Summary
이 프로토콜은 관심있는 유전자에 결실을 품고 있는 마우스 비뇨생식기 오가노이드의 생성 및 특성화의 과정을 기술한다. 상기 방법은 마우스 비뇨생식기 세포 수확, CMV 프로모터로 Cre 발현을 유도하는 아데노바이러스를 이용한 생체외 형질도입, 및 시험관내 및 생체외 특성화를 포함한다.
Abstract
방광암은 특히 유전자 조작 마우스 모델 (GEMMs)에서 과소 연구 된 영역입니다. 조직 특이적 Cre 및 loxP 부위를 갖는 교배 GEMMs는 조건부 또는 유도성 유전자 표적화를 위한 황금 표준이었다. 보다 빠르고 효율적인 실험 모델을 제공하기 위해, 종양 억제제 Trp53, Pten 및 Rb1의 다중 loxP 대립 유전자를 운반하는 아데노바이러스 Cre 및 정상 비뇨생식기 세포를 사용하여 생체외 오가노이드 배양 시스템이 개발된다. 정상적인 비뇨생식기 세포는 삼중 플록스 마우스의 네 개의 방광으로부터 효소적으로 분리된다(Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f). 비뇨생식기 세포는 CMV 프로모터(Ad5CMVCre)에 의해 구동되는 아데노바이러스-Cre로 생체외로 형질도입된다. 형질도입된 방광 오가노이드는 배양되고, 전파되고, 시험관내 및 생체내에서 특성화된다. PCR은 Trp53, Pten 및 Rb1에서 유전자 결실을 확인하는 데 사용됩니다. 오가노이드의 면역형광(IF) 염색은 비뇨생식기 계통 마커(CK5 및 p63)의 양성 발현을 입증한다. 오가노이드는 종양 확장 및 연속 통과를 위해 숙주 마우스에 피하 주사된다. 이종이식편의 면역조직화학(IHC)은 CK7, CK5 및 p63의 양성 발현 및 CK8 및 우로플라킨 3의 음성 발현을 나타낸다. 요약하면, loxP 부위로 조작된 마우스 비뇨생식기 세포로부터의 아데노바이러스-매개 유전자 결실은 정의된 유전적 변경의 종양원성 잠재력을 신속하게 시험하는 효율적인 방법이다.
Introduction
방광암은 남성에서 네 번째로 흔한 암이며 미국에서 매년 80,000 명 이상의 사람들에게 영향을 미칩니다1. 백금 기반 화학 요법은 삼십 년 이상 진행성 방광암 환자를위한 치료의 표준이었습니다. 방광암 치료의 풍경은 최근 FDA (Food and Drug Administration)의 면역 요법 (항 PD-1 및 항 PD-L1 면역 체크포인트 억제제), 에르다 피티닙 (섬유 아세포 성장 인자 수용체 억제제) 및 엔포르투맙 베도틴 (항체 - 약물 접합체)2,3,4의 승인으로 혁명을 일으켰습니다. 그러나, 화학요법 또는 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위해 임상적으로 승인된 바이오마커는 이용가능하지 않다. 방광암 진행을 유도하는 메커니즘에 대한 이해를 향상시키고 다양한 치료 양식에 대한 예측 바이오마커를 개발할 수 있는 유익한 전임상 모델을 생성해야 할 절실한 필요성이 있습니다.
방광 번역 연구의 주요 장애물은 인간 방광암 발병기전과 치료 반응 5,6을 재검토하는 전임상 모델의 부족이다. 시험관내 2D 모델(세포주 또는 조건부로 재프로그램된 세포), 시험관내 3D 모델(오가노이드, 3D 프린팅) 및 생체내 모델(이종이식편, 발암물질-유도, 유전자 조작 모델 및 환자 유래 이종이식편)2,6을 포함하는 다수의 전임상 모델이 개발되었다. 유전자 조작된 마우스 모델(GEMMs)은 종양 표현형의 분석, 후보 유전자 및/또는 신호전달 경로의 기계론적 조사, 치료 반응의 전임상 평가6,7을 포함하여 방광암 생물학의 많은 응용에 유용하다. GEMMs는 하나 이상의 종양 억제 유전자에서 유전적 결실을 조절하기 위해 부위-특이적 재조합효소(Cre-loxP)를 이용할 수 있다. 여러 유전자 결실로 원하는 GEMM을 생성하는 과정은 시간이 많이 걸리고 힘들고 비용이 많이 듭니다5. 이 방법의 전반적인 목표는 삼중 플록스 대립 유전자 (Trp53, Pten, 및 Rb1)8을 운반하는 정상 마우스 비뇨 생식기 세포로부터 방광 삼중 녹아웃 (TKO) 모델을 확립하기위한 생체외 Cre 전달의 신속하고 효율적인 방법을 개발하는 것입니다. 생체 외 방법의 가장 큰 장점은 빠른 워크 플로 (수년간의 마우스 번식 대신 1-2 주)입니다. 이 글에서는 플록스 대립유전자, 생체외 아데노바이러스 형질도입, 오가노이드 배양, 면역적격 C57 BL/6J 마우스에서의 시험관내 및 생체내 특성화를 갖는 정상 비뇨생식기 세포를 수확하기 위한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 플록스 대립 유전자의 임의의 조합을 보유하는 면역적격 마우스에서 임상적으로 관련된 방광암 오가노이드를 생성하는데 추가로 사용될 수 있다.
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Protocol
모든 동물 절차는 뉴욕 버팔로의 Roswell Park Comprehensive Cancer Center의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (1395M, Biosafety 180501 및 180502)의 승인을 받았습니다.
참고: 같은 날에 1-3단계를 수행하십시오.
1. 마우스 방광의 해부
- 해부 준비
- 가위, 포셉, 멸균 DPBS를 포함한 모든 멸균 기구를 35mm 배양 접시, 70% 에탄올, 멸균 거즈 및 깨끗한 종이 타월에 준비하십시오. 해부 영역의 모든 표면을 청소하십시오. 앞서 설명한 바와 같이 수컷 삼중 플록스 마우스 Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1f/f (4마리 마우스, 10주령)를 생성한다.
- 안락사와 절개
- 마우스를CO2 질식에 의해 2.0 L/min 유속을 사용하여 안락사시키고, 이어서 자궁경부 탈구를 가한다. 해부 부위를 70 % 에탄올로 청소하고 깨끗한 종이 타월로 덮으십시오.
- 마우스를 해부 부위의 거즈 위에 놓습니다. 마우스 복부에 70 % 에탄올을 뿌리고 멸균 해부 가위를 사용하여 방광을 노출시키는 중간 선 복부 절개를 만듭니다.
- 방광 해부
- 포셉을 사용하여 방광을 잡고 부드럽게 당겨서 양측 요관 접합부가 확인되도록하십시오. 가위를 사용하여 두 요관 개구부 사이의 경계선을 따라 방광 안저부를 제거하십시오.
- 방광을 DPBS 2mL의 멸균 접시에 옮깁니다. 지방과 결합 조직을 제거하고 방광을 멸균 된 DPBS 2 mL로 새 접시에 넣으십시오. 이때 아데노바이러스를 -80°C에서 꺼내어 얼음 위에 보관한다.
2. 비뇨생식기 세포의 해리
- 세포 해리를 위한 제조
- 포셉, 수술용 메스(손잡이가 달린 10개의 칼날), 35mm 배양 접시에 멸균 DPBS, CCM(-)으로 정의된 숯이 벗겨진 FBS가 없는 완전한 배양 배지, 콜라게나제/히알루로니다제 혼합물, 트립신 대체용 재조합 효소, 10μM 신선한 Y-27632가 있는 DPBS의 10% 숯 제거 FBS, 100μm 멸균 세포 스트레이너 및 15mL 원심분리 튜브를 포함한 모든 멸균 기구를 준비하십시오.
참고: 완전 배양 배지(CCM)는 제공된 성장 인자 및 5% 숯 제거 FBS, 1% L-글루타민 대체물, 100μg/mL 프리모신 및 10μM 신선한 Y-27632로 보충된 유방 상피 세포 성장 배지로 구성됩니다.
- 포셉, 수술용 메스(손잡이가 달린 10개의 칼날), 35mm 배양 접시에 멸균 DPBS, CCM(-)으로 정의된 숯이 벗겨진 FBS가 없는 완전한 배양 배지, 콜라게나제/히알루로니다제 혼합물, 트립신 대체용 재조합 효소, 10μM 신선한 Y-27632가 있는 DPBS의 10% 숯 제거 FBS, 100μm 멸균 세포 스트레이너 및 15mL 원심분리 튜브를 포함한 모든 멸균 기구를 준비하십시오.
- 방광을 다듬고 소화하는 것
- 방광을 옮기고 다시 2 mL의 멸균 DPBS로 생물 안전 캐비닛의 35mm 접시에 씻으십시오.
- 네 마리의 생쥐로부터 방광 조직을 1mL의 CCM(-)이 있는 접시에 모으고 수술용 블레이드를 사용하여 각 방광을 네 개의 동일한 조각으로 다듬습니다. 포셉을 사용하여 방광을 펼쳐 요로텔륨 표면을 매체에 노출시킵니다.
- 방광 조각과 배지를 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 접시를 2 mL의 CCM(-) 2x로 세척하고 원심분리 튜브에서 총 부피 5 mL로 수집한다.
- 콜라게나제/히알루로니다아제 혼합물을 최종 농도 300 U/mL 콜라게나제 및 100 U/mL 히알루로니다아제에 첨가하고, 튜브를 37°C 오비탈 인큐베이팅 진탕기에 수평으로 놓고 200 rpm에서 30분 동안 진탕기에서 30분 동안 보관한다.
- 조직 소화 후, DPBS에 10% 숯이 벗겨진 FBS의 동량(5 mL)을 튜브에 첨가하고, 튜브를 200 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
- 상층액을 제거하고 버립니다. 트립신 대체물 2 mL를 세포 펠릿에 넣고 잘 섞는다. 튜브를 4분 동안 37°C 및 5%CO2 에서 세포 인큐베이터에 넣었다.
- 인큐베이션 후, 표준 P1000 팁으로 10x 위아래로 피펫을 켭니다. DPBS에 10% 숯을 제거한 FBS 5mL를 첨가합니다.
- 분리된 세포를 100 μm 멸균 세포 스트레이너를 통해 변형시킨다. 세포 현탁액을 수집하고 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한다.
- 셀 계수 및 재현탁
- 상층액을 제거하고 버립니다. 세포 펠릿을 1 mL의 CCM으로 재현탁시킨다.
- 혈구세포계를 사용하여 세포 수를 계수하고, 단지 0.5 x 106 세포를 0.5 mL의 신선한 CCM이 있는 24-웰 플레이트의 웰에 넣는다. 이때, 엥겔브레스-홀름-스웜 마우스 육종 세포의 매트릭스 추출물( 물질표 참조)을 꺼내어 -20°C에서 보관하고 얼음 위에서 해동시킨다. 6-웰 플레이트를 37°C 세포 인큐베이터에서 예열한다.
참고: 나머지 세포는 원심분리 및 비바이러스 형질도입 조절을 위한 세포 펠릿으로서 동결될 수 있다.
3. 아데노바이러스 전달 및 도금 오가노이드
주의: 아데노바이러스를 처리할 때는 주의하시기 바랍니다. 실험실 직원은 생물 안전 수준 2 관행을 따르고 아데노 바이러스를 10 % 표백제로 소독해야합니다.
- 2μL의 아데노바이러스(Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU/μL)를 24웰 플레이트에 넣습니다. 분리되지 않은 비뇨 생식기 세포와 잘 섞으십시오.
- 형질도입 효능을 향상시키려면, 24-웰 플레이트를 실온에서 30분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 스핀오케이션을 수행한다. 24-웰 플레이트를 1시간 동안 37°C 및 5%CO2 의 세포 인큐베이터에 놓는다.
- 세포 및 배지를 웰로부터 15 mL 튜브로 옮기고 200 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 버리고, 50 μL의 CCM을 추가하고, 하단의 세포와 잘 섞는다.
- 140 μL의 매트릭스 추출물을 첨가하고 기포를 피하기 위해 부드럽게 잘 섞으십시오. 용액을 50μL/돔에서 미리 예열된 6웰 플레이트에 빠르게 넣어 오가노이드용 돔을 만듭니다.
- 플레이트를 5%CO2 가 있는 37°C 인큐베이터로 부드럽게 옮기고 돔이 5분 동안 응고되도록 한다. 6웰 플레이트를 거꾸로 뒤집고 추가 25분 동안 응고를 계속합니다.
- 배양 후, 2.5 mL의 CCM을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 오가노이드 배양을 위한 인큐베이터에 놓는다.
4. 오가노이드 배양 및 패시징
- 3-4 일마다 배지를 교체하십시오. Lee et al.9에 보고된 바와 같이 오가노이드 배양, 통과 및 동결을 수행한다. Fujii et al.10에 기재된 바와 같이 시편 처리 겔을 사용하여 오가노이드의 임베딩을 수행한다.
- 배지를 제거하고 각 웰에 디스파제 1mL를 첨가한다. 부드럽게 돔을 부수고 P1000 피펫 팁과 잘 섞으십시오.
- 플레이트를 30분 동안 5%CO2 가 있는 37°C 인큐베이터에 놓는다. 이어서, 모든 세포를 15 mL 원심분리 튜브에 수집하고, DPBS 중의 10% 숯-벗겨진 FBS 4 mL로 웰을 세척하였다. 오가노이드 세포가 큰 군집으로 나타나면 2.2.6단계를 수행하십시오. 및 2.2.7 단계. 연결이 끊어진 세포를 얻습니다.
- 튜브를 200 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고 세포를 1 mL의 CCM으로 세척한다.
- 세포를 70% 매트릭스 추출물에 재현탁시키고 단계 3.4.-3.6을 따른다. 배양을 위해. 대안적으로, 90% 숯 벗겨진 FBS 및 10 μM 신선한 Y-27632로 보충된 10% DMSO에서 재현탁함으로써 세포를 동결보존한다.
5. C57BL/6J 마우스에 피하 이식 오가노이드 세포
- 이식 준비
- 바늘에 25G 1.5, 1 mL 주사기, 1 mg/mL 디스파제, 매트릭스 추출물, 10 μM 신선한 Y-27632 및 15 mL 원심분리 튜브로 DPBS에 10% 숯을 벗긴 FBS를 준비하십시오.
- 오가노이드 세포 수집
- 적어도 5 계대 동안 안정한 배양을 달성한 후, 생체내 주사를 위해 확장된 오가노이드 세포를 수집한다. 단계 4.2.-4.4를 따르십시오. 세포를 1 mL의 CCM에 재현탁시킨다.
- 세포 계수 및 피하 주사
- 혈구세포계를 사용하여 세포 수를 계산하십시오. 200 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 2 x 106 세포를 DPBS의 50% 매트릭스 추출물 100 μL에 재현탁시켰다. 서스펜션을 얼음 위에 놓고 동물 시술실의 생물 안전 캐비닛에 넣으십시오.
- 2마리의 수컷 C57BL/6J 마우스(10주령)를 4% 이소플루란과 1L/minO2 흐름으로 챔버 내에서 약 4분 동안 마취시킨다. 마우스가 오른쪽 반사를 잃고 호흡 패턴이 더 깊고 느려지면 마우스를 2 % 이소플루란과 1 L /min O2 흐름으로 비 재호흡 회로로 옮깁니다. 외상성 부상으로부터 동물의 눈을 보호하기 위해 수의사 연고를 바르십시오.
- 마우스의 오른쪽 옆구리에서 주사 부위 주변의 한 영역을 면도하고 70 % 에탄올을 사용하여 클렌징 한 다음 25G 바늘을 사용하여 마취하에 오른쪽 측면에 100 μL 세포 현탁액을 직접 주입하십시오.
- 주사 후, 흡입 마취를 제거하고 마우스를 열 램프 아래의 케이지에 넣고 완전히 동원 할 때까지 가열합니다. 마우스를 하우징으로 돌려 보내고 종양 형성을 모니터링하십시오.
6. 종양 수집 및 생체내 전파
- 준비 단계 2.1.1을 따르십시오. 마우스를CO2 질식에 의해 2.0 L/min 유속을 사용하여 안락사시킨 다음, ~2.0 cm 직경의 종양(거의 2-3주)이 형성된 후 자궁경부 탈구가 뒤따른다. 마우스를 깨끗한 해부 영역으로 옮기고 마우스 옆구리 종양 부위에 70 % 에탄올을 뿌리고 멸균 해부 가위와 포셉을 사용하여 종양을 분리하기 위해 절개를하십시오.
- 종양을 DPBS 5mL로 60mm 접시에 씻고 가위를 사용하여 결합 조직을 제거하십시오. 신선한 종양의 한 조각을 자르고 48 시간 동안 DPBS에 4 % 파라포름 알데히드로 가라 앉히고 조직학 분석을 위해 파라핀 임베딩 및 절편을 위해 보냅니다.
- 세포 분리를 위해 신선한 종양의 나머지 절반을 처리한다. 간단히 말해서, 신선한 종양을 1mm3 조각으로 다듬어 5 mL의 CCM(-)이 있는 60 mm 접시에서 해리시킨다. 이어서, 단계 2.2.4.-2.2.8.에 이어서, 분리된 세포를 새로운 C57BL/6J 마우스에 주입하여 단계 5.3 에 이어 생체내 패시징한다. 또는 단계 3.4.-3.6. 에 따라 시험관내 오가노이드 배양물로서 유지하거나, 10 μM 신선한 Y-27632로 90% 숯 벗겨진 FBS 및 10% DMSO를 사용하여 액체 질소에서 직접 동결시킨다.
- 필요한 경우, 동결된 세포를 37°C 수조에서 빠르게 해동하고 CCM(-)으로 세척하여 회수한다. 그 후, 이를 DPBS의 50% 매트릭스 추출물 100 μL에 재현탁시켜 생체내 종양 형성을 위해 마우스에 직접 주사한다. 하나 생체내 주사를 위해 적어도 2 x 106 해동된 세포를 사용한다.
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Representative Results
마우스 비뇨생식기 세포에서 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실의 워크플로우를 도 1A에 나타내었다. 수반되는 비디오는 비뇨생식기 세포가 방광의 안저로부터 어떻게 분리되는지, 그리고 삼중 플록싱된 세포가 Ad5CMVCre로 생체외 에서 어떻게 형질도입되는지를 보여준다. 도 1A는 효소 소화 후 최소 점막하 및 근육 세포가 분리되었음을 보여주었다. 아데노바이러스-Cre 전달의 효율을 확인하기 위해, 막 표적화된 tdTomato/막 국소화된 강화된 녹색 형광 단백질(mT/mG)을 갖는 삼중 플록스 마우스로부터의 분리된 비뇨생식기 세포를 아데노바이러스 Cre로 형질도입하였다. 녹색 형광 단백질(GFP)은 거의 100%의 세포에서 검출되었으며, 이는 아데노바이러스 형질도입의 높은 효율을 나타낸다(도 1B).
안정한 TKO 오가노이드는 표준 오가노이드 프로토콜에 따라 확립되었다 (5개 이상의 계대가 있는 시험관내 ; 도 2A). 시험관내 오가노이드 절편의 H&E 및 면역형광(IF)(도 2A)은 비뇨생식기 계통 마커 CK5 및 p6311의 양성 발현을 갖는 고급 비뇨생식기 암종의 형태를 입증하였다. PCR 분석 결과 TKO 오가노이드에서 재결합 대립유전자가 밝혀진 반면, 재결합되지 않은 플록스 대립유전자는 아데노바이러스로 처리되지 않은 비뇨생식기 세포에서만 검출되었다(도 2B). 총 2 x 106 일차 생체외 오가노이드를 8주 내에 초기 피하 (SQ) 종양 형성을 위해 C57BL/6J에 주사하였다. 이어서, SQ 종양 (계대 1)을 수집하고, 마우스에서 계대시켰다. 일반적으로, 2 cm SQ 종양 (계대 2-5)을 형성하기 위해 2-3 주가 필요했다 (도 2C). 생체내 이종이식편 TKO의 면역조직화학(IHC)은 CK7(patchy), CK5, 및 p63의 양성 발현과 CK8 및 우로플라킨 3의 음성 발현을 나타내었다(도 2D). 중간엽 세포의 오염을 검출하기 위해, TKO 종양을 비멘틴에 대해 염색하였다. H & E 염색은 왼쪽에 종양을 보여 주었고 오른쪽의 캡슐은 노란색 선으로 구분되었습니다. 양성 비멘틴은 종양 캡슐 또는 스트로마에서만 검출되었다(도 2E).
도 1: 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실은 loxP 부위를 갖는 마우스 비뇨생식기 세포에서 결실. (A) 생체외 아데노바이러스 Ad5CMVCre를 통한 TKO 오가노이드 생성의 워크플로우. 짧은 시간 30분 효소 소화는 기저 점막하 및 근육 프로프리아로부터 비뇨생식기 세포를 분리시키기에 충분했다. 분리된 비뇨생식기 세포를 TKO 오가노이드에 대해 Ad5CMVCre로 형질도입하고, 이어서 C57BL/6J 마우스에 주사하였다. (B) mT/mG(Cre 재조합 후 녹색 형광 단백질로 전환되는 적색 형광 단백질의 구성적 전이유전자 발현)를 갖는 삼중 플록싱된 비뇨생식기 세포를 Ad5CMVCre로 형질도입하였다. 세포의 거의 100%가 GFP 양성이었으며, 이는 매우 효율적인 형질도입 및 Cre 재조합을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 생체외 아데노바이러스-Cre 재조합효소를 통한 TKO 오가노이드의 특성화. (A) 단절된 Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f 비뇨생식기 세포를 아데노바이러스(Ad5CMVCre)로 형질도입하여 TKO 오가노이드(밝은 장)를 생성하였다. TKO 오가노이드를 시편 처리 겔로 포매하고 H&E 및 면역형광에 대해 염색하였다. (b) 게놈 DNA를 삼중 플록싱된 비뇨생식기 세포(레인 2) 및 TKO 오가노이드(레인 4)로부터 추출하고, PCR에 의해 증폭시켜 Trp53, Rb1, 및 Pten의 플록스된 대립유전자 또는 Cre 재조합된 대립유전자를 검출한다. PCR 밴드는 에티듐 브로마이드로 염색하였다. 레인 1 및 레인 3은 음성 및 양성 재결합 대조군이었다. (c) 총체적 TKO SQ 종양 (계대 4)을 SQ 주사 후 17일째에 나타내었다. (d) TKO SQ 이종이식편으로부터의 종양 조직 절편을 H&E, IF (CK5, CK8) 또는 IHC (CK7, p63, Upk3)로 염색하였다. 약어: CK5 = 시토케라틴 5; CK20 = 시토케라틴 20; CK8 = 시토케라틴 8; CK7 = 시토케라틴 7; Upk3 = 우로플라킨 III. (e) TKO SQ 이종이식편으로부터의 종양 조직 절편을 H&E 및 IF(vimentin)로 염색하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
GEMM은 정상 세포에서 시작된 암 모델링의 황금 표준이었으며, 잠재적 인 종양원성 교란 (종양 유전자 활성화 및 / 또는 종양 억제제의 손실)의 결과를 엄격하게 테스트 할 수 있습니다. 여기서, 관심 유전자에 플록스된 대립유전자를 운반하는 정상 마우스 비뇨생식기 세포의 생체외 유전자 편집을 통해 방광암 오가노이드를 생성시키기 위한 신속하고 효율적인 프로토콜이 제공된다. H&E 및 IHC 염색은 TKO 오가노이드가 시험관내 오가노이드 및 생체내 이종이식편과 같은 편평 분화 및 기저 유사 아형을 갖는 고급 비뇨생식기 요로피와 일치하는 조직학을 나타낸다는 것을 입증한다. TKO 오가노이드는 Trp53, Rb1 및 Pten 손실의 효과를 연구하고, 약물 스크리닝하고, 신호전달 경로의 분자 평가를 위해 시험관내에서 사용될 수 있다. C57BL/6J 마우스에서 빠른 종양 형성은 화학요법 또는 면역요법과 같은 전신 요법에 대한 치료 반응을 평가하도록 설계된 생체내 연구를 가능하게 할 것이다.
요로텔륨은 기저 세포 층 (CK5 및 p63에 대해 양성), 중간 세포의 1-2 층 (Uroplakins 및 p63 양성) 및 우산 세포 (Uroplakins, CK8 및 CK20 양성)6로 구성됩니다. 이 방법의 중요한 단계는 장기간의 (4 시간) 효소 소화 대신 조직 분리의 제한된 시간 (30 분)이며, 이는 비 비뇨 생식기 점막하 세포의 오염을 최소화합니다 (그림 1A). 더 긴 분리 시간은 기질 세포, 예컨대 내피 세포 및 섬유아세포 세포의 백분율을 증가시킬 수 있다. 아데노바이러스의 생체외 형질도입 단계는 매우 효과적이다. 생체외 아데노바이러스 Cre 형질도입 후, GFP는 mT/mG 리포터 대립유전자를 갖는 비뇨생식기 세포의 거의 100%에서 가시화되었다(도 1B).
생체외 방법에는 한계가 있다. 먼저, 분리된 세포는 아데노바이러스 형질도입 전에 미리 선택되지 않는다. 예를 들어, 세포는 비뇨생식기 세포 대 비뇨생식기 세포, 또는 발광 세포 대 기저 세포에 대해 분화되지 않는다. EpCAM 및/또는 CD49f를 사용한 세포 분류는 생체외 형질도입(12,13) 전에 순수한 상피 세포 및/또는 줄기 세포를 분류하는데 사용될 수 있다. 둘째, 이 프로토콜에 사용된 CMV 프로모터로 Cre 발현을 유도하는 아데노바이러스는 조직 해체 후 광범위한 세포 유형(비뇨생식기 대 비비뇨생식기, 기저 대 발광 세포)을 표적으로 한다. 이러한 비특이적 표적화는 종양원성 가능성이 가장 높은 세포의 과성장을 야기하는 선택 편향을 야기할 수 있다. 세포 유형 특이적 아데노바이러스 벡터는 폐암 및 방광암 GEMMs14,15,16,17 둘 다에서 국소적으로 사용되어 왔다. 생체외 세포 유형 특이적 아데노바이러스(CK8 프로모터 또는 CK5 프로모터를 갖는 아데노바이러스)를 이용한 미래의 연구는 TKO 오가노이드가 기저 또는 발광 세포로부터 유래되었는지에 대한 세포 기원 질문을 다룰 수 있다(18). CK20 또는 Upk2 프로모터 특이적 아데노 바이러스 (우리의 지식으로는 사용할 수 없음)는 또한 비뇨 생식기에서 우산 세포를 형질 도입하도록 설계 될 수 있습니다. 그러나, 생체외 방광 감염에 대한 이들 프로모터 특이적 아데노바이러스의 효율성 및 특이성을 조사하기 위해서는 향후 연구가 필요하다. 숙주 환경(18)으로 인한 생체내 형질도입과 생체외 형질도입 사이에 아데노바이러스-Cre 효율에 불일치가 있을 수 있다. 셋째, 생체외 방법은 생체내 종양발생 및 조직형태학에 영향을 미칠 수 있는 종양 환경의 부족에 의해 제한된다. 이러한 한계에도 불구하고, 생체외 방법의 주요 장점은 빠른 워크플로우(수년간의 마우스 번식 대신 1-2주)이다. 생체외 접근법의 두 번째 이점은 아데노바이러스-Cre (Ad5CMVCre)가 상업적으로 입수가능하고, 간단하며, 바이러스 형질도입 및 Cre 재조합에 대해 거의 100% 효율적이라는 것이다(도 1B). 대조적으로, CRISPR 편집 또는 렌티바이러스 형질도입을 사용하는 대안적인 생체외 방법은 덜 효율적인 게놈 편집5,13,19,20으로 인해 추가적인 클론 선택을 필요로 한다.
요약하면, 기술된 생체외 아데노바이러스 접근법은 인간 방광암과 관련된 관심있는 유전자(floxed alleles)의 임의의 조합을 활용하여 방광암 모델을 생성하는데 편리하고, 빠르고, 효율적이다. 이들 모델은 세포 유형 특이적 아데노바이러스 및 세포 분류와 결합하여 방광암 표현형에 대한 기원 세포의 영향을 해결하고 정의된 유전자 돌연변이의 세트에서 면역요법에 대한 치료 반응을 평가할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구 작업은 NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 및 R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation 및 Friends of Urology Foundation이 부분적으로 지원했습니다. 원고를 교정해 주신 Marisa Blask와 Mila Pakhomova에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall Legend RT | Thermo Fisher | 75004377 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
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