Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Ex Vivo Organoidmodel af adenovirus-cre-medierede gendeletninger i museurtelceller

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63855
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1,2
1Department of Urology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, Roswell Park Comprehensive Cancer Center

Summary

Denne protokol beskriver processen med generering og karakterisering af muse urotheliale organoider, der indeholder deletioner i gener af interesse. Metoderne omfatter høst af muse urothelceller, ex vivo-transduktion med adenovirus, der driver Cre-ekspression med en CMV-promotor, og in vitro - såvel som in vivo-karakterisering .

Abstract

Blærekræft er et underundersøgt område, især i genetisk manipulerede musemodeller (GEMM'er). Indavlede GEMM'er med vævsspecifikke Cre- og loxP-steder har været guldstandarderne for betinget eller inducerbar genmålretning. For at give hurtigere og mere effektive eksperimentelle modeller udvikles et ex vivo organoidkultursystem ved hjælp af adenovirus Cre og normale urotelceller, der bærer flere loxP-alleler af tumorsuppressorerne Trp53, Pten og Rb1. Normale urothelceller adskilles enzymatisk fra fire blærer af triple floxed mus (Trp53f / f: Ptenf / f: Rb1f / f). Urotelcellerne transduceres ex vivo med adenovirus-Cre drevet af en CMV-promotor (Ad5CMVCre). De transducerede blæreorganoider dyrkes, formeres og karakteriseres in vitro og in vivo. PCR bruges til at bekræfte gendeletninger i Trp53, Pten og Rb1. Immunofluorescens (IF) farvning af organoider viser positiv ekspression af urothelial afstamningsmarkører (CK5 og p63). Organoiderne injiceres subkutant i værtsmus til tumorudvidelse og serielle passager. Immunohistokemien (IHC) af xenografts udviser positiv ekspression af CK7, CK5 og p63 og negativ ekspression af CK8 og Uroplakin 3. Sammenfattende er adenovirusmedieret gendeletning fra museurtelceller konstrueret med loxP-steder en effektiv metode til hurtigt at teste det tumorigene potentiale af definerede genetiske ændringer.

Introduction

Blærekræft er den fjerde mest almindelige kræft hos mænd og rammer mere end 80.000 mennesker årligt i USA1. Platinbaseret kemoterapi har været standardbehandling for patienter med fremskreden blærekræft i mere end tre årtier. Landskabet af blærekræftbehandling er blevet revolutioneret af den nylige Food and Drug Administration (FDA) godkendelse af immunterapi (anti-PD-1 og anti-PD-L1 immun checkpoint hæmmere), erdafitinib (en fibroblast vækstfaktor receptor inhibitor) og enfortumab vedotin (et antistof-lægemiddel konjugat) 2,3,4. Der findes dog ingen klinisk godkendte biomarkører til at forudsige responsen på kemoterapi eller immunterapi. Der er et kritisk behov for at generere informative prækliniske modeller, der kan forbedre forståelsen af de mekanismer, der driver blærekræftprogression og udvikle prædiktive biomarkører for forskellige behandlingsmetoder.

En stor hindring i blære translationel forskning er manglen på prækliniske modeller, der rekapitulerer human blærekræftpatogenese og behandlingsrespons 5,6. Der er udviklet flere prækliniske modeller, herunder in vitro 2D-modeller (cellelinjer eller betinget omprogrammerede celler), in vitro 3D-modeller (organoider, 3D-udskrivning) og in vivo-modeller (xenograft, kræftfremkaldende, genetisk manipulerede modeller og patientafledt xenograft)2,6. Gensplejsede musemodeller (GEMM'er) er nyttige til mange anvendelser inden for blærekræftbiologi, herunder analyser af tumorfænotyper, mekanistiske undersøgelser af kandidatgener og/eller signalveje og præklinisk evaluering af terapeutiske responser 6,7. GEMM'er kan anvende stedsspecifikke rekombinaser (Cre-loxP) til at kontrollere genetiske deletioner i et eller flere tumorsuppressorgener. Processen med at generere ønskede GEMM'er med flere gendeletninger er tidskrævende, besværlig og dyr5. Det overordnede mål med denne metode er at udvikle en hurtig og effektiv metode til ex vivo Cre-levering til etablering af blære triple knockout (TKO) modeller fra normale muse urothelceller, der bærer tredobbelt floxede alleler (Trp53, Pten og Rb1)8. Den største fordel ved ex vivo-metoden er den hurtige arbejdsgang (1-2 uger i stedet for mange års museavl). Denne artikel beskriver protokollen for høst af normale urothelceller med floxerede alleler, ex vivo adenovirustransduktion, organoidkulturer og in vitro- og in vivo-karakterisering i immunkompetente C57 BL / 6J-mus. Denne metode kan yderligere anvendes til at generere klinisk relevante blærekræftorganoider i immunkompetente mus, der huser enhver kombination af floxede alleler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 and 180502).
BEMÆRK: Udfør trin 1-3 samme dag.

1. Dissektion af museblære

  1. Forberedelse til dissektion
    1. Forbered alle de sterile instrumenter, herunder saks, tang, steril DPBS i 35 mm kulturskåle, 70% ethanol, sterilt gasbind og rene papirhåndklæder. Rengør alle overflader af dissektionsområdet. Generer mandlige tredobbelt floxed mus Trp53f / f: Ptenf / f: Rb1f / f (4 mus, 10 uger gamle), som tidligere beskrevet i Dr. Goodrichs laboratorium 8.
  2. Aktiv dødshjælp og snit
    1. Aflive musene ved CO2 - kvælning ved hjælp af en 2,0 l / min strømningshastighed efterfulgt af cervikal dislokation. Rengør dissektionsområdet med 70% ethanol og dæk med et rent papirhåndklæde.
    2. Placer musen på gasbind i dissektionsområdet. Spray 70% ethanol på musens mave og brug steril dissektionssaks til at lave et nedre midterlinje abdominal snit, der udsætter blæren.
  3. Dissekering af blæren
    1. Brug tang til at gribe blæren og forsigtigt trække op, så bilaterale ureterovesiske kryds identificeres. Brug en saks til at fjerne blære fundus efter grænselinjen mellem de to urinlederåbninger.
    2. Overfør blæren til en steril skål med 2 ml DPBS. Fjern fedt og bindevæv og læg blæren i en ny skål med steril 2 ml DPBS. På dette tidspunkt skal du tage adenovirus ud fra -80 ° C opbevaring og opbevare det på is.

2. Dissociation af urothelceller

  1. Forberedelse til celle dissociation
    1. Forbered alle sterile instrumenter, herunder tang, kirurgiske skalpeller (et blad i størrelse 10 med håndtag), sterile DPBS i 35 mm dyrkningsretter, komplet dyrkningsmedium uden trækulsstribbet FBS defineret som CCM (-), collagenase / hyaluronidaseblanding, rekombinant enzym til trypsinerstatning, 10% trækulsstribbet FBS i DPBS med 10 μM frisk Y-27632, en 100 μm steril cellesil og et 15 ml centrifugerør.
      BEMÆRK: Det komplette dyrkningsmedium (CCM) omfatter brystepitelcellevækstmedium suppleret med de tilvejebragte vækstfaktorer og 5% trækulsståret FBS, 1% L-glutaminerstatning, 100 μg / ml primocin og 10 μM frisk Y-27632.
  2. Mincing og fordøjelse af blæren
    1. Overfør og vask blæren igen med 2 ml steril DPBS i en 35 mm skål i et biosikkerhedsskab.
    2. Saml blærevæv fra fire mus i en skål med 1 ml CCM (-) og hak hver blære i fire lige store stykker ved hjælp af et kirurgisk blad. Brug tang til at udfolde blæren for at udsætte urotheloverfladen for mediet.
    3. Overfør blærestykkerne og mediet til et 15 ml centrifugerør. Vask fadet med 2 ml CCM(-) 2x og saml det i et centrifugerør til et samlet volumen på 5 ml.
    4. Der tilsættes kollagenase/hyaluronidase-blandingen til en endelig koncentration på 300 U/ml kollagenase og 100 U/ml hyaluronidase, og røret anbringes vandret i en 37 °C orbital inkubationsryster i 30 minutter ved 200 o/min.
    5. Efter vævsfordøjelse tilsættes et lige stort volumen (5 ml) 10% trækulsstribbet FBS i DPBS i røret og centrifugerer røret ved 200 x g i 5 minutter.
    6. Fjern og kassér supernatanten. Tilsæt 2 ml trypsinerstatning i cellepillen og bland godt. Sæt røret i en celleinkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i 4 minutter.
    7. Efter inkubation pipettes op og ned 10x med en standard P1000-spids. Tilsæt 5 ml 10% trækulsst strippet FBS i DPBS.
    8. Sil de disassocierede celler gennem en 100 μm steril cellesil. Opsaml cellesuspensionen og centrifugen ved 200 x g i 5 minutter.
  3. Optælling og genbrug af celler
    1. Fjern og kassér supernatanten. Resuspend cellepillen med 1 ml CCM.
    2. Tæl antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer og kun plade 0,5 x 106 celler i en brønd af en 24-brønds plade med 0,5 ml frisk CCM. På dette tidspunkt skal matrixekstrakterne af Engelbreth-Holm-Swarm musesarkomceller (se Tabel over materialer) tages ud af -20 °C opbevaring og optøes på is. Forvarm en 6-brønds plade i en 37 °C celleinkubator.
      BEMÆRK: De resterende celler kan centrifugeres og fryses som cellepiller til ikke-virus transduktionskontrol.

3. Adenovirale transduktions- og pletteringsorganoider

FORSIGTIG: Vær forsigtig, når du behandler adenovirus. Laboratoriepersonalet skal følge praksis på biosikkerhedsniveau 2 og desinficere adenovirus med 10 % blegemiddel.

  1. Der tilsættes 2 μL adenovirus (Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU/μL) i pladen med 24 brønde. Bland godt med de disassocierede urothelceller.
  2. For at forbedre transduktionseffektiviteten skal du udføre spinokulation ved at centrifugere pladen med 24 brønde ved 300 x g i 30 minutter ved stuetemperatur. Anbring pladen med 24 brønde i en celleinkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time.
  3. Overfør celler og medium fra brønden til et 15 ml rør og centrifuge ved 200 x g i 5 minutter. Fjern og kassér supernatanten, tilsæt 50 μL CCM, og bland godt med cellerne i bunden.
  4. Tilsæt 140 μL matrixekstrakt og bland forsigtigt godt for at undgå luftbobler. Tilsæt opløsningen hurtigt i den forvarmede 6-brønds plade ved 50 μL / kuppel for at skabe kupler til organoider.
  5. Overfør pladen til en 37 °C inkubator med 5 % CO2 forsigtigt, og lad kuplerne størkne i 5 minutter. Vend pladen med 6 brønde på hovedet, og fortsæt størkningen i yderligere 25 minutter.
  6. Efter inkubation tilsættes 2,5 ml CCM til hver brønd og anbringes pladen i en inkubator til organoidkultur.

4. Dyrkning og passering af organoider

  1. Skift medium hver 3-4 dage. Udfør organoiddyrkning, passaging og frysning som rapporteret i Lee et al.9. Udføre indlejring af organoider ved hjælp af prøvebehandlingsgel som beskrevet i Fujii et al.10.
  2. Fjern mediet og tilsæt 1 ml dispase til hver brønd. Bryd forsigtigt kuplen og bland godt med en P1000 pipettespids.
  3. Anbring pladen i en 37 °C inkubator med 5 % CO2 i 30 min. Saml derefter alle cellerne i et 15 ml centrifugerør og vask brønden med 4 ml 10% trækulsstribbet FBS i DPBS. Hvis organoidcellerne vises som store klynger, skal du udføre trin 2.2.6. og trin 2.2.7. for at få disassocierede celler.
  4. Centrifugering af røret ved 200 x g i 5 min. Fjern supernatanten og vask cellerne med 1 ml CCM.
  5. Resuspend cellerne i 70% matrixekstrakt og følg trin 3.4.-3.6. til dyrkning. Alternativt kryokonservere cellerne ved at genbruge i 90% trækulsst strippet FBS og 10% DMSO suppleret med 10 μM frisk Y-27632.

5. Implantation af organoidceller i C57BL/ 6J mus subkutant

  1. Forberedelse til implantation
    1. Forbered 25G 1.5 i nåle, en 1 ml sprøjte, 1 mg / ml dispase, matrixekstrakt, 10% trækul-strippet FBS i DPBS med 10 μM frisk Y-27632 og et 15 ml centrifugerør.
  2. Organoid celle samling
    1. Efter at have opnået en stabil kultur i mindst 5 passager, opsamles de ekspanderede organoidceller til in vivo-injektion . Følg trin 4.2.-4.4. og resuspend celler i 1 ml CCM.
  3. Optælling af celler og subkutan injektion
    1. Tæl antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer. Efter centrifugering ved 200 x g i 5 minutter resuspenderes 2 x 106 celler i 100 μL 50% matrixekstrakt i DPBS. Anbring suspensionen på is og tag den ind i et biosikkerhedsskab i et dyreforsøgsrum.
    2. Anæstesi to mandlige C57BL/6J mus (10 uger gamle) med 4% isofluran og 1 L/minO2 flow i ca. 4 min i et kammer. Når musene har mistet deres retterefleks, og deres vejrtrækningsmønster er blevet dybere og langsommere, overføres musene til et ikke-rebreathing kredsløb med 2% isofluran og 1 L/minO2 flow. Påfør dyrlæge salve for at beskytte dyrenes øjne mod traumatisk skade.
    3. Barber et område omkring injektionsstedet ved musens højre flanke og brug 70% ethanol til at rense, og brug derefter en 25 G nål til direkte at injicere 100 μL cellesuspensionen i højre flanke under anæstesi.
    4. Efter injektion skal du fjerne inhalationsbedøvelsen og placere musene i et bur under en varmelampe, indtil de er genoprettet og mobiliserer fuldt ud. Returner musene til boliger og overvåg tumordannelsen.

6. Tumoropsamling og in vivo-formering

  1. Følg forberedelsestrin 2.1.1. Aflive mus ved CO2 - kvælning ved hjælp af en 2,0 l / min strømningshastighed efterfulgt af cervikal dislokation efter en tumor på ~ 2,0 cm diameter (næsten 2-3 uger) er dannet. Overfør musene til et rent dissektionsområde, sprøjt 70% ethanol på museflanketumorområdet, og brug steril dissektionssaks og tang til at lave et snit for at adskille tumoren.
  2. Vask tumoren i en 60 mm skål med 5 ml DPBS og brug en saks til at fjerne bindevævet. Skær et stykke af den friske tumor og sænk den med 4% paraformaldehyd i DPBS i 48 timer og send til paraffinindlejring og sektionering til histologianalyse.
  3. Behandle den anden halvdel af den friske tumor til celle disassociation. Kort fortalt hakkes den friske tumor i 1 mm3 stykker til dissociation i et 60 mm fad med 5 ml CCM(-). Derefter, efter at have fulgt trin 2.2.4.-2.2.8., injiceres de disassocierede celler i nye C57BL/6J-mus til in vivo-passering efter trin 5.3. eller opbevares som in vitro-organoidkultur efter trin 3.4.-3.6. eller fryses direkte i flydende nitrogen ved hjælp af 90% trækulsstribbet FBS og 10% DMSO med 10 μM frisk Y-27632.
  4. Om nødvendigt genvindes de frosne celler ved at optø dem hurtigt i et 37 °C vandbad og vaske med CCM(-). Herefter resuspend dem i 100 μL 50% matrixekstrakt i DPBS til direkte injektion i mus til in vivo tumordannelse. Brug mindst 2 x 106 optøede celler til en in vivo-injektion .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Arbejdsgangen for adenovirus-Cre-medierede gendeletninger i museurtelceller er vist i figur 1A. Den ledsagende video viser, hvordan urothelcellerne adskilles fra blærens fundus, og hvordan de tredobbelte floxerede celler transduceres ex vivo med Ad5CMVCre. Figur 1A viste, at minimale submucosa og muskelceller blev adskilt efter enzymfordøjelsen. For at bekræfte effektiviteten af adenovirus-Cre-levering blev disassocierede urotelceller fra tredobbelt floxede mus med membranmålrettet tdTomato/membranlokaliseret forbedret grønt fluorescerende protein (mT/mG) transduceret med adenovirus Cre. Grønt fluorescerende protein (GFP) blev påvist i næsten 100% af cellerne, hvilket indikerer høj effektivitet af adenovirustransduktion (figur 1B).

De stabile TKO-organoider blev etableret efter standard organoidprotokoller (in vitro med mere end 5 passager; Figur 2A). H&E og immunofluorescens (IF) af in vitro-organoidsektioner (figur 2A) viste en morfologi af højkvalitets urothelial carcinom med positiv ekspression af urothelial afstamningsmarkører CK5 og p6311. PCR-analyse afslørede rekombinerede alleler i TKO-organoiderne, mens urekombinerede floxede alleler kun blev påvist i urothelceller ubehandlet med adenovirus (figur 2B). I alt 2 x 106 primære ex vivo-organoider blev injiceret i C57BL/6J til indledende subkutan (SQ) tumordannelse efter 8 uger. Derefter blev SQ tumor (passage 1) opsamlet og passeret i mus. Generelt var der brug for 2-3 uger for at danne en 2 cm SQ tumor (passager 2-5) (figur 2C). Immunhistokemien (IHC) af TKO in vivo xenograft viste positiv ekspression af CK7 (ujævn), CK5 og p63 og negativ ekspression af CK8 og Uroplakin 3 (figur 2D). For at detektere forurening af mesenkymceller blev TKO-tumorerne farvet til vimentin. H & E-plet viste tumoren til venstre og kapslen til højre afgrænset af den gule linje. Positiv vimentin blev kun påvist i tumorkapslen eller stroma (figur 2E).

Figure 1
Figur 1: Adenovirus-Cre medierede gendeletninger i museurtelceller med loxP-steder . (A) Arbejdsgangen for TKO-organoidgenerering via ex vivo adenovirus Ad5CMVCre. En kortvarig 30 minutters enzymfordøjelse var tilstrækkelig til at adskille urothelceller fra den underliggende submucosa og muscularis propria. De disassocierede urotelceller blev transduceret med Ad5CMVCre for TKO-organoider og efterfølgende injiceret i C57BL/6J-mus. (B) Tredobbelt floxede urotelceller med mT/mG (konstitutiv transgen ekspression af rødt fluorescerende protein, der omdannes til grønt fluorescerende protein efter Cre-rekombination) blev transduceret med Ad5CMVCre. Næsten 100% af cellerne var GFP-positive, hvilket indikerer meget effektiv transduktion og Cre-rekombination. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Karakterisering af TKO-organoider via ex vivo adenovirus-Cre-rekombinase. (A) De disassocierede Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f urotelceller blev transduceret med adenovirus (Ad5CMVCre) for at generere TKO-organoider (lyst felt). TKO-organoiderne blev indlejret med prøvebehandlingsgel og farvet til H & E og immunofluorescens. (B) Genomisk DNA blev ekstraheret fra tredobbelt floxerede urotelceller (bane 2) og TKO-organoider (bane 4) og amplificeret ved PCR til påvisning af floxerede alleler eller Cre-rekombinerede alleler i Trp53, Rb1 og Pten. PCR-bånd blev farvet med ethidiumbromid. Bane 1 og bane 3 var negative og positive rekombinerede kontroller. (C) En brutto TKO SQ-tumor (passage 4) blev vist på dag 17 efter SQ-injektion. (D) Tumorvævssektioner fra TKO SQ xenografts blev farvet med H & E, IF (CK5, CK8) eller IHC (CK7, p63, Upk3). Forkortelser: CK5 = Cytokeratin 5; CK20 = Cytokeratin 20; CK8 = Cytokeratin 8; CK7 = Cytokeratin 7; Upk3 = Uroplakin III. (E) Tumorvævssektioner fra TKO SQ xenografts blev farvet med H&E og IF (vimentin). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GEMM'er har været guldstandarderne for kræftmodellering initieret fra normale celler, hvilket gør det muligt at teste konsekvenserne af potentielle onkogene forstyrrelser (onkogenaktivering og / eller tab af tumorsuppressorer) grundigt. Her tilvejebringes en hurtig og effektiv protokol til at generere blærekræftorganoider via ex vivo-genredigering af normale museurtelceller, der bærer floxede alleler i gener af interesse. H & E og IHC farvning viser, at TKO-organoider udviser histologi i overensstemmelse med højkvalitets urothelial urothelium, med pladedifferentiering og en basallignende undertype både som in vitro-organoider og som in vivo xenografts. TKO-organoiderne kan bruges in vitro til at studere virkningerne af Trp53-, Rb1- og Pten-tab, lægemiddelscreening og molekylær vurdering af signalveje. Hurtig tumordannelse i C57BL/6J-mus vil muliggøre in vivo-studier designet til at evaluere behandlingsresponser på systemiske terapier som kemoterapi eller immunterapi.

Urothelet består af et lag af basalceller (positive for CK5 og p63), 1-2 lag mellemceller (Uroplakins og p63 positive) og paraplyceller (Uroplakins, CK8 og CK20 positive)6. Et kritisk trin i metoden er den begrænsede tid (30 min) af vævsadskævning i stedet for en langvarig (4 timers) enzymfordøjelse, hvilket muliggør minimal forurening af ikke-uroteliale submucosaceller (figur 1A). En længere disassociationstid kan øge procentdelen af stromale celler, såsom endotelceller og fibroblastceller. Ex vivo-transduktionstrinnet for adenovirus er yderst effektivt. Efter ex vivo adenovirus Cre-transduktion blev GFP visualiseret i næsten 100% af urotelcellerne med mT/mG-reporteralleler (figur 1B).

Der er begrænsninger for ex vivo-metoden. For det første er de disassocierede celler ikke forvalgt før adenovirustransduktion. For eksempel er celler ikke differentieret for urotelceller vs. ikke-urothelceller eller luminale celler vs. basale celler. Cellesortering med EpCAM og/eller CD49f kan anvendes til at sortere rene epitelceller og/eller stamceller før ex vivo-transduktion 12,13. For det andet er adenoviruset, der driver Cre-ekspression med CMV-promotor, der anvendes i denne protokol, målrettet mod en bred vifte af celletyper efter vævssammensværelse (urothelial vs. ikke-urothelial, basal vs. luminalceller). Denne uspecifikke målretning kan føre til en selektionsbias, der forårsager overvækst af celler med det mest onkogene potentiale. Celletypespecifikke adenovirusvektorer er blevet anvendt topisk i både lungekræft og blærekræft GEMM'er 14,15,16,17. Fremtidige undersøgelser, der anvender ex vivo-celletypespecifikt adenovirus (adenovirus med en CK8-promotor eller en CK5-promotor) kan behandle oprindelsescellespørgsmål om, hvorvidt TKO-organoiderne er afledt af basale eller luminale celler18. CK20 eller Upk2 promotor-specifik adenovirus (ikke tilgængelig for vores viden) kan også designes til at transducere paraplyceller i urothelium. Fremtidige undersøgelser er imidlertid nødvendige for at undersøge effektiviteten og specificiteten af disse promotorspecifikke adenovirus for ex vivo blæreinfektion. Der kan være en uoverensstemmelse i adenovirus-Cre-effektiviteten mellem in vivo- og ex vivo-transduktion på grund af værtsmiljøet18. For det tredje er ex vivo-metoden begrænset af manglen på tumormiljø, hvilket kan påvirke in vivo-tumorgenesen og histomorfologien. På trods af disse begrænsninger er en stor fordel ved ex vivo-metoden den hurtige arbejdsgang (1-2 uger i stedet for mange års museavl). Den anden fordel ved ex vivo-tilgangen er, at adenovirus-Cre (Ad5CMVCre) er kommercielt tilgængelig, ligetil og næsten 100% effektiv til viral transduktion og Cre-rekombination (figur 1B). I modsætning hertil kræver alternative ex vivo-metoder, der bruger CRISPR-redigering eller lentiviral transduktion, yderligere klonudvælgelse på grund af mindre effektiv genomisk redigering 5,13,19,20.

Sammenfattende er den beskrevne ex vivo adenovirus-tilgang praktisk, hurtig og effektiv til at generere blærekræftmodeller ved hjælp af enhver kombination af gener af interesse (floxed alleler) relateret til human blærekræft. Disse modeller kan kombineres med celletypespecifik adenovirus og cellesortering for at imødegå oprindelsescellens indvirkning på blærekræftfænotypen og for at evaluere behandlingsresponser på immunterapier i en indstilling af definerede genetiske mutationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette forskningsarbejde blev delvist støttet af NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 og R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation og Friends of Urology Foundation. Vi takker Marisa Blask og Mila Pakhomova for korrekturlæsning af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 μm sterile cell strainer Corning 431752
1 mL syringe BD 309659
25G 1.5 inches needle EXELINT International 26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) UI Viral Vector Core VVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6J Jackson Lab 000664
Charcoal-stripped FBS Gibco A3382101
Collagenase/hyaluronidase Stemcell Technologies 07912
Dispase Stemcell Technologies 07913
DPBS, 1x Corning 21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX) Gibco 35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth medium Lonza CC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) Corning CB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20 DAKO M7019 IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7 Santa Cruz Biotechnology SC-23876 IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63 Abcam ab735 IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3 Fitzgerald 10R-U103A IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-Vimentin Santa Cruz Biotechnology SC-6260 IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I-s IF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubator Thermo Fisher 51033557
Polyclonal chicken anti-CK5 Biolegend 905901 IF 1:500
Primocin InvivoGen ant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) Thermo Fisher 12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575 VWR 35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel) Thermo Fisher HG-4000-012
Surgical blade size 10 Integra Miltex 4-110
Sorvall Legend RT Thermo Fisher 75004377
Sorvall T1 centrifuge Thermo Fisher 75002383
Y-27632 Selleckchem S1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
  2. Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
  3. DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
  4. Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
  5. Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
  6. Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
  7. Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
  8. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  9. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  10. Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
  11. Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
  12. Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
  13. Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
  14. Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
  15. Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
  16. Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
  17. Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
  18. Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).
  19. Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
  20. Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).

Tags

Kræftforskning nummer 183
<em>Ex Vivo</em> Organoidmodel af adenovirus-cre-medierede gendeletninger i museurtelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, D., Wang, L., Wieczorek, K.,… More

Xu, D., Wang, L., Wieczorek, K., Wang, Y., Zhang, X., Goodrich, D. W., Li, Q. Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells. J. Vis. Exp. (183), e63855, doi:10.3791/63855 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter