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Developmental Biology

Isolement des lysats de protéines de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales cultivées pour l’analyse des phosphoprotéines

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63834
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally

Summary

Le protocole présente une méthode pour isoler les lysats de protéines de cellules entières des processus faciaux d’embryons de souris disséqués ou de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires de souris cultivées et effectuer un transfert occidental ultérieur pour évaluer les niveaux de protéines phosphorylées.

Abstract

Le développement craniofacial des mammifères est un processus morphologique complexe au cours duquel plusieurs populations cellulaires se coordonnent pour générer le squelette frontonasal. Ces changements morphologiques sont initiés et maintenus par diverses interactions de signalisation, qui incluent souvent la phosphorylation des protéines par les kinases. Ici, deux exemples de contextes physiologiquement pertinents dans lesquels étudier la phosphorylation des protéines au cours du développement craniofacial des mammifères sont fournis: les processus faciaux de souris, en particulier les processus maxillaires E11.5, et les cellules mésenchymates palatales embryonnaires de souris cultivées dérivées de plateaux palataux secondaires E13.5. Pour surmonter la barrière commune de la déphosphorylation lors de l’isolement des protéines, les adaptations et les modifications apportées aux méthodes de laboratoire standard qui permettent l’isolement des phosphoprotéines sont discutées. De plus, des pratiques exemplaires sont fournies pour l’analyse et la quantification appropriées des phosphoprotéines après le transfert western des lysats de protéines de cellules entières. Ces techniques, en particulier en combinaison avec des inhibiteurs pharmacologiques et / ou des modèles génétiques murins, peuvent être utilisées pour mieux comprendre la dynamique et les rôles de diverses phosphoprotéines actives au cours du développement craniofacial.

Introduction

Le développement craniofacial des mammifères est un processus morphologique complexe au cours duquel plusieurs populations cellulaires se coordonnent pour générer le squelette frontonasal. Chez la souris, ce processus commence au jour embryonnaire (E) 9,5 avec la formation de la proéminence frontonasale et de paires de processus maxillaires et mandibulaires, chacun contenant des cellules de la crête neurale crânienne post-migratoire. Les processus nasaux latéraux et médiaux proviennent de la proéminence frontonasale avec l’apparition des fosses nasales et finissent par fusionner pour former les narines. De plus, les processus nasaux médiaux et les processus maxillaires fusionnent pour générer la lèvre supérieure. Parallèlement, la palatogenèse est initiée par la formation d’excroissances distinctes - les plateaux palataux secondaires - du côté oral des processus maxillaires à E11.5. Au fil du temps, les étagères palatines se développent vers le bas de chaque côté de la langue, s’élèvent à une position opposée au-dessus de la langue et finissent par fusionner à la ligne médiane pour former un palais continu qui sépare les cavités nasale et buccale par E16.51.

Ces changements morphologiques tout au long du développement craniofacial sont initiés et maintenus par diverses interactions de signalisation, qui incluent souvent la phosphorylation des protéines par les kinases. Par exemple, les récepteurs de la membrane cellulaire, tels que les sous-familles de récepteurs β du facteur de croissance transformant (TGF), y compris les récepteurs de protéines morphogénétiques osseuses (BMPR) et diverses familles de récepteurs tyrosine kinase (RTK), sont autophosphorylés lors de la liaison et de l’activation du ligand dans les cellules de la crête neurale crânienne 2,3,4 . De plus, le récepteur transmembranaire couplé à la protéine G Smoothened devient phosphorylé dans les cellules de la crête neurale crânienne et l’ectoderme craniofacial en aval de la liaison du ligand sonic hedgehog (SHH) au récepteur Patched1, ce qui entraîne une accumulation lissée au niveau de la membrane ciliaire et une activation de la voie SHH5. De telles interactions ligand-récepteur peuvent se produire par signalisation autocrine, paracrine et / ou juxtacrine dans des contextes craniofaciaux. Par exemple, BMP6 est connu pour signaler de manière autocrinale lors de la différenciation des chondrocytes6, tandis que le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) 8 est exprimé dans l’ectoderme de l’arc pharyngé et se lie aux membres de la famille FGF des RTK exprimés dans le mésenchyme de l’arc pharyngé de manière paracrine pour initier le modelage et l’excroissance des arcs pharyngés7, 8,9,10. En outre, la signalisation Notch est activée dans les chondrocytes et les ostéoblastes pendant le développement du squelette craniofacial par la signalisation juxtacrine lorsque les ligands transmembranaires Delta et / ou Jagged se lient aux récepteurs Transmembranaires Notch sur les cellules voisines, qui sont ensuite clivés et phosphorylés11. Cependant, il existe d’autres paires de ligands et de récepteurs importantes pour le développement craniofacial qui ont la flexibilité de fonctionner à la fois dans la signalisation autocrine et paracrine. À titre d’exemple, au cours de la morphogenèse des dents murines, il a été démontré que le ligand PDGF)-AA du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF)-AA signale de manière autocririne pour activer le RTK PDGFRα dans l’épithélium12 de l’organe de l’émail. En revanche, dans les processus faciaux murins au milieu de la gestation, les transcriptions codant pour les ligands PDGF-AA et PDGF-CC sont exprimées dans l’ectoderme craniofacial, tandis que le récepteur PDGFRα est exprimé dans le mésenchyme dérivé de la crête neurale crânienne sous-jacente, ce qui entraîne une signalisation paracrine 13,14,15,16,17 . Quel que soit le mécanisme de signalisation, ces événements de phosphorylation des récepteurs entraînent souvent le recrutement de protéines adaptatrices et/ou de molécules de signalisation, qui se phosphorylent fréquemment elles-mêmes pour initier des cascades de kinases intracellulaires telles que la voiemapk(e) de la protéine kinase activée par le mitogène (MAPK) 18,19.

Les effecteurs intracellulaires terminaux de ces cascades peuvent alors phosphoryler un ensemble de substrats, tels que les facteurs de transcription, la liaison à l’ARN, les protéines de matrice cytosquelettique et extracellulaire. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 et Sox926 font partie des facteurs de transcription phosphorylés dans le contexte du développement craniofacial. Cette modification post-traductionnelle (PTM) peut affecter directement la susceptibilité aux PTM alternatifs, la dimérisation, la stabilité, le clivage et/ou l’affinité de liaison à l’ADN, entre autres activités 20,21,25,26. De plus, la protéine de liaison à l’ARN Srsf3 est phosphorylée dans le contexte du développement craniofacial, ce qui conduit à sa translocation nucléaire27. En général, il a été démontré que la phosphorylation des protéines de liaison à l’ARN affecte leur localisation subcellulaire, les interactions protéine-protéine, la liaison à l’ARN et / ou la spécificité de la séquence28. En outre, la phosphorylation de l’actomyosine peut entraîner des réarrangements cytosquelettiques tout au long du développement craniofacial29,30, et la phosphorylation des protéines de la matrice extracellulaire, telles que les petites glycoprotéines liées à l’azote du ligand liant l’intégrine, contribue à la biominéralisation au cours du développement du squelette31. À travers ce qui précède et de nombreux autres exemples, il est évident qu’il existe de vastes implications pour la phosphorylation des protéines au cours du développement craniofacial. En ajoutant un niveau supplémentaire de régulation, la phosphorylation des protéines est encore modulée par les phosphatases, qui contrecarrent les kinases en éliminant les groupes phosphate.

Ces événements de phosphorylation aux niveaux du récepteur et de la molécule effectrice sont essentiels pour la propagation des voies de signalisation et entraînent finalement des changements dans l’expression des gènes dans le noyau, entraînant des activités cellulaires spécifiques, telles que la migration, la prolifération, la survie et la différenciation, qui entraînent une formation correcte du visage des mammifères. Compte tenu de la spécificité contextuelle des interactions protéiques avec les kinases et les phosphatases, des changements qui en résultent dans les PTM et de leurs effets sur l’activité cellulaire, il est essentiel que ces paramètres soient étudiés dans un cadre physiologiquement pertinent pour acquérir une compréhension complète de la contribution des événements de phosphorylation au développement craniofacial. Ici, des exemples de deux contextes dans lesquels étudier la phosphorylation des protéines et, par conséquent, l’activation des voies de signalisation au cours du développement craniofacial des mammifères sont fournis: les processus faciaux de souris, en particulier les processus maxillaires E11.5, et les cellules mésenchymes palatales embryonnaires de souris cultivées dérivées de plateaux palataux secondaires E13.5 - à la fois primaires32 et immortalisées33 . À E11.5, les processus maxillaires sont en train de fusionner avec les processus nasaux latéraux et médiaux1, représentant ainsi un point temporel critique pendant le développement craniofacial de la souris. En outre, les processus maxillaires et les cellules dérivées des plateaux palataux ont été choisis ici parce que ces dernières structures sont des dérivés de la première, offrant ainsi aux chercheurs la possibilité d’interroger la phosphorylation des protéines in vivo et in vitro dans des contextes connexes. Cependant, ce protocole est également applicable aux processus faciaux alternatifs et aux points temporels de développement.

Un problème critique dans l’étude des protéines phosphorylées est qu’elles sont facilement déphosphorylées lors de l’isolement des protéines par des phosphatases environnementales abondantes. Pour surmonter cette barrière, les adaptations et les modifications apportées aux méthodes de laboratoire standard qui permettent l’isolement des protéines phosphorylées sont discutées. De plus, des pratiques exemplaires sont fournies pour l’analyse et la quantification appropriées des protéines phosphorylées. Ces techniques, en particulier en combinaison avec des inhibiteurs pharmacologiques et / ou des modèles génétiques murins, peuvent être utilisées pour mieux comprendre la dynamique et les rôles de diverses voies de signalisation actives au cours du développement craniofacial.

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Protocol

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du campus médical Anschutz de l’Université du Colorado et effectuées conformément aux directives et réglementations de l’établissement. Des souris femelles 129S4 âgées de 1,5 à 6 mois et logées à une température sous-thermoneutre de 21 à 23 °C ont été utilisées pour les récoltes d’embryons. Un flux de travail schématique du protocole est représenté à la figure 1. Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails concernant tous les matériaux, équipements, logiciels, réactifs et animaux utilisés dans ce protocole.

1. Récolte d’embryons de souris E11.5

  1. Euthanasier la souris femelle 11,5 jours après la détection du bouchon vaginal lors de l’accouplement chronométré dans une chambre de CO2 en utilisant le débit de CO 2 approuvé parl’IACUC requis pour un déplacement d’environ 50% (2,95 L / min dans une chambre 360 dans3 ) et la durée d’exposition (voir tableau des matériaux). Effectuer la luxation cervicale comme méthode secondaire d’euthanasie. Procéder immédiatement à la dissection.
  2. Posez le corps de la souris sur une planche de dissection avec le côté ventral tourné vers le haut. Vaporisez l’abdomen de la souris avec 70% d’éthanol.
  3. Ouvrez la cavité abdominale en pinçant et en soulevant la peau antérieure à l’ouverture vaginale avec une pince Semken droite et en coupant la peau soulevée et les couches sous-jacentes avec des ciseaux chirurgicaux à lame droite à un angle de 45 ° de chaque côté pour générer une forme en « V » qui s’étend à chaque surface latérale à peu près à mi-chemin entre les membres antérieurs et les membres postérieurs.
  4. À l’aide de la pince Semken, saisissez l’une des cornes utérines et coupez sous l’oviducte et au-dessus du col de l’utérus avec les ciseaux chirurgicaux. Coupez le mésomètre pour permettre l’élimination complète de la corne utérine.
  5. Transférer la corne utérine disséquée dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate histologique (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monobasique, 10,14 mM Na2HPO4 dibasique, pH 7,4] dans une boîte de Pétri de 10 cm.
  6. Retirez la deuxième corne utérine du côté opposé de la cavité abdominale en utilisant la même procédure décrite aux étapes 1.4-1.5.
  7. Placez la boîte de Petri de 10 cm contenant les deux cornes utérines sur de la glace si vous ne procédez pas immédiatement à la dissection d’embryons individuels (c.-à-d. si une deuxième souris femelle est disséquée).
  8. Sous un stéréomicroscope disséquant, disséquez soigneusement chaque embryon des cornes utérines avec une pince fine Dumont #5. Retirez lentement le myomètre, le décidua et le chorion. Déchirez et retirez l’amnion relativement transparent entourant l’embryon et coupez le cordon ombilical reliant l’embryon au placenta.
  9. Transférer chaque embryon disséqué à 2,5 mL de PBS histologique dans un puits individuel d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits sur glace à l’aide d’une pipette de transfert en plastique coupée ou d’une cuillère à embryons.
    REMARQUE: Si vous travaillez avec une portée qui peut contenir des embryons de plus d’un génotype, conservez l’amnion entourant chaque embryon pour le génotypage en plaçant chacun dans son propre tube de microcentrifuge prémarqué de 0,5 mL sur de la glace.

2. Disséquer les processus maxillaires des embryons de souris E11.5

  1. Préparez trois boîtes de Petri de 10 cm contenant 10 mL de PBS histologique et conservez-les sur de la glace pour les utiliser en rotation entre les embryons.
  2. Transférer un embryon d’un puits individuel de la plaque de culture cellulaire de 12 puits à l’une des boîtes de Petri de 10 cm avec l’histologie PBS sur glace à l’aide d’une pipette de transfert en plastique coupé ou d’une cuillère à embryons.
  3. Sous le microscope à dissection, séparez chaque processus maxillaire du visage à l’aide de la pince fine. Tout d’abord, coupez la face antérieure d’un processus maxillaire le long de l’indentation naturelle séparant le processus nasal latéral et le processus maxillaire (Figure 2A).
  4. Deuxièmement, coupez la face postérieure du processus maxillaire le long de l’indentation naturelle séparant le processus maxillaire et le processus mandibulaire (Figure 2A).
  5. Troisièmement, pour séparer complètement le processus maxillaire, faites une coupe verticale des côtés antérieur à postérieur du processus maxillaire du côté oculaire du processus maxillaire où les indentations naturelles référencées ci-dessus se terminent (Figure 2A-C).
  6. Répétez ces trois coupes pour le processus maxillaire du côté opposé du visage.
  7. À l’aide d’un pipot Pasteur de 9 po avec une petite ampoule en latex de 2 mL, transférer la paire disséquée de procédés maxillaires et une petite gouttelette d’environ 30 μL de PBS histologique dans une boîte de Petri étiquetée de 35 mm sur de la glace (Figure 2D).
  8. Suivez les étapes 2.3 à 2.7 pour chaque embryon, en faisant pivoter les trois boîtes de Petri de 10 cm contenant du PBS histologique sur de la glace entre les embryons. Placez des paires individuelles de processus maxillaires disséqués dans des boîtes de Petri séparées de 35 mm sur de la glace.
    REMARQUE: La séparation de l’ectoderme maxillaire et du mésenchyme (étapes 2.9-2.17) peut être effectuée après avoir disséqué les processus maxillaires de tous les embryons de la portée. Si des processus maxillaires intacts contenant à la fois l’ectoderme et le mésenchyme sont souhaités, passez à l’étape 2.18 ci-dessous.
  9. Préparer 250 μL de trypsine fraîche à 2 % dans le PBS de culture tissulaire et 250 μL de sérum bovin fœtal (FBS) à 10 % dans le PBS de culture tissulaire et conserver sur glace.
  10. Placer une deuxième petite gouttelette d’environ 30 μL de trypsine à 2 % dans la boîte de Petri de 35 mm séparée de la première petite gouttelette de PBS histologique contenant les processus maxillaires. Transférer la paire de procédés maxillaires dans la petite gouttelette de trypsine à 2 % à l’aide de la pipette Pasteur (Figure 2D).
  11. Incuber le plat sur de la glace pendant 15 min.
  12. Retirez la boîte de Petri de 35 mm de la glace et placez-la sous le microscope à dissection.
  13. À l’aide de la pince fine, retirez lentement et soigneusement la couche d’ectoderme de chaque processus maxillaire (Figure 2E).
    REMARQUE: Si l’ectoderme ne se sépare pas du mésenchyme dans une feuille intacte, incuber dans 2% de trypsine à température ambiante (RT) jusqu’à 5 minutes supplémentaires avant de poursuivre la séparation. Si le tissu commence à se désintégrer dans la trypsine à 2%, déplacez les processus maxillaires vers le FBS à 10% comme décrit ci-dessous pour neutraliser la trypsine et terminer la séparation de l’ectoderme et du mésenchyme.
  14. Une fois que l’ectoderme et le mésenchyme du processus maxillaire sont séparés (Figure 2F), transférez les tissus souhaités de la paire de processus maxillaires à une troisième petite gouttelette d’environ 30 μL de 10% FBS - séparée des deux petites gouttelettes précédentes - à l’aide du pipet Pasteur (Figure 2D).
  15. Placez la boîte de Petri de 35 mm sur de la glace pour arrêter la trypsinisation.
  16. Incuber les tissus du processus maxillaire sur de la glace dans 10% FBS pendant 1-2 min, puis transférer les tissus des deux processus maxillaires à une quatrième petite gouttelette d’environ 30 μL de PBS histologique précroché sur glace - séparée des trois petites gouttelettes précédentes - à l’aide du pipot Pasteur (Figure 2D).
  17. Incuber les tissus du processus maxillaire dans le PBS d’histologie pendant 1 min tout en faisant tourbillonner doucement le PBS d’histologie autour des tissus du processus maxillaire avec la pointe du pipot Pasteur pour s’assurer que tout FBS est rincé du tissu.
  18. Transférer la paire de tissus maxillaires de traitement dans un tube de microcentrifugation marqué de 1,5 mL sur de la glace à l’aide de la pipette Pasteur, minimisant ainsi le transfert de PBS histologique. Enlever tout excès de PBS histologique dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL avec le pipet Pasteur.
  19. Suivez les étapes ci-dessus pour disséquer les processus maxillaires de chaque embryon de la portée.
  20. Traiter les échantillons immédiatement pour isoler les lysats de protéines cellulaires entières (ci-dessous) ou les stocker à -80 °C à long terme. Avant le stockage à long terme, congeler le tube de microcentrifugation de 1,5 mL dans un bain de 100 % d’EtOH sur de la glace carbonique pendant 5 min.

3. Isoler les lysats de protéines cellulaires entières des processus maxillaires de souris

  1. Si les procédés maxillaires ont déjà été congelés à -80 °C, décongelez-les sur de la glace.
  2. Ajouter 0,1 mL de tampon de lyse NP-40 glacé (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10 % de glycérol, 1 % de Nonidet P-40, 2 mM d’EDTA ; conservé à 4 °C) avec des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase (1x cocktail complet d’inhibiteurs de mini protéase [dissous dans l’eau ; conservé à -20 °C], 1 mM de PMSF [dissous dans de l’isopropanol ; stocké à 4 °C], 10 mM de NaF [entreposés à -20 °C; éviter le gel/dégel], 1 mM de Na3VO4 [entreposé à -20 °C], 25 mM de β-glycérophosphate [conservé à 4 °C]) ajoutés immédiatement avant utilisation sur glace.
    REMARQUE: Le fractionnement cellulaire peut également être effectué pour isoler les fractions de protéines cytoplasmiques, nucléaires, membranaires ou mitochondriales.
  3. Pipet de haut en bas 10 fois avec un pipetman de 200 μL.
  4. Vortex pendant 10 s, puis pipet de haut en bas 10 fois avec un pipetman de 200 μL. Évitez de générer des bulles.
  5. Incuber à 4 °C pendant 2 h en tournant bout à bout à l’aide d’une palette de 1,5 mL/2 mL avec un revolver à tube.
  6. Centrifuger les échantillons à 13 500 × g pendant 20 min à 4 °C.
  7. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL sur de la glace avec un pipimètre de 200 mL.
  8. Quantifier la concentration en protéines avec le kit d’analyse des protéines, en utilisant 10 μL de lysat de protéine + 10 μL de tampon de lyse NP-40 pour les échantillons expérimentaux et 3-5 dilutions d’albumine sérique bovine (fraction V) (BSA) dans le tampon de lyse NP-40 à une plage de 0,25-2,0 mg / mL comme étalons protéiques.
  9. Procéder à l’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) (étape 5) ou congeler rapidement les lysats restants sur de la glace carbonique et les conserver à -80 °C à long terme.

4. Isoler les lysats de protéines cellulaires entières des cellules primaires et/ou immortalisées du mésenchyme palatal embryonnaire (MEPM) de souris

NOTE: L’isolement et la culture de cellules MEPM primaires à partir d’embryons de souris E13.5 et de cellules MEPM immortalisées ont déjà été décrits 32,33,34. La stimulation des cellules avec un facteur de croissance (étapes 4.1-4.7) peut être effectuée avant la lyse cellulaire. Si des cellules non stimulées sont souhaitées, passez à l’étape 4.8 ci-dessous.

  1. Aspirer le milieu de croissance [milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 50 U/mL de pénicilline, 50 μg/mL de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 10 % FBS] des cellules MEPM à ~70 % de confluence dans une boîte de culture cellulaire de 6 cm à l’aide d’un pipet Pasteur de 5,75 po attaché à un système de vide.
  2. Lavez les cellules avec 1 mL de PBS de culture tissulaire.
  3. Ajouter 3 mL de milieu de famine sérique [DMEM avec 50 U/mL de pénicilline, 50 μg/mL de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 0,1 % FBS] préavertissé dans un bain-marie à 37 °C.
  4. Incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 23 h.
  5. Remplacer le milieu de famine sérique par 3 mL de milieu de famine sérique frais et préavertissé.
  6. Incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 1 h.
  7. Stimuler les cellules avec le facteur de croissance de choix à une concentration déterminée empiriquement pendant la durée souhaitée.
  8. Aspirer le milieu des cellules MEPM à une confluence de 80% à 100% à l’aide d’une pipette Pasteur de 5,75 » fixée à un système de vide.
  9. Laver les cellules deux fois avec une culture tissulaire glacée PBS (1 mL pour un plat de culture cellulaire de 6 cm); inclinez la plaque sur le côté lors du dernier lavage pour vous assurer que tout le PBS de culture tissulaire est aspiré.
  10. Lyser les cellules en ajoutant un tampon de lyse NP-40 glacé avec de la protéase et des inhibiteurs de la phosphatase ajoutés immédiatement avant utilisation (0,1 mL pour une boîte de culture cellulaire de 6 cm) sur de la glace.
  11. Incuber la plaque sur de la glace pendant 5 min avec rotation environ toutes les minutes pour assurer une couverture complète de la plaque.
  12. Grattez les cellules de la plaque à l’aide d’un élévateur de cellules prérefroidi et transférez la suspension de cellules dans un tube de microcentrifugation prérefroidi de 1,5 mL sur de la glace.
  13. Incuber la suspension de la cellule à 4 °C pendant 30 min tout en tournant bout à bout à l’aide d’une palette de 1,5 mL/2 mL avec un revolver à tube.
  14. Passez aux étapes 3.6 à 3.9 décrites ci-dessus.

5. Transfert occidental de lysats de protéines de cellules entières provenant de processus faciaux de souris et / ou de cellules MEPM pour les phosphoprotéines

  1. Préparez des échantillons de lysat de protéines de cellules entières pour SDS-PAGE.
    1. Déterminer la quantité de protéines à charger, en fonction de l’abondance des protéines dans le tissu ou la cellule; 12,5 μg est généralement suffisant pour les protéines exprimées de manière robuste dans les lysats de protéines de cellules entières.
    2. Ajouter un volume égal de 2x tampon Laemmli [20% de glycérol, 4% de FDS, 0,004% de bleu de bromophénol, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] avec 10% de β-mercaptoéthanol ajouté immédiatement avant utilisation.
      ATTENTION : β-mercaptoéthanol est corrosif pour la peau ou les yeux, toxique, dangereux s’il est avalé et présente une toxicité aquatique. Portez des gants, un manteau de laboratoire, un écran facial et des lunettes de sécurité dans une hotte à fumée chimique. Éliminer conformément aux directives de santé et de sécurité environnementales.
    3. Mélanger par vortex.
    4. Chauffer les échantillons à 100 °C pendant 5 min dans un mini bain sec.
    5. Mélanger par vortex et placer les échantillons sur de la glace.
    6. Centrifuger à 9 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
    7. Placer brièvement les échantillons sur la glace avant de les charger dans le gel SDS-PAGE, ou conserver à -20 °C à long terme.
  2. Effectuez SDS-PAGE à l’aide d’une cellule d’électrophorèse avec un gel protéique préfabriqué de 4% à 15% et un tampon d’électrophorèse35.
  3. Électrotransférez les protéines vers une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) à l’aide d’un tampon de transfert avec 0% à 20% de méthanol (0% à 10% pour les protéines supérieures à 100 kDa; 20% pour les protéines inférieures à 100 kDa) ajouté immédiatement avant l’utilisation35.
  4. Bloquez la membrane et sondez la phosphoprotéine d’intérêt.
    1. Après le transfert, laver la membrane dans 1x solution saline tamponnée tris (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] pendant 5 min dans une boîte western blot.
    2. Incuber la membrane dans 5 mL de tampon bloquant [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% w/v BSA; bien mélangé et filtré à travers un filtre à seringue de 25 mm avec des pores de 0,2 μm à l’aide d’une seringue de 10 mL avec embout luer] pendant 1 h dans une boîte à transfert western avec agitation sur un agitateur orbital.
      REMARQUE: N’utilisez pas le lait comme agent bloquant lors de la caractérisation des phosphoprotéines car il contient la caséine phosphoprotéine, ce qui peut provoquer un signal de fond élevé et non spécifique.
    3. Lavez la membrane trois fois pendant 5 minutes chacune dans TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] dans une boîte de transfert western avec agitation sur un agitateur orbital.
    4. Incuber la membrane dans 5 mL d’anticorps primaire dilué dans un tampon bloquant à 4 °C pendant la nuit dans un tube conique de 50 mL à l’aide d’une palette de 50 mL avec un revolver à tube.
      REMARQUE: Consultez la fiche technique des anticorps pour connaître la concentration appropriée pour le transfert western.
    5. Lavez la membrane trois fois à TA pendant 5 minutes chacune dans TBS-T dans une boîte de transfert western avec agitation sur un agitateur orbital.
    6. Incuber la membrane dans 5 mL d’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) approprié dilué dans un tampon bloquant pendant 1 h dans une boîte de transfert western avec agitation sur un agitateur orbital.
    7. Lavez la membrane trois fois pendant 5 minutes chacune dans TBS-T dans une boîte de transfert western avec agitation sur un agitateur orbital.
    8. Incuber la membrane dans un substrat de transfert western à chimiluminescence améliorée (ECL) [mélange de volumes égaux à partir de bouteilles 1 et 2; 0,5 mL de chacun pour de grandes membranes (8,6 cm x 6,7 cm)] pendant 1 min, en veillant à ce que toute la membrane soit continuellement exposée au substrat de western blotting ECL.
    9. Drainez la membrane de l’excès de substrat de western blotting ECL et développez-la immédiatement à l’aide d’un imageur de chimiluminescence.
  5. Décaper la membrane et ressasser pour obtenir la protéine totale d’intérêt.
    1. Placer la membrane PVDF dans une pochette transparente avec doublure en polyéthylène contenant 5 mL de tampon de décapage [2 % SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] avec 8 μL/mL de β-mercaptoéthanol ajouté immédiatement avant utilisation.
    2. Incuber à 50 °C pendant 30 min avec bascule dans un four d’hybridation à 11 tours par minute.
    3. Lavez la membrane trois fois à TA pendant 5 minutes chacune dans TBS-T dans une boîte de transfert western avec agitation sur un agitateur orbital.
    4. Passez aux étapes 5.4.2 à 5.4.9 décrites ci-dessus.
  6. Quantifier les densités de bande western blot à l’aide du logiciel ImageJ, en normalisant les niveaux de la protéine phosphorylée d’intérêt aux niveaux de la protéine totale d’intérêt36.

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Representative Results

Lorsque l’on tente de caractériser la phosphorylation de protéines isolées à partir de processus faciaux de souris et/ou de cellules de mésenchyme palatales cultivées, les résultats représentatifs révéleront idéalement une bande distincte et reproductible après un transfert western avec un anticorps anti-phosphoprotéine qui se situe à la hauteur ou près de la hauteur de la bande protéique totale correspondante (Figure 3 ). Cependant, si une phosphorylation étendue de la protéine se produit, il peut y avoir un léger déplacement vers le haut de la bande phosphoprotéique par rapport à celle de la bande protéique totale. De plus, s’il existe plusieurs isoformes d’une protéine dans un tissu, dont chacune est phosphorylée, ou si la protéine est soumise de manière variable à des PTM supplémentaires, plusieurs bandes peuvent apparaître dans le transfert occidental avec un anticorps anti-phosphoprotéine. Si aucun signal n’est observé pour la phosphoprotéine d’intérêt, malgré la détection de la protéine totale d’intérêt, la protéine peut ne pas être phosphorylée dans le contexte choisi, ou un problème technique peut être apparu avec le protocole. Dans ce dernier cas, le transfert occidental des lysats de cellules entières peut être effectué avec des anticorps anti-phosphoséronine/thréonine et/ou anti-phosphotyrosine pour indiquer si le protocole a fonctionné comme prévu. Comme la phosphorylation des protéines est abondante dans les tissus craniofaciaux25,37, la présence de plusieurs bandes de phosphoprotéines indiquera que le protocole a bien réussi et les résultats précis du dépistage initial.

Il est souvent utile de comparer les niveaux de phosphoprotéines entre les tissus embryonnaires de type sauvage et mutants ou en réponse au traitement de cellules cultivées. Dans le premier cas, une différence dans les niveaux de phosphoprotéines entre les génotypes apparaîtrait comme une différence dans les intensités de bande pour la phosphoprotéine d’intérêt avec des niveaux similaires de la protéine totale d’intérêt27. Dans ce dernier cas, des résultats représentatifs révéleraient une augmentation de l’intensité de la bande des phosphoprotéines par rapport à celles des cellules non traitées lors d’un traitement avec, par exemple, un facteur de croissance (Figure 3) et une diminution de l’intensité de la bande après un traitement par un inhibiteur de kinase27,37. Pour la quantification de ces différences, les niveaux de la phosphoprotéine d’intérêt seraient normalisés aux niveaux de la protéine totale d’intérêt. Les niveaux de la protéine totale d’intérêt devraient être relativement égaux entre les échantillons, une constatation qui devrait être confirmée par un transfert western séparé utilisant un ou plusieurs anticorps contre les protéines de contrôle de la charge et de l’expression telles que la β-tubuline, la β-actine et / ou le GAPDH (Figure 3). Pour le traitement par facteur de croissance des cellules cultivées, des résultats positifs montreront probablement une augmentation des niveaux de phosphoprotéines dans un laps de temps relativement court de 2 à 15 minutes après la stimulation (Figure 3). Il devrait y avoir peu ou pas de phosphorylation en l’absence de traitement du facteur de croissance, à moins qu’il n’y ait d’autres facteurs en jeu entraînant la phosphorylation de la protéine, dont des exemples incluent l’expression endogène des facteurs de croissance par les cellules, la phosphorylation de la protéine par une autre molécule de signalisation exprimée par les cellules, et / ou une mutation qui conduit à une phosphorylation constitutive de la protéine en l’absence de traitement du facteur de croissance. Ces facteurs doivent être pris en compte dans l’interprétation des résultats. Les résultats négatifs n’incluent aucun changement dans la phosphorylation en réponse à un traitement par facteur de croissance, auquel cas le protocole doit être évalué pour le maintien des phosphoprotéines comme détaillé ci-dessus. De plus, le processus de décapage de la membrane peut parfois affecter et réduire les niveaux de protéines totales. Dans ce cas, des tendances opposées pour la quantité de phosphoprotéine d’intérêt par rapport à la protéine totale d’intérêt seraient observées. Ceci est sous-optimal, car les niveaux de protéines totales devraient être relativement égaux d’un échantillon à l’autre, en supposant une charge et une expression égales de la protéine, les changements ne se produisant que dans les niveaux de phosphoprotéines.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail pour l’isolement des lysats de protéines cellulaires entières des processus faciaux de souris et des cellules mésenchymates palatines cultivées pour l’analyse des phosphoprotéines. Les processus maxillaires sont disséqués à partir d’embryons de souris E11.5 sur de la glace, et / ou le milieu est aspiré à partir de cellules MEPM cultivées à une confluence de 80% à 100%, qui sont ensuite lavées deux fois avec du PBS glacé. Les lysats de protéines cellulaires entières sont isolés à l’aide d’un tampon de lyse avec des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase, suivis de SDS-PAGE, de l’électrotransfert vers une membrane PVDF, du blocage de la membrane avec BSA, du sondage pour la phosphoprotéine, du décapage de la membrane, du réprouvage pour la protéine totale et de la quantification des intensités de bande. Abréviations : LNP = processus nasal latéral; MxP = processus maxillaire; MdP = processus mandibulaire; PA2 = deuxième arc pharyngé; PBS = solution saline tamponnée au phosphate; FBS = sérum bovin fœtal; PS = étagère palatine; MEPM = mésenchyme palatal embryonnaire de souris; SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide; PVDF = fluorure de polyvinylidène; p-P = protéine phosphorylée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Dissection des processus maxillaires. (A) Vue latérale d’un embryon de souris E11.5 avec les trois coupes (étiquetées 1-3) nécessaires pour séparer le MxP du visage indiqué par des lignes colorées. (B) Vue latérale d’un embryon de souris E11.5 après retrait de MxP soulignée d’une ligne noire pointillée. (C) MxP disséqué. (D) Une boîte de Petri de 35 mm avec de petites gouttelettes de PBS, 2% de trypsine et 10% de FBS pour la séparation facultative de l’ectoderme MxP et du mésenchyme. (E) MxP avec Ect partiellement séparé de Mes. (F) Séparation de MxP Ect et Mes. Barres d’échelle: 1 mm (A-C, E, F), 10 mm (D). Abréviations : LNP = processus nasal latéral; MxP = processus maxillaire; MdP = processus mandibulaire; PA2 = deuxième arc pharyngé; PBS = solution saline tamponnée au phosphate; FBS = sérum bovin fœtal; Mes = mésenchyme; Ect = ectoderme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Phosphorylation de l’effecteur PDGFRβ et MAPK Erk1/2 en réponse au traitement par ligand PDGF-BB des cellules MEPM immortalisées. Analyse par transfert Western de lysats de cellules entières à partir de cellules MEPM immortalisées après un cycle de stimulation du ligand PDGF-BB de 10 ng/ mL de 2 min à 15 min avec des anticorps anti-phospho-PDGFR, anti-PDGFRβ, anti-phospho-Erk1/2, anti-Erk1/2 et anti-β-tubuline (E7). Plusieurs bandes dans le transfert anti-PDGFRβ représentent des protéines glycosylées différentiellement. Abréviations : PDGF = facteur de croissance dérivé des plaquettes; WCL = lysat de cellules entières; kD = kilodalton; WB = transfert western; p-PDGFR = PDGFR phosphorylé; PDGFR = récepteur PDGF; p-Erk = Erk phosphorylé; Erk = kinase extracellulaire régulée par le signal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le protocole décrit ici permet aux chercheurs de sonder les événements critiques de signalisation dépendant de la phosphorylation au cours du développement craniofacial de manière robuste et reproductible. Ce protocole comporte plusieurs étapes essentielles qui garantissent une collecte appropriée des données et une analyse des résultats. Qu’il s’agisse d’isoler des phosphoprotéines des processus faciaux de souris et/ou de cultiver des cellules de mésenchyme palatal, il est impératif de se déplacer rapidement et efficacement tout en gardant tous les réactifs et matériaux sur la glace lorsque cela est indiqué. La basse température de la glace ralentit l’activité métabolique dans les cellules, protégeant ainsi les protéines phosphorylées de l’activité phosphatase38 et maintenant un rendement élevé en protéines. L’utilisation de trois boîtes de Petri séparées de 10 cm pendant la dissection des processus maxillaires garantit que toutes les dissections ont lieu dans un PBS d’histologie suffisamment précroché. De même, un composant supplémentaire essentiel de ce protocole d’isolement des protéines est l’utilisation d’inhibiteurs de la phosphatase dans tous les tampons de lyse. Ces réactifs protègent également les groupes phosphate sur la protéine d’intérêt39,40 et maintiennent l’intégrité de la protéine phosphorylée pour une analyse plus approfondie par transfert western.

Ce protocole introduit en outre des modifications qui permettent des analyses plus spécifiques des phosphoprotéines dans les tissus et les cellules cultivées. Dans le processus de dissection des processus faciaux, des étapes facultatives ont été ajoutées pour la séparation de l’ectoderme maxillaire et du mésenchyme afin de permettre l’étude de la phosphorylation des protéines spécifiques au compartiment27. Pour tester l’isolement efficace de ces couches tissulaires, les utilisateurs peuvent évaluer l’expression de gènes enrichis dans l’ectoderme, tels que Gabrp, Trim29, Esrp1 et Mpzl2, et / ou de gènes enrichis dans le mésenchyme, tels que Aldh1a2 et AW55198441. Pour l’isolement des phosphoprotéines des cellules de mésenchyme palatal en culture, des étapes facultatives ont été ajoutées pour la stimulation du facteur de croissance. Dans ce cas, les cellules doivent être affamées de sérum dans un milieu contenant 0,0% à 0,1% de sérum. Les sérums standard tels que FBS contiennent de nombreux facteurs de croissance42 qui peuvent convoluter les résultats de la stimulation exogène du facteur de croissance. Ainsi, la famine sérique temporaire incite les cellules à répondre au traitement par facteur de croissance aigu.

Ce protocole fournit également des méthodes optimisées pour quantifier avec précision la phosphorylation des protéines. Dans les étapes de transfert western, il est important de bloquer la membrane PVDF en utilisant du BSA plutôt que du lait, qui est utilisé dans de nombreuses techniques de transfert western standard. Ce changement est impératif, car le lait contient la caséinephosphoprotéine 43 et conduit à un signal de fond élevé dans l’analyse d’autres phosphoprotéines. En outre, il est important que les niveaux de la protéine phosphorylée d’intérêt soient quantifiés par rapport aux niveaux de la protéine totale d’intérêt plutôt qu’aux niveaux d’une protéine témoin de charge standard. De cette façon, tout changement dans l’expression de la protéine totale d’intérêt peut être pris en compte dans la quantification des niveaux de phosphoprotéines. Si le rendement en protéines en général est trop faible pour une détection précise des phosphoprotéines, des échantillons de tissus du même stade et du même génotype peuvent être regroupés27, et / ou des cellules peuvent être cultivées dans des récipients de culture cellulaire plus grands que ceux décrits ici pour de futures expériences. Alternativement, si le stripping semble constamment modifier les niveaux de protéines totales, deux approches peuvent être adoptées pour modifier le protocole décrit afin d’obtenir des résultats reproductibles : 1) l’utilisation d’un schéma d’anticorps qui utilise des anticorps anti-phosphoprotéines et anti-protéines générés dans différentes espèces hôtes combinés à deux anticorps secondaires spécifiques à l’espèce et séparés (si vous utilisez des anticorps secondaires conjugués HRP) ou simultanément (si vous utilisez des anticorps secondaires conjugués au fluorophore) développement des taches; ou 2) traitement simultané de deux membranes identiques - la première incubée avec un anticorps anti-phosphoprotéine, la seconde avec un anticorps anti-protéine. Dans les deux approches alternatives, les niveaux de la protéine phosphorylée d’intérêt doivent toujours être quantifiés par rapport aux niveaux de la protéine totale d’intérêt. Enfin, comme la phosphorylation est un processus dynamique, les niveaux de phosphoprotéines doivent être évalués dans au moins trois répliques biologiques par condition. Le tissu de traitement facial de souris ou les cellules MEPM primaires dérivées d’un embryon individuel ou d’un groupe individuel d’embryons du même stade et du même génotype constitueraient une seule réplique biologique. De même, les cellules MEPM immortalisées de différents passages constitueraient des répliques biologiques. Si les cellules cultivées sont traitées avec du facteur de croissance, le traitement des répliques biologiques doit avoir lieu à des jours différents en utilisant des aliquotes distinctes de facteur de croissance.

Il existe deux limites de l’approche présentée ici, qui sont discutées ci-dessous et devraient être prises en compte avant d’initier le protocole. Le premier concerne la plage dynamique de l’ECL. Le substrat de western blotting ECL recommandé dans ce protocole a une large plage dynamique, avec une faible sensibilité au picogramme. Cependant, empiriquement, les protéines de faible abondance ou de faible statut de phosphorylation peuvent être difficiles à détecter à l’aide de ces méthodes. Si les protéines phosphorylées sont indétectables après 20 minutes d’incubation du substrat ECL, il est recommandé de laver la membrane dans TBS-T comme décrit et d’incuber la membrane dans un substrat de western blotting ECL à haute sensibilité avec une faible sensibilité au femtogramme. Alternativement, des anticorps secondaires conjugués au fluorophore peuvent être utilisés, qui offrent une plage dynamique plus large que les approches à base d’enzymes telles que ECL44. Une deuxième limitation découle de la procédure de normalisation. Comme décrit en détail, il est recommandé que le signal de la phosphoprotéine d’intérêt soit normalisé au signal de la protéine totale d’intérêt. Cependant, ce processus repose sur l’hypothèse que les niveaux de la protéine totale d’intérêt ne changent pas entre les échantillons, ce qui est souvent confirmé par un transfert western séparé utilisant des anticorps contre une ou plusieurs protéines d’entretien ménager. Une considération importante est cependant que les niveaux de protéines d’entretien ménager peuvent changer entre les échantillons en raison d’une charge inégale, d’un transfert incomplet à la membrane et / ou de différences dans l’expression des protéines. Ainsi, pour améliorer la précision lors de la normalisation, les chercheurs peuvent envisager de mettre en œuvre une véritable coloration protéique totale, telle que Ponceau S45, qui détecte toutes les protéines dans chaque voie de la membrane et tient compte de ces limitations techniques.

Dans l’ensemble, ce protocole surmonte le problème de la déphosphorylation des protéines qui se produit généralement lors de l’isolement des protéines. Une analyse précise de la phosphorylation des protéines aidera les chercheurs à mieux comprendre le rôle des protéines phosphorylées au cours du développement craniofacial. En outre, ce protocole offre des méthodes robustes et efficaces pour analyser les niveaux de protéines phosphorylées dans des contextes physiologiquement pertinents, chacun avec ses propres avantages. Alors que les lysats protéiques des tissus embryonnaires fournissent un instantané statique de la phosphorylation des protéines in vivo, la mise en œuvre de cellules cultivées fournit des données sur les réponses dynamiques de phosphorylation aux traitements aigus. Ce protocole a la capacité de confirmer et d’élargir directement les résultats et les hypothèses découlant de grands ensembles de données, par exemple la spectrométrie de masse37 et le séquençage de l’ARN27, afin de découvrir de nouvelles interactions au sein des réseaux de signalisation. Il est important de noter que ce protocole peut être utilisé pour sonder comment les perturbations de la phosphorylation influencent directement la signalisation intracellulaire, l’expression des gènes et l’activité cellulaire dans des contextes craniofaciaux. Ces diverses applications amélioreront considérablement la compréhension des effets de la phosphorylation des protéines dans le développement craniofacial.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

129S4 souris étaient un cadeau du Dr Philippe Soriano, Icahn School of Medicine à Mount Sinai. Ce travail a été soutenu par des fonds des National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 et K02 DE028572 à K.A.F., F31 DE029976 à M.A.R. et F31 DE029364 à B.J.C.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca - 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

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Biologie du développement numéro 182 Développement craniofacial phosphorylation phosphoprotéines souris processus maxillaires cellules de mésenchyme palatale embryonnaire de souris
Isolement des lysats de protéines de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales cultivées pour l’analyse des phosphoprotéines
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Rogers, M. A., Dennison, B. J. C.,… More

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

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