本方案介绍了一种从分离的小鼠胚胎面部突起或培养的小鼠胚胎腭部间充质细胞中提取全细胞蛋白裂解液，并通过后续的蛋白质印迹（Western blotting）检测磷酸化蛋白水平的方法。
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方法文章
从小鼠面部突起和培养的腭中胚层细胞中分离全细胞蛋白裂解物用于磷酸化蛋白分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
哺乳动物颅面发育是一个复杂的形态发生过程，在此过程中多个细胞群体协同作用，形成额鼻部骨骼。这些形态学变化的启动和维持依赖于多种信号相互作用，其中常涉及激酶介导的蛋白质磷酸化。本文提供了两个可用于研究哺乳动物颅面发育过程中蛋白质磷酸化的生理相关情境：小鼠面部突起（特别是胚胎11.5天的上颌突）以及来源于胚胎13.5天次级腭板的小鼠胚胎腭间充质细胞培养体系。为克服蛋白质分离过程中常见的去磷酸化障碍，本文讨论了对标准实验室方法进行的适应性改进，以实现磷酸化蛋白的有效分离。此外，还提供了在对全细胞蛋白裂解液进行Western印迹后，正确分析和定量磷酸化蛋白的最佳实践方案。这些技术尤其可与药理学抑制剂和/或小鼠遗传模型相结合，用于深入理解颅面发育过程中多种磷酸化蛋白的动态变化及其功能作用。
引言
哺乳动物颅面发育是一个复杂的形态发生过程，在此过程中，多种细胞群体协同作用，形成额鼻部骨骼。在小鼠中，该过程始于胚胎第9.5天（E9.5），此时形成额鼻突以及成对的上颌突和下颌突，每个突起均含有迁移后的颅神经嵴细胞。随着鼻凹的出现，额鼻突分化出内侧和外侧鼻突，二者最终融合形成鼻孔。此外，内侧鼻突与上颌突融合形成上唇。与此同时，腭的发生始于胚胎第11.5天（E11.5），此时上颌突的口腔侧产生明显的突起——次级腭板。随着时间推移，腭板在舌体两侧向下生长，随后抬升至舌体上方相对位置，并最终在中线处融合，至胚胎第16.5天（E16.5）形成连续的腭，将鼻腔与口腔分隔开来1。
颅面发育过程中的这些形态学变化由多种信号相互作用启动并维持，其中常涉及激酶介导的蛋白质磷酸化。例如，细胞膜受体如转化生长因子（TGF）-β受体的亚家族，包括骨形态发生蛋白受体（BMPRs），以及多种受体酪氨酸激酶（RTK）家族，在配体结合并激活颅神经嵴细胞后会发生自磷酸化2,3,4。此外，G蛋白偶联跨膜受体Smoothened在Sonic hedgehog（SHH）配体与Patched1受体结合后的下游通路中，于颅神经嵴细胞和颅面外胚层中发生磷酸化，导致Smoothened在纤毛....
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方案
所有涉及动物的操作均经科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并按照机构指南和法规执行。实验使用1.5至6月龄的雌性129S4小鼠，饲养于低于热中性温度的21–23 °C环境中，用于胚胎采集。本方案的流程示意图见图1。有关本方案中使用的所有材料、设备、软件、试剂和动物的详细信息，请参见材料表。
1. 收集 E11.5 小鼠胚胎
- 在定时交配后检测到阴道栓的第11.5天，处死怀孕雌性小鼠2 使用经IACUC批准的CO₂气室2 实现约50%置换所需的流速（在360 in时为2.95 L/min）3 腔室）和暴露持续时间（参见 材料表）。以颈椎脱位法作为安乐死的辅助手段，随后立即进行解剖。
- 将小鼠身体仰卧位放置于解剖板上。用70%乙醇喷洒小鼠腹部。
- 用直头Semken镊子夹起阴道口前方的皮肤并提起，然后用直刃手术剪在两侧以45°角剪开被提起的皮肤及皮下组织，形成一个开口 "V" 延伸至前肢与后肢之间横向侧面约一半位置的形状。
- 使用Semken镊子夹住一侧子宫角，用手术剪在输卵管下方和宫颈上方剪断。剪除子宫阔....
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结果
在尝试对从小鼠面部突起和/或培养的腭间充质细胞中分离的蛋白质的磷酸化状态进行表征时，理想情况下，使用抗磷酸化蛋白抗体进行蛋白质印迹（Western blotting）后，应能观察到一条清晰且可重复的条带，其迁移位置与相应总蛋白条带相近或一致（图3）。然而，若蛋白质发生广泛磷酸化，则磷酸化蛋白条带相较于总蛋白条带可能出现轻微上移。此外，若组织中存在多种蛋白异构体，且每种均发生磷酸化，或该蛋白还受到其他可变的翻译后修饰（PTMs），则使用抗磷酸化蛋白抗体进行蛋白质印迹时可能出现多条条带。如果在检测到目标总蛋白的情况下，仍未观察到目标磷酸化蛋白的信号，则可能表明该蛋白在所选实验条件下并未发生磷酸化，或实验流程中出现了技术问题。在后一种情况下，可使用抗磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体和/或抗磷酸酪氨酸抗体对全细胞裂解液进行蛋白质印迹，以验证实验流程是否正常。由于蛋白质磷酸化在颅面组织中广泛存在25,37，因此出现多条磷酸化蛋白条带表明实验流程已成功完成，且初步筛选结果准确可靠。<.......
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讨论
本文所述方案使研究人员能够以可靠且可重复的方式探究颅面发育过程中关键的依赖磷酸化的信号事件。该方案中有多个关键步骤，可确保数据的正确收集和结果的准确分析。无论是从小鼠面部突起和/或培养的腭间充质细胞中分离磷酸化蛋白，都必须迅速而高效地操作，并在需要时将所有试剂和材料置于冰上。冰的低温可减缓细胞的代谢活性，从而保护磷酸化蛋白免受磷酸酶活性的影响38，并维持较高的蛋白得率。在上颌突分离过程中使用三个独立的10 cm培养皿，可确保所有解剖操作均在充分预冷的组织学PBS中进行。此外，本蛋白分离方案的另一个关键组分是在所有裂解缓冲液中加入磷酸酶抑制剂。这些试剂同样可保护目标蛋白上的磷酸基团39,40，并维持磷酸化蛋白的完整性，以便后续进行蛋白质印迹分析。
该方案还引入了若干改进，可实现对组织和培养细胞中磷酸化蛋白的更特异性分析。在分离面部突起的过程中，增加了可选步骤，以分离上颌突的外胚层和间充质，从而便于研究特定区室内的蛋白质磷.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
129S4 小鼠由西奈山伊坎医学院的 Philippe Soriano 博士惠赠。本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）/ 国立牙科与颅面研究所（NIDCR）基金 R01 DE027689 和 K02 DE028572（授予 K.A.F.）、F31 DE029976（授予 M.A.R.）以及 F31 DE029364（授予 B.J.C.D.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器 | |||
| 迷你干浴器用模块 | Research Products International Corp | 400783 | |
| 配备 Image Lab 软件的 ChemiDoc XRS+ 成像系统 | Bio-Rad | 1708265 | 化学发光成像仪 |
| CO2 培养箱，气套式 | VWR | 10810-902 | |
| 解剖板，11 x 13 英寸 | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| 电泳槽，4胶，用于迷你预制胶及迷你转印模块 | Bio-Rad | 1658030 | |
| 杂交炉 | Fisher Scientific | UVP95003001 | |
| 配备 F45-24-11 转子的 Microcentrifuge 5415 D（Eppendorf） | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| 迷你干浴器 | Research Products International Corp | 400780 | |
| 旋转摇床 | VWR | 89032-092 | |
| pH 计 | VWR | 89231-662 | |
| SDS-PAGE 电泳电源 | Bio-Rad | 1645050 | |
| 矩形冰盘，最大 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stemi 508 体视显微镜，配 K LAB 支架和 LED 环形灯 | Zeiss | 4350649020000000 | 解剖显微镜 |
| 计时器 | VWR | 62344-641 | |
| 管式旋转混合器 | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| 涡旋混合器 | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| 水浴锅 | VWR | 89501-472 | |
| Western 印迹槽 | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| 材料 | |||
| 细胞培养皿，6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 细胞培养板，12 孔 | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| 细胞刮刀 | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| 聚丙烯锥形管，50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 精细镊子 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 胚胎勺 | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| 微量离心管，0.5 mL | VWR | 89000-010 | |
| 微量离心管，1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| 巴斯德移液管，5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| 巴斯德移液管，9" | VWR | 14672-380 | |
| 培养皿，10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| 培养皿，35 mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| 透明聚乙烯衬里袋 | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| PVDF 膜 | Fisher Scientific | IPVH00010 | |
| Semken 镊子 | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| 小型乳胶吸头，2 mL | VWR | 82024-554 | |
| 手术剪刀 | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| 注射器滤器，25 mm，0.2 μm 孔径 | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| 带鲁尔接头的注射器，10 mL | VWR | BD309604 | |
| 移液管 | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Western 印迹夹具开启杠杆 | Bio-Rad | 4560000 | |
| Whatmann 3MM chr 层析纸 | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| 试剂 | |||
| 4-15% 预制蛋白凝胶，10 孔，30 µL | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-甘油磷酸二钠盐水合物 | Sigma Aldrich | G5422-25G | 储存液浓度 1 M |
| β-巯基乙醇 | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| 牛血清白蛋白，V 型，经热休克检测 | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| 溴酚蓝 | Fisher Scientific | AC403140050 | |
| Complete mini 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma Aldrich | 11836153001 | 储存液浓度 25x |
| DC 蛋白定量试剂盒 II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM，高糖 | Gibco | 11965092 | |
| E7，小鼠单克隆 β 微管蛋白一抗，浓缩液 0.1 mL | 发育研究杂交瘤库 | E7 | 1:1,000 |
| ECL Western 印迹底物 | Fisher Scientific | PI32106 | 低皮克级范围 |
| ECL Western 印迹底物 | Genesee Scientific | 20-302B | 低飞克级范围 |
| 电泳缓冲液，5 L | Bio-Rad | 1610772 | 储存液浓度 10x |
| 乙醇，200 证明，1 加仑 | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| 乙二胺四乙酸，二钠盐二水合物（结晶粉末/电泳级） | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| 胎牛血清，经鉴定，美国来源，500 mL | HyClone | SH30071.03 | |
| 甘油（经 ACS 认证） | Fisher Scientific | G33-4 | |
| HRP 标记二抗，山羊抗小鼠 IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20,000 |
| HRP 标记二抗，山羊抗兔 IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20,000 |
| 盐酸溶液，6N（经认证） | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca-630 非离子型去污剂 | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| 异丙醇（HPLC 级） | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | 储存液浓度 200 mM |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK（Erk1/2）一抗 | Cell Signaling Technology | 9102S | 1:1,000；抗 Erk1/2 |
| PDGF-BB 重组配体，大鼠 | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| PDGF 受体 β 一抗 | Cell Signaling Technology | 3169S | 1:1,000 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | 储存液浓度 100 U/mL，100 µg/mL |
| 苯甲基磺酰氟，99% | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF；储存液浓度 100 mM |
| 磷酸化 p44/42 MAPK（Erk1/2）一抗 | Cell Signaling Technology | 9101S | 1:1,000，抗磷酸化 Erk1/2 |
| 磷酸化 PDGF 受体 α / PDGF 受体 β 一抗 | Cell Signaling Technology | 3170S | 1:1,000 |
| 氯化钾（白色晶体） | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| 磷酸二氢钾（白色晶体） | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS 溶液，10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| 氯化钠（晶体/生物级，经认证） | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| 氟化钠（粉末/ACS 认证） | Fisher Scientific | S299-100 | NaF；分装为一次性使用；储存液浓度 1 M |
| 正钒酸钠，99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4；储存液浓度 100 mM |
| 无水磷酸氢二钠（颗粒或粉末/ACS 认证） | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| 组织培养用 PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| 转印缓冲液，5 L | Bio-Rad | 1610771 | 储存液浓度 10x |
| Tris 碱（白色晶体或结晶粉末/分子生物学级） | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| 胰蛋白酶 | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Western 印迹分子量标准品 | Bio-Rad | 1610374 | |
| 软件 | |||
| ImageJ 软件 | National Institutes of Health | ||
| 动物 | |||
| 雌性 129S4 小鼠 | 由 Mount Sinai 伊坎医学院 Philippe Soriano 博士惠赠 |
参考文献
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling a....
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