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方法文章

从小鼠面部突起和培养的腭中胚层细胞中分离全细胞蛋白裂解物用于磷酸化蛋白分析

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DOI：

10.3791/63834

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2022年4月1日

 ,  , 
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种从分离的小鼠胚胎面部突起或培养的小鼠胚胎腭部间充质细胞中提取全细胞蛋白裂解液，并通过后续的蛋白质印迹（Western blotting）检测磷酸化蛋白水平的方法。

摘要

哺乳动物颅面发育是一个复杂的形态发生过程，在此过程中多个细胞群体协同作用，形成额鼻部骨骼。这些形态学变化的启动和维持依赖于多种信号相互作用，其中常涉及激酶介导的蛋白质磷酸化。本文提供了两个可用于研究哺乳动物颅面发育过程中蛋白质磷酸化的生理相关情境：小鼠面部突起（特别是胚胎11.5天的上颌突）以及来源于胚胎13.5天次级腭板的小鼠胚胎腭间充质细胞培养体系。为克服蛋白质分离过程中常见的去磷酸化障碍，本文讨论了对标准实验室方法进行的适应性改进，以实现磷酸化蛋白的有效分离。此外，还提供了在对全细胞蛋白裂解液进行Western印迹后，正确分析和定量磷酸化蛋白的最佳实践方案。这些技术尤其可与药理学抑制剂和/或小鼠遗传模型相结合，用于深入理解颅面发育过程中多种磷酸化蛋白的动态变化及其功能作用。

引言

哺乳动物颅面发育是一个复杂的形态发生过程，在此过程中，多种细胞群体协同作用，形成额鼻部骨骼。在小鼠中，该过程始于胚胎第9.5天（E9.5），此时形成额鼻突以及成对的上颌突和下颌突，每个突起均含有迁移后的颅神经嵴细胞。随着鼻凹的出现，额鼻突分化出内侧和外侧鼻突，二者最终融合形成鼻孔。此外，内侧鼻突与上颌突融合形成上唇。与此同时，腭的发生始于胚胎第11.5天（E11.5），此时上颌突的口腔侧产生明显的突起——次级腭板。随着时间推移，腭板在舌体两侧向下生长，随后抬升至舌体上方相对位置，并最终在中线处融合，至胚胎第16.5天（E16.5）形成连续的腭，将鼻腔与口腔分隔开来1。

颅面发育过程中的这些形态学变化由多种信号相互作用启动并维持，其中常涉及激酶介导的蛋白质磷酸化。例如，细胞膜受体如转化生长因子（TGF）-β受体的亚家族，包括骨形态发生蛋白受体（BMPRs），以及多种受体酪氨酸激酶（RTK）家族，在配体结合并激活颅神经嵴细胞后会发生自磷酸化2,3,4。此外，G蛋白偶联跨膜受体Smoothened在Sonic hedgehog（SHH）配体与Patched1受体结合后的下游通路中，于颅神经嵴细胞和颅面外胚层中发生磷酸化，导致Smoothened在纤毛膜上积累，从而激活SHH信号通路5。此类配体-受体相互作用在颅面发育背景下可通过自分泌、旁分泌和/或邻分泌方式进行。例如，BMP6在软骨细胞分化过程中以自分泌方式传递信号6，而成纤维细胞生长因子（FGF）8在咽弓外胚层中表达，并以旁分泌方式与咽弓间充质中表达的FGF家族RTK成员结合，启动咽弓的模式形成和向外生长7,8,9,10。此外，在颅面骨骼发育过程中，当跨膜Delta和/或Jagged配体与邻近细胞上的跨膜Notch受体结合后，Notch受体被切割并磷酸化，从而在软骨细胞和成骨细胞中通过邻分泌方式激活Notch信号通路11。然而，还有其他对颅面发育重要的配体-受体对，能够灵活地在自分泌和旁分泌信号传导中发挥作用。例如，在小鼠牙齿形态发生过程中，血小板源性生长因子（PDGF）-AA配体已被证明在釉质器官上皮中以自分泌方式激活RTK PDGFRα12。相反，在小鼠中期妊娠的面部突起中，编码PDGF-AA和PDGF-CC配体的转录本在颅面外胚层中表达，而PDGFRα受体则在下方源自颅神经嵴的间充质中表达，从而实现旁分泌信号传导13,14,15,16,17。无论采用何种信号机制，这些受体磷酸化事件通常会招募衔接蛋白和/或信号分子，后者自身也常被磷酸化，从而启动细胞内激酶级联反应，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路18,19。

这些级联反应的终末细胞内效应分子可磷酸化多种底物，例如转录因子、RNA结合蛋白、细胞骨架蛋白以及细胞外基质蛋白。Runx220、Hand121、Dlx3/522,23,24、Gli1-325 和 Sox926 是在颅面发育过程中被磷酸化的转录因子之一。这种翻译后修饰（PTM）可直接影响对其他翻译后修饰的敏感性、二聚化、稳定性、切割以及DNA结合亲和力等多种功能20,21,25,26。此外，RNA结合蛋白Srsf3在颅面发育过程中也被磷酸化，从而促使其向细胞核内转位27。总体而言，RNA结合蛋白的磷酸化已被证实可影响其亚细胞定位、蛋白质-蛋白质相互作用、RNA结合能力以及序列特异性28。此外，肌动球蛋白的磷酸化可在整个颅面发育过程中引起细胞骨架的重排29,30，而细胞外基质蛋白（如小整合素结合配体N连接糖蛋白）的磷酸化则在骨骼发育过程中的生物矿化中发挥重要作用31。通过上述及其他众多实例可见，蛋白质磷酸化在颅面发育过程中具有广泛而深远的影响。此外，蛋白磷酸酶通过去除磷酸基团来拮抗激酶的作用，从而为磷酸化过程增添了另一层调控机制。

受体和效应分子水平上的这些磷酸化事件对于信号通路的传递至关重要，最终导致细胞核内基因表达的改变，驱动特定的细胞活动，如迁移、增殖、存活和分化，从而促进哺乳动物面部的正常形成。鉴于蛋白质与激酶和磷酸酶之间的相互作用具有特定的生物学背景，由此产生的翻译后修饰（PTMs）变化及其对细胞活动的影响，必须在生理相关条件下研究这些参数，才能全面理解磷酸化事件在颅面发育中的作用。本文提供了两个可用于研究哺乳动物颅面发育过程中蛋白质磷酸化及信号通路激活状态的实验体系：小鼠面部突起（特别是E11.5时期的上颌突起）以及来源于E13.5期次级腭突的培养小鼠胚胎腭间充质细胞——包括原代32和永生化细胞系33。在E11.5时期，上颌突起正与外侧和内侧鼻突起融合1，代表了小鼠颅面发育过程中的一个关键时间点。此外，选择上颌突起及来源于腭突的细胞，是因为后者结构起源于前者，从而为研究人员提供了在相关联的体内（in vivo）和体外（in vitro）环境中探究蛋白质磷酸化的机会。然而，本实验方案也可适用于其他面部突起及不同的发育时间点。

研究磷酸化蛋白的一个关键问题是，在蛋白质分离过程中，环境中的大量磷酸酶容易导致磷酸化蛋白发生去磷酸化。为克服这一障碍，本文讨论了对标准实验室方法进行的调整与改进，以实现磷酸化蛋白的有效分离。此外，还提供了磷酸化蛋白正确分析与定量的最佳实践方案。这些技术尤其可与药理学抑制剂和/或小鼠遗传模型相结合，用于更深入地理解颅面部发育过程中各种信号通路的动态变化及其作用。

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方案

所有涉及动物的操作均经科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并按照机构指南和法规执行。实验使用1.5至6月龄的雌性129S4小鼠，饲养于低于热中性温度的21–23 °C环境中，用于胚胎采集。本方案的流程示意图见图1。有关本方案中使用的所有材料、设备、软件、试剂和动物的详细信息，请参见材料表。

1. 收集 E11.5 小鼠胚胎

  1. 在定时交配后检测到阴道栓的第11.5天，处死怀孕雌性小鼠2 使用经IACUC批准的CO₂气室2 实现约50%置换所需的流速（在360 in时为2.95 L/min）3 腔室）和暴露持续时间（参见 材料表）。以颈椎脱位法作为安乐死的辅助手段，随后立即进行解剖。
  2. 将小鼠身体仰卧位放置于解剖板上。用70%乙醇喷洒小鼠腹部。
  3. 用直头Semken镊子夹起阴道口前方的皮肤并提起，然后用直刃手术剪在两侧以45°角剪开被提起的皮肤及皮下组织，形成一个开口 "V" 延伸至前肢与后肢之间横向侧面约一半位置的形状。
  4. 使用Semken镊子夹住一侧子宫角，用手术剪在输卵管下方和宫颈上方剪断。剪除子宫阔韧带，以完全摘除该侧子宫角。
  5. 将解剖出的子宫角转移至10 mL组织学用磷酸盐缓冲液（PBS）[0.137 M NaCl，2.68 mM KCl，1.76 mM KH₂PO₄，10.14 mM Na₂HPO₄，pH 7.4]中2PO4 一碱基，10.14 mM Na2HPO4 二碱基，pH 7.4] 置于 10 cm 培养皿中。
  6. 使用与步骤1.4-1.5中所述相同的方法，移除腹腔对侧的第二个子宫角。
  7. 如果暂时不立即进行单个胚胎的解剖（例如，还需解剖第二只雌鼠），请将含有双侧子宫角的10 cm培养皿置于冰上。
  8. 在解剖体视显微镜下，使用Dumont #5精细镊子小心地从子宫角中分离出每个胚胎。缓慢剥离肌层、蜕膜和绒毛膜。撕开并移除包围胚胎的相对透明的羊膜，切断连接胚胎与胎盘的脐带。
  9. 将每只解剖好的胚胎用剪口的塑料移液管或胚胎勺转移至预冷的12孔细胞培养板的各个孔中，每孔含2.5 mL组织学级PBS，并置于冰上。
    ​注意：若处理的同窝胚胎可能包含多种基因型，应将每个胚胎周围的羊膜保留，用于基因分型；操作时将每个羊膜单独放入预先标记的0.5 mL离心管中，并置于冰上。

2. 从小鼠E11.5胚胎中分离上颌突

  1. 准备三个含有10 mL组织学PBS的10 cm培养皿，并将其置于冰上，以便在不同胚胎之间轮换使用。
  2. 使用剪切过的塑料移液管或胚胎勺，将12孔细胞培养板中单个孔内的一个胚胎转移至其中一个盛有组织学PBS并置于冰上的10 cm培养皿中。
  3. 在解剖显微镜下，用精细镊子将每个上颌突从面部分离。首先，沿外侧鼻突与上颌突之间的自然凹陷处，切开一侧上颌突的前缘（图2A）。
  4. 其次，沿上颌突与下颌突之间的自然凹陷处，切开该上颌突的后缘（图2A）。
  5. 第三，为完全分离上颌突，在上颌突的眼侧进行垂直切口，从其前缘延伸至后缘，切口位置即上述自然凹陷终止处（图2A-C）。
  6. 对颜面另一侧的上颌突重复上述三个切口操作。
  7. 使用带有2 mL小型乳胶吸头的9"巴斯德吸管，将分离得到的一对上颌突及约30 µL组织学PBS的小液滴转移至冰上标记好的35 mm培养皿中（图2D）。
  8. 对每个胚胎重复步骤2.3–2.7，轮换使用冰上放置的三个含组织学PBS的10 cm培养皿。将每对分离的上颌突分别置于不同的35 mm培养皿中并保持在冰上。
    注意：上颌突外胚层与间充质的分离（步骤2.9–2.17）可在完成同窝所有胚胎的上颌突解剖后进行。若需要保留包含外胚层和间充质的完整上颌突，请继续执行下方步骤2.18。
  9. 配制250 µL新鲜的2%胰蛋白酶（溶于组织培养PBS）和250 µL 10%胎牛血清（FBS，溶于组织培养PBS），并置于冰上保存。
  10. 在35 mm培养皿中另加一个约30 µL的2%胰蛋白酶小液滴，与含有上颌突的组织学PBS小液滴分开。使用巴斯德吸管将一对上颌突转移至2%胰蛋白酶小液滴中（图2D）。
  11. 将培养皿置于冰上孵育15分钟。
  12. 将35 mm培养皿从冰上取出，置于解剖显微镜下。
  13. 使用精细镊子缓慢而小心地将每个上颌突的外胚层逐层剥离（图2E）。
    注意：若外胚层未能以完整片状与间充质分离，可在室温（RT）下继续用2%胰蛋白酶孵育最多5分钟后再尝试分离。若组织在2%胰蛋白酶中开始解体，请立即将上颌突转移至下述10% FBS中以中和胰蛋白酶，并完成外胚层与间充质的分离。
  14. 当上颌突的外胚层与间充质成功分离后（图2F），使用巴斯德吸管将所需组织从一对上颌突转移至第三个约30 µL的10% FBS小液滴中，该液滴需与前两个液滴分开（图2D）。
  15. 将35 mm培养皿放回冰上，以终止胰蛋白酶消化作用。
  16. 将上颌突组织在冰上的10% FBS中孵育1–2分钟，然后使用巴斯德吸管将其从两个上颌突转移至第四个约30 µL的预冷组织学PBS小液滴中（置于冰上，且与前三个液滴分开）（图2D）。
  17. 在组织学PBS中孵育上颌突组织1分钟，同时用巴斯德吸管尖轻轻搅动PBS，使液体在组织周围旋转，确保彻底洗去残留的FBS。
  18. 使用巴斯德吸管将一对上颌突组织转移至冰上的标记1.5 mL微量离心管中，尽量减少组织学PBS的转移。用巴斯德吸管吸除1.5 mL微量离心管中的多余组织学PBS。
  19. 按照上述步骤，解剖同窝中每个胚胎的上颌突。
  20. 立即处理样品以提取全细胞蛋白裂解液（见下文），或长期储存于-80 °C。长期储存前，先将1.5 mL微量离心管置于干冰与100% EtOH混合液中快速冷冻5分钟。

3. 从小鼠上颌突中分离全细胞蛋白裂解物

  1. 如果上颌突先前在 -80 °C 下冷冻，请将其在冰上解冻。
  2. 加入 0.1 mL 冰冷的 NP-40 裂解缓冲液（20 mM Tris HCl pH 8，150 mM NaCl，10% 甘油，1% Nonidet P-40，2 mM EDTA；4 °C 保存），并在使用前立即于冰上加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（1× 完整微型蛋白酶抑制剂混合物 [溶于水中；-20 °C 保存]、1 mM PMSF [溶于异丙醇中；4 °C 保存]、10 mM NaF [-20 °C 保存；避免冻融]、1 mM Na3VO4 [-20 °C 保存]、25 mM β-甘油磷酸钠 [4 °C 保存]）。
    注意：也可选择进行细胞组分分离，以提取胞质、核、膜或线粒体蛋白组分。
  3. 用 200 µL 移液器上下吹打 10 次。
  4. 涡旋振荡 10 秒，然后用 200 µL 移液器上下吹打 10 次。避免产生气泡。
  5. 在 4 °C 下孵育 2 小时，同时使用 1.5 mL/2 mL 摇摆桨在试管旋转仪上进行头尾翻转旋转。
  6. 在 4 °C 下以 13,500 × g 离心 20 分钟。
  7. 用 200 µL 移液器将上清液转移至新的 1.5 mL 冰上预冷的微量离心管中。
  8. 使用蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度，实验样品取 10 μL 蛋白裂解液 + 10 μL NP-40 裂解缓冲液，标准品使用牛血清白蛋白（V 组分）（BSA）在 NP-40 裂解缓冲液中进行 3–5 个稀释梯度，浓度范围为 0.25–2.0 mg/mL。
  9. 继续进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（步骤 5），或将剩余裂解液迅速在干冰上冷冻后于 -80 °C 长期保存。

4. 从原代和/或永生化的小鼠胚胎腭间充质（MEPM）细胞中分离全细胞蛋白裂解物

注意：从小鼠 E13.5 胚胎中分离和培养原代 MEPM 细胞以及永生化 MEPM 细胞的方法已有先前报道32,33,34。可在细胞裂解前对细胞进行生长因子刺激（步骤 4.1–4.7）。如需未刺激的细胞，请继续执行下方步骤 4.8。

  1. 使用连接真空系统的 5.75" 巴斯德吸管，从 6 cm 细胞培养皿中约 70% 汇合度的 MEPM 细胞中吸除生长培养基 [含 50 U/mL 青霉素、50 µg/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）]。
  2. 用 1 mL 组织培养级 PBS 洗涤细胞。
  3. 加入 3 mL 预热至 37 °C 水浴中的无血清饥饿培养基 [含 50 U/mL 青霉素、50 µg/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、0.1% FBS 的 DMEM]。
  4. 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 23 小时。
  5. 用 3 mL 新鲜的、预热的无血清饥饿培养基替换原有培养基。
  6. 在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育 1 小时。
  7. 根据经验确定的浓度和所需时间，用选定的生长因子刺激细胞。
  8. 使用连接真空系统的 5.75" 巴斯德吸管，从汇合度为 80%–100% 的 MEPM 细胞中吸除培养基。
  9. 用预冷的组织培养级 PBS（6 cm 培养皿使用 1 mL）洗涤细胞两次；最后一次洗涤时将培养皿倾斜，确保完全吸除所有 PBS。
  10. 在冰上加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（使用前立即添加）的预冷 NP-40 裂解缓冲液（6 cm 培养皿使用 0.1 mL），裂解细胞。
  11. 将培养皿置于冰上孵育 5 分钟，每隔约 1 分钟轻轻旋转一次，确保裂解液均匀覆盖整个培养皿表面。
  12. 用预冷的细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下，并将细胞悬液转移至预冷的 1.5 mL 微量离心管中（置于冰上）。
  13. 将细胞悬液在 4 °C 条件下，使用 1.5 mL/2 mL 摇摆桨在管式旋转仪上翻转震荡孵育 30 分钟。
  14. 继续进行上述步骤 3.6–3.9。

5. 小鼠面部突起和/或MEPM细胞全细胞蛋白裂解液中磷酸化蛋白的Western印迹分析

  1. 为 SDS-PAGE 制备全细胞蛋白裂解液样品。
    1. 根据组织/细胞中蛋白的丰度确定上样蛋白量；对于全细胞蛋白裂解液中高表达的蛋白，通常 12.5 μg 已足够。
    2. 加入等体积的 2x Laemmli 缓冲液 [20% 甘油，4% SDS，0.004% 溴酚蓝，0.125 M Tris HCl pH 6.8]，并在使用前立即加入 10% β-巯基乙醇。
      警告：β-巯基乙醇具有皮肤和眼睛腐蚀性，有毒，吞咽后有害，并对水生生物有毒。操作时应佩戴手套、实验服、面罩和护目镜，并在通风橱中进行。废弃物应按照环境健康与安全指南处理。
    3. 通过涡旋混合。
    4. 在迷你干浴器中于 100 °C 加热样品 5 分钟。
    5. 再次涡旋混合，然后将样品置于冰上。
    6. 在 4 °C 下以 9,400 × g 离心 5 分钟。
    7. 上样至 SDS-PAGE 凝胶前短暂置于冰上，或长期储存于 -20 °C。
  2. 使用电泳槽和 4%–15% 预制蛋白凝胶，以电泳缓冲液进行 SDS-PAGE35。
  3. 使用转移缓冲液将蛋白电转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，转移缓冲液中需在使用前立即加入 0%–20% 甲醇（对于大于 100 kDa 的蛋白使用 0%–10% 甲醇；小于 100 kDa 的蛋白使用 20% 甲醇）35。
  4. 封闭膜并检测目标磷酸化蛋白。
    1. 转移完成后，在 Western 印迹盒中用 1x Tris-缓冲盐水（TBS）[20 mM Tris，0.137 M NaCl，pH 7.6] 洗涤膜 5 分钟。
    2. 将膜置于 5 mL 封闭缓冲液 [1x TBS，0.1% Tween 20，5% w/v BSA；充分混匀，并使用 10 mL 带鲁尔接头的注射器通过 25 mm、孔径 0.2 μm 的注射器滤器过滤] 中，在摇床上室温振荡孵育 1 小时。
      注意：在检测磷酸化蛋白时，不要使用脱脂奶粉作为封闭剂，因为其中含有磷酸化蛋白酪蛋白，可能导致非特异性高背景信号。
    3. 在 Western 印迹盒中用 TBS-T [1x TBS，0.1% Tween 20] 振荡洗涤膜三次，每次 5 分钟。
    4. 将膜置于 5 mL 用封闭缓冲液稀释的一抗溶液中，在 4 °C 过夜孵育，使用 50 mL 锥形管和 50 mL 摇床转子装置进行振荡孵育。
      注意：请参考抗体说明书以确定适用于 Western 印迹的合适抗体浓度。
    5. 在 Western 印迹盒中用 TBS-T 室温振荡洗涤膜三次，每次 5 分钟。
    6. 将膜置于 5 mL 用封闭缓冲液稀释的合适辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗溶液中，在摇床上室温振荡孵育 1 小时。
    7. 在 Western 印迹盒中用 TBS-T 振荡洗涤膜三次，每次 5 分钟。
    8. 将膜与增强型化学发光（ECL）Western 印迹底物 [将瓶 1 和瓶 2 中的溶液等体积混合；大尺寸膜（8.6 cm × 6.7 cm）每张使用 0.5 mL] 孵育 1 分钟，确保整个膜持续暴露于 ECL 底物中。
    9. 去除膜上多余的 ECL 底物液体，并立即使用化学发光成像仪进行显影。
  5. 剥离膜并重新检测总目标蛋白。
    1. 将 PVDF 膜放入含 5 mL 剥离缓冲液 [2% SDS，62.5 mM Tris HCl pH 6.8] 的透明聚乙烯内衬袋中，并在使用前立即加入 8 μL/mL β-巯基乙醇。
    2. 在杂交炉中于 50 °C、11 转/分钟的振荡条件下孵育 30 分钟。
    3. 在 Western 印迹盒中用 TBS-T 室温振荡洗涤膜三次，每次 5 分钟。
    4. 继续执行上述第 5.4.2–5.4.9 步骤。
  6. 使用 ImageJ 软件定量 Western 印迹条带密度，将目标磷酸化蛋白水平归一化至相应总蛋白水平36。

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结果

在尝试对从小鼠面部突起和/或培养的腭间充质细胞中分离的蛋白质的磷酸化状态进行表征时，理想情况下，使用抗磷酸化蛋白抗体进行蛋白质印迹（Western blotting）后，应能观察到一条清晰且可重复的条带，其迁移位置与相应总蛋白条带相近或一致（图3）。然而，若蛋白质发生广泛磷酸化，则磷酸化蛋白条带相较于总蛋白条带可能出现轻微上移。此外，若组织中存在多种蛋白异构体，且每种均发生磷酸化，或该蛋白还受到其他可变的翻译后修饰（PTMs），则使用抗磷酸化蛋白抗体进行蛋白质印迹时可能出现多条条带。如果在检测到目标总蛋白的情况下，仍未观察到目标磷酸化蛋白的信号，则可能表明该蛋白在所选实验条件下并未发生磷酸化，或实验流程中出现了技术问题。在后一种情况下，可使用抗磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体和/或抗磷酸酪氨酸抗体对全细胞裂解液进行蛋白质印迹，以验证实验流程是否正常。由于蛋白质磷酸化在颅面组织中广泛存在25,37，因此出现多条磷酸化蛋白条带表明实验流程已成功完成，且初步筛选结果准确可靠。<...

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讨论

本文所述方案使研究人员能够以可靠且可重复的方式探究颅面发育过程中关键的依赖磷酸化的信号事件。该方案中有多个关键步骤，可确保数据的正确收集和结果的准确分析。无论是从小鼠面部突起和/或培养的腭间充质细胞中分离磷酸化蛋白，都必须迅速而高效地操作，并在需要时将所有试剂和材料置于冰上。冰的低温可减缓细胞的代谢活性，从而保护磷酸化蛋白免受磷酸酶活性的影响38，并维持较高的蛋白得率。在上颌突分离过程中使用三个独立的10 cm培养皿，可确保所有解剖操作均在充分预冷的组织学PBS中进行。此外，本蛋白分离方案的另一个关键组分是在所有裂解缓冲液中加入磷酸酶抑制剂。这些试剂同样可保护目标蛋白上的磷酸基团39,40，并维持磷酸化蛋白的完整性，以便后续进行蛋白质印迹分析。

该方案还引入了若干改进，可实现对组织和培养细胞中磷酸化蛋白的更特异性分析。在分离面部突起的过程中，增加了可选步骤，以分离上颌突的外胚层和间充质，从而便于研究特定区室内的蛋白质磷...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

129S4 小鼠由西奈山伊坎医学院的 Philippe Soriano 博士惠赠。本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）/ 国立牙科与颅面研究所（NIDCR）基金 R01 DE027689 和 K02 DE028572（授予 K.A.F.）、F31 DE029976（授予 M.A.R.）以及 F31 DE029364（授予 B.J.C.D.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
迷你干浴器用模块Research Products International Corp400783
配备 Image Lab 软件的 ChemiDoc XRS+ 成像系统Bio-Rad1708265化学发光成像仪
CO2 培养箱，气套式VWR10810-902
解剖板，11 x 13 英寸Fisher Scientific09 002 12
电泳槽，4胶，用于迷你预制胶及迷你转印模块Bio-Rad1658030
杂交炉Fisher ScientificUVP95003001
配备 F45-24-11 转子的 Microcentrifuge 5415 D（Eppendorf）Sigma AldrichZ604062
迷你干浴器Research Products International Corp400780
旋转摇床VWR89032-092
pH 计VWR89231-662
SDS-PAGE 电泳电源Bio-Rad1645050
矩形冰盘，最大 9 LFisher Scientific07-210-093
Stemi 508 体视显微镜，配 K LAB 支架和 LED 环形灯Zeiss4350649020000000解剖显微镜
计时器VWR62344-641
管式旋转混合器Fisher Scientific11 676 341
涡旋混合器Fisher Scientific02 215 414
水浴锅VWR89501-472
Western 印迹槽Fisher ScientificNC9358182
材料
细胞培养皿，6 cmFisher Scientific12-565-95
细胞培养板，12 孔Fisher Scientific07-200-82
细胞刮刀Fisher Scientific08-100-240
CO2AirgasCD USP50
聚丙烯锥形管，50 mLFisher Scientific05-539-13
Dumont #5 精细镊子Fine Science Tools11254-20
胚胎勺Fine Science Tools10370-17
微量离心管，0.5 mLVWR89000-010
微量离心管，1.5 mLVWR20170-038
巴斯德移液管，5.75"Fisher Scientific13-678-6A
巴斯德移液管，9"VWR14672-380
培养皿，10 cmFisher Scientific08-757-100D
培养皿，35 mmFisher ScientificFB0875711YZ
透明聚乙烯衬里袋Fisher Scientific01-812-25B
PVDF 膜Fisher ScientificIPVH00010
Semken 镊子Fine Science Tools11008-13
小型乳胶吸头，2 mLVWR82024-554
手术剪刀Fine Science Tools14002-12
注射器滤器，25 mm，0.2 μm 孔径Fisher Scientific09-740-108
带鲁尔接头的注射器，10 mLVWRBD309604
移液管Fisher Scientific13-711-22
Western 印迹夹具开启杠杆Bio-Rad4560000
Whatmann 3MM chr 层析纸Fisher Scientific05-714-5
试剂
4-15% 预制蛋白凝胶，10 孔，30 µLBio-Rad4561083
β-甘油磷酸二钠盐水合物Sigma AldrichG5422-25G储存液浓度 1 M
β-巯基乙醇Sigma AldrichM3148-100ML
牛血清白蛋白，V 型，经热休克检测Fisher ScientificBP1600-100
溴酚蓝Fisher ScientificAC403140050
Complete mini 蛋白酶抑制剂混合物Sigma Aldrich11836153001储存液浓度 25x
DC 蛋白定量试剂盒 IIBio-Rad500-0112
DMEM，高糖Gibco11965092
E7，小鼠单克隆 β 微管蛋白一抗，浓缩液 0.1 mL发育研究杂交瘤库E71:1,000
ECL Western 印迹底物Fisher ScientificPI32106低皮克级范围
ECL Western 印迹底物Genesee Scientific20-302B低飞克级范围
电泳缓冲液，5 LBio-Rad1610772储存液浓度 10x
乙醇，200 证明，1 加仑Decon Laboratories, Inc.2705HCEtOH
乙二胺四乙酸，二钠盐二水合物（结晶粉末/电泳级）Fisher ScientificBP120-500EDTA
胎牛血清，经鉴定，美国来源，500 mLHyCloneSH30071.03
甘油（经 ACS 认证）Fisher ScientificG33-4
HRP 标记二抗，山羊抗小鼠 IgGJackson ImmunoResearch Laboratories115-035-1461:20,000
HRP 标记二抗，山羊抗兔 IgGJackson ImmunoResearch Laboratories111-035-0031:20,000
盐酸溶液，6N（经认证）Fisher ScientificSA56-500HCl
Igepal Ca-630 非离子型去污剂Fisher ScientificICN19859650Nonidet P-40
异丙醇（HPLC 级）Fisher ScientificA451-1
L-谷氨酰胺Gibco25030081储存液浓度 200 mM
甲醇Fisher ScientificA454-4
p44/42 MAPK（Erk1/2）一抗Cell Signaling Technology9102S1:1,000；抗 Erk1/2
PDGF-BB 重组配体，大鼠Fisher Scientific520BB050
PDGF 受体 β 一抗Cell Signaling Technology3169S1:1,000
青霉素-链霉素Gibco15140122储存液浓度 100 U/mL，100 µg/mL
苯甲基磺酰氟，99%Fisher ScientificAC215740100PMSF；储存液浓度 100 mM
磷酸化 p44/42 MAPK（Erk1/2）一抗Cell Signaling Technology9101S1:1,000，抗磷酸化 Erk1/2
磷酸化 PDGF 受体 α / PDGF 受体 β 一抗Cell Signaling Technology3170S1:1,000
氯化钾（白色晶体）Fisher ScientificBP366-500KCl
磷酸二氢钾（白色晶体）Fisher ScientificBP362-500KH2PO4
SDS 溶液，10%Bio-Rad161-0416
氯化钠（晶体/生物级，经认证）Fisher ScientificS671-3NaCl
氟化钠（粉末/ACS 认证）Fisher ScientificS299-100NaF；分装为一次性使用；储存液浓度 1 M
正钒酸钠，99%Fisher ScientificAC205330500Na3VO4；储存液浓度 100 mM
无水磷酸氢二钠（颗粒或粉末/ACS 认证）Fisher ScientificS374-500Na2HPO4
组织培养用 PBSFisher Scientific21-031-CV
转印缓冲液，5 LBio-Rad1610771储存液浓度 10x
Tris 碱（白色晶体或结晶粉末/分子生物学级）Fisher ScientificBP152-1
胰蛋白酶BioWorld21560033
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Western 印迹分子量标准品Bio-Rad1610374
软件
ImageJ 软件National Institutes of Health
动物
雌性 129S4 小鼠由 Mount Sinai 伊坎医学院 Philippe Soriano 博士惠赠

参考文献

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从小鼠面部突起和培养的腭中胚层细胞中分离全细胞蛋白裂解物用于磷酸化蛋白分析
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