin ve mRNA'nın izole fare hepatositlerine elektroporasyonu
Yeni izole edilmiş fare hepatositleri, eGFP mRNA, Cas9 mRNA ile birlikte Hpd hedefli sgRNA veya Hpd-sgRNA (RNP) ile komplekslenmiş Cas9 proteini ile elektroporate edildi. Hpd-sgRNA, 5' ve 3' uçları14'teki ilk ve son üç ardışık nükleotitlere 2'-O-metil fosforothioat bağlantıları ile kimyasal olarak modifiye edildi. Streptococcus pyogenes Deneyler için Cas9 kullanıldı. Hepatositler elektroporasyondan 24 saat sonra floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi ve GFP-pozitif hücrelerin yüzdesi görüntülerde sayıldı (Şekil 4A). Ortalama olarak, hepatositlerin %89.8'i [dağılım %87.1-%92.4] GFP pozitifti. Elektroporasyondan 3 gün sonra, Hpd lokusundaki Cas9 kaynaklı yerleştirmeler ve delesyonlar (indels) TIDE16 kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar, CRISPR-Cas9 mRNA ile elektropoze edilmiş hepatositlerde% 47.4 ve Cas9 RNP için% 78.4'lük hedef indelleri göstermektedir (Şekil 4B). MTT ve albümin testleri, CRISPR-Cas9'un elektroporasyonundan sonra hepatosit canlılığını ve işlevselliğini değerlendirmek için yapıldı. MTT sonuçları, CRISPR-Cas9 mRNA ve RNP ile tedavi edilen hepatositlerde sırasıyla% 35.4 ve% 45.9'luk bir canlılık göstermektedir (Şekil 4C). MTT sonuçları ile tutarlı olarak, normalize albümin seviyeleri Cas9 mRNA ile tedavi edilen hepatositlerde% 31.8 ve Cas9 RNP için% 34.5 idi (Şekil 4D).

Figure 1
Şekil 1: Hepatosit perfüzyon ve izolasyon protokolünün şeması. İnferior vena kavanın kanülasyonundan sonra, portal ven kesilir ve Perfüzyon Çözeltileri 1, 2 ve 3 karaciğerden pompalanır. Karaciğer kapsülü yırtılır ve hücreler bir hücre kaldırıcı kullanılarak serbest bırakılır. Serbest bırakılan hücreler gerilir ve santrifüj edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Yeni izole edilmiş primer hepatositler. C57BL/6J farelerden izole edilen hepatositler, Hepatosit Kaplama Ortamı ile kollajen I kaplı 6 delikli plakalar üzerine kaplandı. Kaplamadan sonra 24 saat sonra çekilen görüntüler. Ölçek çubuğu = 400 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Glikojen boyama. Yeni izole edilmiş primer fare hepatositleri, saflığı doğrulamak için glikojen için boyandı. Boyama, kaplamadan sonra 24 saatte Schiff Reaktifi kullanılarak yapıldı. Lekeli hepatositlerin sitoplazması macenta görünür. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Hpd hedefli CRISPR-Cas9'un yeni izole edilmiş primer fare hepatositlerine elektroporasyonu. (A) Elektroporasyondan sonra 24 saat sonra taze izole edilmiş fare hepatositlerinin faz kontrastı ve yeşil floresan mikroskopi görüntüleri. Üst sıradaki görüntüler eGFP mRNA ile transfekte edilen hepatositler, alt sıradaki görüntüler ise transfekte edilmemiş kontrol hepatositleridir. Ölçek çubukları = 400 μm. (B) SgRNA veya RNP ile birleştirilmiş Cas9 mRNA ile elektropoze edilmiş fare hepatositleri için hedef üstü indels. (C) Elektroporasyondan sonra 24 saatte MTT testinde transfekte edilmemiş kontrol hepatositlerine normalleştirilen canlılık. (D) Şartlandırılmış ortamdaki albümin seviyeleri, iki teknik replika ile elektroporasyondan (n = 3) sonra 24 saatte ölçülen transfekte edilmemiş kontrol hepatositlerine normalleştirilir. İstatistiksel analiz eşlenmemiş t-testleri ile yapıldı. Bu rakam 14'ten değiştirildi. Kısaltmalar: Hpd = 4-hidroksifenilpiruvat dioksijenaz; CRISPR = kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrarlar; Cas9 = CRISPR ile ilişkili protein 9; sgRNA = tek kılavuzlu RNA; RNP = ribonükleoprotein; INDEL = ekleme-silme; MTT = 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difenil tetrazolyum bromür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Karaciğer perfüzyonu ve hepatosit izolasyon protokolü için sorun giderme. Bu tabloda, protokol sırasında karşılaşılan yaygın sorunlar vurgulanmakta ve olası çözümler önerilmektedir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S1: Ameliyat sırasında fare karın boşluğu. Kateter, böbrek dallarından önce inferior vena kavaya (mavi nokta) yerleştirilir (görülmez). Kısaltmalar: L = Karaciğer; K = Böbrek; I = İnce Bağırsaklar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S1: Cas9 kılavuzu ve PCR primer dizileri. Hpd'yi hedefleyen sgRNA için kılavuz sekans ve PAM ve Hpd'nin amplifikasyonu için PCR primer dizileri. Kısaltmalar: Hpd = 4-hidroksifenilpiruvat dioksijenaz; CRISPR = kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrarlar; Cas9 = CRISPR ile ilişkili protein 9; sgRNA = tek kılavuzlu RNA; PAM = protospacer-bitişik motif. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hepatosit izolasyonu protokolünde belirtilen adımlar zordur ve yeterlilik için pratik gerektirir. Karaciğerden başarılı hepatosit izolasyonu için birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, inferior vena kavanın uygun şekilde kanülasyonu tam karaciğer perfüzyonu için gereklidir. Perfüzyon sonrası karaciğerde beyazlatma olmaması kateterin yer değiştirmesini gösterir (Tablo 1). İnferior vena kava (retrograd perfüzyon) portal venden (antegrad perfüzyon) daha basit ve daha erişilebilir olduğu için prodüksiyonda kanüle edildi17,18. Bazı protokoller kateter19'u sabitlemek için dikişler kullanır; ancak dikişler süreci zorlaştırır. Kateterin dikilmesi, kateterin yanlış yerleştirilmesi ve pozisyonunun ayarlanmasını imkansız hale getirmesi gibi istenmeyen sonuçlara neden olabilir. Ek olarak, karaciğerde kanülasyonu iğneyi çıkarmadan gerçekleştirmek mümkündür, bu da karaciğer perfüzyonunu daha da basitleştirebilir. Pompanın kateterle bağlanması damardaki iğne ile gereksizdir. Ek olarak, kateteri yanlışlıkla çıkarma ve kan pıhtıları oluşturma olasılığı azalır. Kateterin sadece ucunun damara göre düz bir açıyla yerleştirilmesi kanülasyonu arttırdı. İnferior vena kavanın birkaç dalı vardır, bu nedenle kateteri yanlış bölgeye sokmak, karaciğerde değil, vücudun başka bir bölümünde perfüzyona neden olacaktır (Tablo 1). Bu nedenle, kateteri dallardan kaçınan bir bölgeye yerleştirmek hayati önem taşır. Vasküler yapı farklı fareler arasında biraz değişecektir; Bu nedenle, kateteri enjekte etmek için en iyi yeri belirlemek için kanülasyondan önce damarları incelemek önemlidir. İğneyi çıkardıktan sonra kateter içindeki kanın geri akması, uygun kanülasyonun mükemmel bir göstergesidir. Uygun kanülasyon, portal vene anlık olarak basınç uygulandığında karaciğer şişmesi aranarak da kontrol edilebilir (adım 1.3.13).

Hepatositleri izole ederken, ikinci kritik adım, tam karaciğer sindiriminin ne zaman gerçekleştiğini tanımaktır. Enzim kalitesi ve konsantrasyonu, uygun sindirim için gereklidir. 20,21'de bulunan protokollerin aksine, bu protokol iki kollajenaz izoformundan oluşan Liberaz'ın kullanılmasını önerir, çünkü enzim aktivitesinde daha iyi tutarlılık sağlar ve normal kollajenaz22'den partiden partiye varyasyonu azaltır. Sindirim enzimi kalitesindeki ve aktivitesindeki değişiklikler, izolasyonda tutarsızlıklara neden olabilir. Sindirim sırasında karaciğeri izlemek ve karaciğer yumuşadıktan hemen sonra sindirimi durdurmak önemlidir. Sindirilmiş bir karaciğer esnek olacak ve doku geri sıçramadan girintilerin oluştuğunu doğrulamak için forseps veya pamuklu çubuklar kullanarak karaciğeri bastırarak doğrulanan elastikiyette bir kayıp gösterecektir. Bu protokolde, karaciğer başına önerilen maksimum Liberaz çözeltisi miktarı 50 mL'dir; daha yüksek bir hacim aşırı sindirime neden olur. Kanülasyon mükemmel bir şekilde gerçekleştirilirse, uygun sindirimi sağlamak için 30 mL Liberaz çözeltisi yeterlidir. İşlemin son kritik adımları izolasyon ve yıkama adımlarıdır. Karaciğeri diseke ettikten ve FBS ile buz gibi soğuk DMEM içeren steril bir Petri kabına aktardıktan sonra, karaciğeri parçalara ayırmaktan kaçınmak çok önemlidir. Bu aşamada, hücreleri nazikçe serbest bırakmak ve hücre canlılığını en üst düzeye çıkarmak için bir hücre kaldırıcı kullanın. Karaciğeri DMEM'e batırmak için çanağı eğmek, hücrelerin kapsülden süspansiyona salınmasını kolaylaştırır ve yavaşça ve buz üzerinde yapılmalıdır. Serbest bırakma adımı sırasında Glisson'un kapsülünü bozmak kolay olmalı ve ortam bulutlu ve kahverengi hale gelmelidir. Kapsülü bozarken zorluk, zayıf sindirimin bir göstergesidir (Tablo 1).

Bu protokol, yeni izole edilmiş fare hepatositlerinde yüksek düzeyde CRISPR-Cas9 düzenlemeleri oluşturmak için uygundur. Çalışmada Cas9 RNP ve mRNA tarafından üretilen indeller karşılaştırıldı. Cas9 RNP ile elektropoze edilmiş hepatositlerde, mRNA'dan daha yüksek gen düzenleme seviyeleri gözlenmiştir, bu da diğer çalışmalardan elde edilen bulgularla tutarlıdır14,23,24. Cas9 RNP'nin mRNA üzerindeki avantajı, Cas9 proteini hücrede mRNA23,24'ten daha kısa süreler için bulunduğundan, daha düşük hedef dışı düzenleme sağlamasıdır. SgRNA'ların verimliliği tasarıma ve hedef bölgeye göre değiştiğinden, çoklu sgRNA'lar ilgili gende düzenleme verimliliği için tasarlanmalı ve test edilmelidir. Yüksek gen verimliliğine sahip sgRNA arasında seçim yaparken daha yüksek özgüllük puanlama tasarımını seçin. Gen düzenleme sürekli olarak düşükse, teslimatı onaylamak için eGFP mRNA gibi bir muhabiri birlikte teslim etmeyi düşünün. Elektroporasyondan sonra düşük eGFP-pozitif hücre seviyeleri, süresi dolmuş elektroporasyon tamponunu, elektroporasyon cihazı sorunları veya reaksiyondaki hava kabarcıklarını gösterebilir. Çok sayıda eGFP-pozitif hücre varsa, ancak düşük düzenleme verimliliği varsa, düzenleme aktivitesini doğrulamak ve hücrelere elektroporated Cas9 ve sgRNA miktarlarını ayarlamak için sgRNA tasarımını bir hücre hattında test edin. Son olarak, düzenleme etkinliğini değerlendirmek için kullanılan yöntemi göz önünde bulundurun. T7 Endonükleaz I gibi jel bazlı tahliller, kesim bölgesinde 1 bp uyumsuzluk için düşük duyarlılık nedeniyle gen düzenlemesini yetersiz rapor edebilir. Derin dizileme, Cas9 gen düzenlemesini ölçmek için, özellikle hedef dışı bölgelerdeki düşük düzenleme olayları için en doğru yöntemdir.

Protokolün bir diğer zorlu yönü, elektroporasyondan sonra taze izole edilmiş hepatositlerin kültürlenmesidir. Kullanıcılar, elektroporasyondan sonra canlı, plakalanabilir hepatositler elde etmek için protokolün her adımında hücreleri nazikçe kullanmalıdır. Hepatositleri vorteks ile dağıtmaktan kaçının; Bunun yerine, şişe içeren hücreleri, hücreler yeniden askıya alınana kadar yavaşça sallayın. Hepatositleri aktarırken, canlılığı korumak için geniş delikli pipet uçları kullanın. Elektroporasyondan sonra küvetlerin buz üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edilmesi, hücre zarının yeniden yapışmasını ve canlılığını arttırmasını sağlar. Kaplamadan sonra, plakayı inkübatöre yerleştirin ve hepatositlerin eşit olarak dağılmasını ve hücre canlılığını korumasını sağlamak için plakayı kuzeyden güneye ve doğudan batıya doğru yatay ve dikey olarak yavaşça hareket ettirin. Hepatositler plakaya yapışamazsa, elektroporasyon reaksiyonunda hücre sayısını 1.3 × 106'ya çıkarmayı düşünün.

Protokol için umut verici bir uygulama, karaciğerin insan IMD'lerinin fare modellerinin üretilmesidir. Fumarilasetoasetat hidrolaz (Fah) için kodlayan gen için pozitif olan fare hepatositlerinin, Fah eksikliği olan (Fah-/-) farelerde transplantasyondan sonra karaciğeri verimli bir şekilde engraft ettiği ve yeniden doldurduğu gösterilmiştir25. Karaciğerin IMD'lerinin fare modellerini geliştirmek için yeni bir yaklaşım, bir hastalıkla ilişkili düzenlemeleri tanıtmak için CRISPR-Cas9'u vahşi tip fare hepatositlerine elektroporize etmek, ardından Fah-/- farelerde gen düzenlenmiş hepatositlerin transplantasyonudur. Cas9 tarafından düzenlenen hepatositler, karaciğeri yeniden doldurmak için doğal Fah eksikliği olan hücrelere kıyasla transplantasyondan sonra doğal bir seçici avantaja sahip olacaktır.

Sonuç olarak, bu protokol kullanıcıları primer hepatositleri fare karaciğerinden izole etme kapasitesiyle donatıyor ve bunu CRISPR-Cas9 mRNA ve RNP'leri kullanarak gen düzenleme izliyor. Protokol, karaciğeri in vitro ve in vivo olarak etkileyen çeşitli genetik hastalık türlerini incelemek ve terapötik yaklaşımları test etmek için farklı fare suşlarında kullanılmak üzere modifiye edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmek için rakip çıkarları yoktur.

Acknowledgments

RNC, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS), Amerikan Karaciğer Hastalıkları Çalışmaları Derneği Vakfı ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği tarafından desteklenen Güney Carolina Biyomühendislik Rejenerasyon ve Doku Oluşumu Merkezi Pilot hibesinden P30 GM131959, 2021000920 hibe numaraları altında fon aldı. ve sırasıyla 2022000099. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği veya Amerikan Karaciğer Hastalıkları Çalışmaları Vakfı'nın resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Şekil 1'in şeması BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural USA Scientific 1402-4700
6-well Collagen Plates Advanced Biomatrix 5073
accuSpin Micro 17R Fisher Scientific 13-100-675
All-in-one Fluorescent Microscope Keyence BZ-X810
Analog Vortex Mixer VWR 97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL ThermoFisher Scientific 2079GPK
Automated Cell Counter Bio-Rad Laboratories TC20
Blue Wax Dissection Tray Braintree Scientific Inc. DTW1 9" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifter Argos Technologies UX-04396-53 Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL) Fisher Scientific 339650
Conical tubes (50 mL) Fisher Scientific 14-432-22
Cotton applicators Fisher Scientific 22-363-170
Curved scissors Cooper Surgical 62131
Disposable Petri Dishes Falcon 351029 100mm,sterile
Disposable Petri Dishes VWR 25373-100 35mm, sterile
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Instruments 250082
Falcon Cell strainer (70 µm) Fisher Scientific 08-771-2
Forceps Cooper Surgical 61864 Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters  BD 382612 24 G x 0.75 in
IV infusion set Baxter 2C6401
MyFuge 12 Mini Centrifuge Benchmark Scientific 1220P38
Needles Fisher Scientific 05-561-20 25 G
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001 Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic Pump Masterflex  HV-77120-42 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubing Masterflex HV-96410-14 25 ft, silicone
Primaria Culture Plates Corning Life Sciences 353846 Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL) Fisher Scientific 12-567-604
Syringes BD 329464 1 mL, sterile
T100 Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories 1861096
Water bath ALT 27577 Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 IDT 1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL Fisher Scientific NC9959336
CleanCap Cas9 mRNA Trilink Biotechnologies L-7606-100
CleanCap EGFP mRNA Trilink Biotechnologies L-7201-100
Corning Matrigel Matrix Corning Life Sciences 356234
DMEM ThermoFisher Scientific 11885076 Low glucose, pyruvate
Ethanol 70% VWR 71001-652
Fetal bovine serum Thermoscientific 26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM) Lonza MM250
Hepatocyte Plating Medium (PM) Lonza MP100
Mouse Albumin ELISA Kit Fisher Scientific NC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit Lonza VPL-1004
OneTaq HotStart DNA Polymerase New England Biolabs M0481L
PBS 10x pH 7.4  Thermoscientific 70011-044 No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution) Santa Cruz Biotechnology sc-500790A
Periodic acid Sigma-Aldrich P7875-25G
Permount Mounting Medium VWR 100496-550
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen Corporation QE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagent Sigma-Aldrich S5133
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher Scientific 25200056 Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability Assay ThermoFisher Scientific V13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)  Stable at 4 °C for 2 months
EBSS Fisher Scientific 14155063 Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M) Bioworld 40520008-1 200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M) ThermoFisher Scientific AAJ16924AE 2 mL 
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)  Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM) Sigma C7902-500G 360 µL of 1 M stock 
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) Fisher Scientific 14-155-063 Complete to 200 mL
HEPES (1 M) ThermoFisher Scientific AAJ16924AE 2 mL 
MgSO4·7H20 (0.8 mM) Sigma 30391-25G 160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3  Prepared fresh prior to use
Solution 2 50 mL
Liberase Roche 5401127001 0.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail 
Acepromzine 0.25 mg/mL final concentration
Ketamine 7.5 mg/mL final concentration
Xylazine 1.5 mg/mL final concentration
Software URL
Benchling https://www.benchling.com/
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decomposition https://tide.nki.nl/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
  2. Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
  3. Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
  4. Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
  5. OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver. , Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019).
  6. Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
  7. Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
  8. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  9. Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).
  10. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  11. Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
  13. Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
  14. Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
  15. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2022).
  16. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  17. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  18. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
  19. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  20. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
  21. Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
  22. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  23. Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
  24. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  25. Grompe, M. Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. Tanguay, R. M. , Springer International Publishing. 215-230 (2017).

Tags

Biyomühendislik Sayı 184
Cas9 Ribonükleoproteinlerin ve mRNA'nın Yeni İzole Edilmiş Primer Fare Hepatositlerine Elektroporasyon Aracılı Verilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rathbone, T., Ates, I., Stuart, C.,… More

Rathbone, T., Ates, I., Stuart, C., Parker, T., Cottle, R. N. Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes. J. Vis. Exp. (184), e63828, doi:10.3791/63828 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter