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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Ex vivo Organoid-Modell von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63855
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1,2
1Department of Urology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, Roswell Park Comprehensive Cancer Center

Summary

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Erzeugung und Charakterisierung von Urothelorganoiden der Maus, die Deletionen in interessanten Genen beherbergen. Die Methoden umfassen die Gewinnung von Maus-Urothelzellen, die Ex-vivo-Transduktion mit Adenovirus-treibender Cre-Expression mit einem CMV-Promotor sowie die In-vitro- sowie In-vivo-Charakterisierung.

Abstract

Blasenkrebs ist ein wenig untersuchter Bereich, insbesondere in gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs). Inzucht-GEMMs mit gewebespezifischen Cre- und loxP-Stellen waren die Goldstandards für bedingtes oder induzierbares Gen-Targeting. Um schnellere und effizientere experimentelle Modelle zu liefern, wird ein Ex-vivo-Organoid-Kultursystem entwickelt, das das Adenovirus Cre und normale Urothelzellen verwendet, die mehrere loxP-Allele der Tumorsuppressoren Trp53, Pten und Rb1 tragen. Normale Urothelzellen sind enzymatisch von vier Blasen dreifach floxierter Mäuse getrennt (Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f). Die Urothelzellen werden ex vivo mit Adenovirus-Cre transduziert, das von einem CMV-Promotor (Ad5CMVCre) angetrieben wird. Die transduzierten Blasenorganoide werden in vitro und in vivo kultiviert, vermehrt und charakterisiert. Die PCR wird verwendet, um Gendeletionen in Trp53, Pten und Rb1 zu bestätigen. Die Immunfluoreszenz-Färbung (IF) von Organoiden zeigt eine positive Expression von Urothellinienmarkern (CK5 und p63). Die Organoide werden subkutan in Wirtsmäuse injiziert, um Tumorexpansion und serielle Passagen zu erhalten. Die Immunhistochemie (IHC) von Xenotransplantaten zeigt eine positive Expression von CK7, CK5 und p63 und eine negative Expression von CK8 und Uroplakin 3. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Adenovirus-vermittelte Gendeletion aus Urothelzellen der Maus, die mit loxP-Stellen manipuliert wurden, eine effiziente Methode ist, um das tumorigene Potenzial definierter genetischer Veränderungen schnell zu testen.

Introduction

Blasenkrebs ist die vierthäufigste Krebsart bei Männern und betrifft jährlich mehr als 80.000 Menschen in den Vereinigten Staaten1. Die platinbasierte Chemotherapie ist seit mehr als drei Jahrzehnten der Standard für Patienten mit fortgeschrittenem Blasenkrebs. Die Landschaft der Blasenkrebsbehandlung wurde durch die jüngste Zulassung der Food and Drug Administration (FDA) für Immuntherapie (Anti-PD-1- und Anti-PD-L1-Immun-Checkpoint-Inhibitoren), Erdafitinib (ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Inhibitor) und Enfortumab-Vedotin (ein Antikörper-Wirkstoff-Konjugat) revolutioniert2,3,4. Es stehen jedoch keine klinisch zugelassenen Biomarker zur Verfügung, um das Ansprechen auf eine Chemotherapie oder Immuntherapie vorherzusagen. Es besteht ein dringender Bedarf, informative präklinische Modelle zu erstellen, die das Verständnis der Mechanismen verbessern können, die das Fortschreiten von Blasenkrebs vorantreiben, und prädiktive Biomarker für verschiedene Behandlungsmodalitäten entwickeln können.

Ein großes Hindernis in der blasentranslationalen Forschung ist das Fehlen präklinischer Modelle, die die Pathogenese und das Behandlungsansprechen von menschlichem Blasenkrebs rekapitulieren 5,6. Es wurden mehrere präklinische Modelle entwickelt, darunter In-vitro-2D-Modelle (Zelllinien oder bedingt umprogrammierte Zellen), In-vitro-3D-Modelle (Organoide, 3D-Druck) und In-vivo-Modelle (Xenotransplantat, karzinogeninduzierte, gentechnisch veränderte Modelle und von Patienten abgeleitete Xenotransplantate)2,6. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind für viele Anwendungen in der Blasenkrebsbiologie nützlich, einschließlich Analysen von Tumorphänotypen, mechanistischen Untersuchungen von Kandidatengenen und/oder Signalwegen und der präklinischen Bewertung therapeutischer Reaktionen 6,7. GEMMs können standortspezifische Rekombinasen (Cre-loxP) verwenden, um genetische Deletionen in einem oder mehreren Tumorsuppressorgenen zu kontrollieren. Der Prozess der Erzeugung gewünschter GEMMs mit mehreren Gendeletionen ist zeitaufwendig, mühsam und teuer5. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Entwicklung einer schnellen und effizienten Methode der Ex-vivo-Cre-Abgabe zur Etablierung von Blasen-Triple-Knockout-Modellen (TKO) aus normalen Maus-Urothelzellen, die dreifach floxierte Allele (Trp53, Pten und Rb1) tragen8. Der große Vorteil der Ex-vivo-Methode ist der schnelle Workflow (1-2 Wochen statt jahrelanger Mauszucht). Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für die Ernte normaler Urothelzellen mit floxierten Allelen, ex vivo Adenovirus-Transduktion, Organoidkulturen und in vitro und in vivo Charakterisierung bei immunkompetenten C57 BL/6J Mäusen. Diese Methode kann weiter verwendet werden, um klinisch relevante Blasenkrebs-Organoide in immunkompetenten Mäusen zu erzeugen, die eine beliebige Kombination von floxierten Allelen beherbergen.

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Protocol

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY, genehmigt (1395M, Biosafety 180501 und 180502).
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 1 bis 3 am selben Tag aus.

1. Sezierung der Mausblase

  1. Vorbereitung für die Dissektion
    1. Bereiten Sie alle sterilen Instrumente einschließlich Schere, Pinzette, sterile DPBS in 35-mm-Kulturgeschirr, 70% Ethanol, sterile Gaze und saubere Papiertücher vor. Reinigen Sie alle Oberflächen des Sezierbereichs. Erzeugen Sie männliche dreifach floxierte Mäuse Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f (4 Mäuse, 10 Wochen alt), wie zuvor in Dr. Goodrichs Labor 8 beschrieben.
  2. Euthanasie und Schnitt
    1. Euthanasie die Mäuse durch CO 2 -Erstickung mit einer Durchflussrate von2,0 l / min, gefolgt von zervikaler Dislokation. Reinigen Sie den Sezierbereich mit 70% Ethanol und bedecken Sie ihn mit einem sauberen Papiertuch.
    2. Legen Sie die Maus auf Gaze im Dissektionsbereich. Sprühen Sie 70% Ethanol auf den Bauch der Maus und verwenden Sie eine sterile Dissektionsschere, um einen Bauchschnitt in der unteren Mittellinie zu machen, der die Blase freilegt.
  3. Sezieren der Blase
    1. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Blase zu greifen und ziehen Sie sie vorsichtig hoch, so dass bilaterale ureterovesische Verbindungen identifiziert werden. Verwenden Sie eine Schere, um den Blasenfundus entlang der Grenzlinie zwischen den beiden Harnleiteröffnungen zu entfernen.
    2. Geben Sie die Blase in eine sterile Schale mit 2 ml DPBS. Entfernen Sie Fett- und Bindegewebe und geben Sie die Blase in eine neue Schale mit sterilen 2 ml DPBS. Nehmen Sie zu diesem Zeitpunkt das Adenovirus aus der Lagerung von -80 ° C heraus und halten Sie es auf Eis.

2. Dissoziation von Urothelzellen

  1. Vorbereitung für die Zelldissoziation
    1. Bereiten Sie alle sterilen Instrumente vor, einschließlich Pinzetten, chirurgische Skalpelle (eine Klinge der Größe 10 mit Griff), sterile DPBS in 35-mm-Kulturschalen, vollständiges Kulturmedium ohne kohleentripptes FBS, definiert als CCM (-), Kollagenase/Hyaluronidase-Gemisch, rekombinantes Enzym für Trypsinersatz, 10% kohleentkleidetes FBS in DPBS mit 10 μM frischem Y-27632, ein 100 μm steriles Zellsieb und ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Das komplette Kulturmedium (CCM) umfasst das Wachstumsmedium der Brustepithelzellen, ergänzt mit den bereitgestellten Wachstumsfaktoren und 5% holzkohle-gestreiftes FBS, 1% L-Glutaminersatz, 100 μg/ml Primocin und 10 μM frisches Y-27632.
  2. Hacken und Verdauen der Blase
    1. Übertragen und waschen Sie die Blase erneut mit 2 ml sterilem DPBS in einer 35-mm-Schale in einer Biosicherheitswerkbank.
    2. Sammeln Sie Blasengewebe von vier Mäusen in einer Schale mit 1 ml CCM (-) und zerkleinern Sie jede Blase mit einer chirurgischen Klinge in vier gleiche Stücke. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Blase zu entfalten, um die Urotheloberfläche dem Medium auszusetzen.
    3. Die Blasenstücke und das Medium in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen geben. Waschen Sie die Schale mit 2 mL CCM(-) 2x und sammeln Sie sie in einem Zentrifugenröhrchen auf ein Gesamtvolumen von 5 ml.
    4. Kollagenase/Hyaluronidase-Gemisch zu einer Endkonzentration von 300 U/ml Kollagenase und 100 U/ml Hyaluronidase hinzufügen und das Rohr horizontal in einen 37 °C Orbital-Inkubationsschüttler für 30 min bei 200 U/min geben.
    5. Nach der Gewebeverdauung ein gleiches Volumen (5 ml) von 10% Holzkohle-gestreiftem FBS in DPBS in das Röhrchen geben und das Röhrchen bei 200 x g für 5 min zentrifugieren.
    6. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand. 2 ml Trypsinersatz in das Zellpellet geben und gut mischen. Legen Sie das Rohr in einen Zellinkubator bei 37 °C und 5% CO2 für 4 min.
    7. Nach der Inkubation 10x mit einer Standard-P1000-Spitze auf und ab pipettieren. Fügen Sie 5 ml 10% kohleentripptes FBS in DPBS hinzu.
    8. Belasten Sie die dissoziierten Zellen durch ein 100 μm steriles Zellsieb. Zellsuspension und Zentrifuge bei 200 x g für 5 min sammeln.
  3. Zählen und Resuspendieren von Zellen
    1. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand. Resuspendiert das Zellpellet mit 1 ml CCM.
    2. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und nur die Platte 0,5 x 106 Zellen in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 0,5 ml frischem CCM. Nehmen Sie zu diesem Zeitpunkt die Matrixextrakte der Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkomzellen (siehe Materialtabelle) aus -20 °C Lagerung heraus und tauen Sie auf Eis auf. Vorwärmen Sie eine 6-Well-Platte in einem 37 °C Zellinkubator.
      HINWEIS: Die verbleibenden Zellen können zentrifugiert und als Zellpellets für die Nicht-Virus-Transduktionskontrolle eingefroren werden.

3. Adenovirale Transduktions- und Beschichtungsorganoide

ACHTUNG: Bitte seien Sie vorsichtig bei der Verarbeitung von Adenovirus. Das Laborpersonal sollte die Praktiken der Biosicherheitsstufe 2 befolgen und das Adenovirus mit 10% Bleichmittel desinfizieren.

  1. 2 μL Adenovirus (Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU/μL) in die 24-Well-Platte geben. Mischen Sie sich gut mit den dissoziierten Urothelzellen.
  2. Um die Transduktionseffizienz zu erhöhen, führen Sie die Spinokulation durch, indem Sie die 24-Well-Platte bei 300 x g für 30 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Legen Sie die 24-Well-Platte in einen Zellinkubator bei 37 °C und 5% CO2 für 1 h.
  3. Überführen Sie Zellen und Medium aus dem Bohrloch in ein 15-ml-Röhrchen und eine Zentrifuge bei 200 x g für 5 min. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 50 μL CCM hinzu und mischen Sie gut mit den Zellen am Boden.
  4. Fügen Sie 140 μL Matrixextrakt hinzu und mischen Sie vorsichtig gut, um Luftblasen zu vermeiden. Fügen Sie die Lösung schnell in die vorgewärmte 6-Well-Platte bei 50 μL / Dome hinzu, um Kuppeln für Organoide zu erstellen.
  5. Die Platte vorsichtig in einen 37 °C Inkubator mit 5% CO 2 geben und dieKuppeln 5 min erstarren lassen. Drehen Sie die 6-Well-Platte auf den Kopf und setzen Sie die Erstarrung für weitere 25 Minuten fort.
  6. Nach der Inkubation fügen Sie 2,5 ml CCM zu jeder Vertiefung hinzu und legen Sie die Platte in einen Inkubator für Organoidkulturen.

4. Organoidkultivierung und -passage

  1. Wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage. Führen Sie Organoidkultivierung, Passaging und Einfrieren durch, wie in Lee et al.9 beschrieben. Einbettung von Organoiden unter Verwendung von Probenverarbeitungsgel, wie in Fujii et al.10 beschrieben.
  2. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml Dispase zu jeder Vertiefung hinzu. Brechen Sie die Kuppel vorsichtig und mischen Sie gut mit einer P1000 Pipettenspitze.
  3. Legen Sie die Platte in einen 37 °C Inkubator mit 5% CO2 für 30 min. Sammeln Sie dann alle Zellen in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie das Bohrloch mit 4 ml 10% holzkohleabgestreiftem FBS in DPBS. Wenn die Organoidzellen als große Cluster angezeigt werden, führen Sie Schritt 2.2.6 aus. und Schritt 2.2.7. , um getrennte Zellen zu erhalten.
  4. Zentrieren Sie das Rohr bei 200 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 1 ml CCM.
  5. Suspendieren Sie die Zellen in 70% Matrixextrakt und folgen Sie den Schritten 3.4.-3.6. für den Anbau. Alternativ können die Zellen kryokonserviert werden, indem sie in 90% mit Holzkohle abgestreiftes FBS und 10% DMSO resuspendiert werden, ergänzt mit 10 μM frischem Y-27632.

5. Organoide Zellen Implantation in C57BL/6J Maus subkutan

  1. Vorbereitung für die Implantation
    1. Bereiten Sie 25G 1,5 in Nadeln, eine 1 ml Spritze, 1 mg / ml Dispase, Matrixextrakt, 10% holzkohleentripptes FBS in DPBS mit 10 μM frischem Y-27632 und ein 15 ml Zentrifugenröhrchen vor.
  2. Organoide Zellsammlung
    1. Nachdem Sie eine stabile Kultur für mindestens 5 Passagen erreicht haben, sammeln Sie die expandierten Organoidzellen für die In-vivo-Injektion . Befolgen Sie die Schritte 4.2.-4.4. und resuspendieren Zellen in 1 ml CCM.
  3. Zählen von Zellen und subkutane Injektion
    1. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer. Nach der Zentrifugation bei 200 x g für 5 min 2 x10 6 Zellen in 100 μL 50% Matrixextrakt in DPBS resuspendiert. Stellen Sie die Aufhängung auf Eis und bringen Sie sie in eine Biosicherheitskabine in einem Tierbehandlungsraum.
    2. Anästhesieren Sie zwei männliche C57BL/6J-Mäuse (10 Wochen alt) mit 4% Isofluran und 1 L/minO2-Fluss für ca. 4 min in einer Kammer. Sobald die Mäuse ihren Aufrichtenden Reflex verloren haben und ihr Atemmuster tiefer und langsamer geworden ist, übertragen Sie die Mäuse in einen nicht atmungsaktiven Kreislauf mit 2% Isofluran und 1 l / min O2-Fluss . Tragen Sie Tierarztsalbe auf, um die Augen der Tiere vor traumatischen Verletzungen zu schützen.
    3. Rasieren Sie einen Bereich um die Injektionsstelle an der rechten Flanke der Maus und verwenden Sie 70% Ethanol zur Reinigung, und verwenden Sie dann eine 25-G-Nadel, um die 100-μL-Zellsuspension unter Narkose direkt in die rechte Flanke zu injizieren.
    4. Entfernen Sie nach der Injektion die Inhalationsanästhesie und legen Sie die Mäuse in einen Käfig unter einer Wärmelampe, bis sie sich erholt und vollständig mobilisiert haben. Geben Sie die Mäuse zur Unterbringung zurück und überwachen Sie die Tumorbildung.

6. Tumorentnahme und In-vivo-Vermehrung

  1. Befolgen Sie den Vorbereitungsschritt 2.1.1. Euthanasthanisieren Sie Mäuse durch CO 2-Asphyxie mit einer Durchflussrate von 2,0 l / min, gefolgt von zervikaler Dislokation, nachdem ein Tumor von ~ 2,0 cm Durchmesser (fast2-3 Wochen) gebildet wurde. Übertragen Sie die Mäuse in einen sauberen Dissektionsbereich, sprühen Sie 70% Ethanol auf den Tumorbereich der Mausflanke und verwenden Sie sterile Dissektionsscheren und Pinzetten, um einen Schnitt zu machen, um den Tumor zu trennen.
  2. Waschen Sie den Tumor in einer 60-mm-Schale mit 5 ml DPBS und entfernen Sie mit einer Schere das Bindegewebe. Schneiden Sie ein Stück des frischen Tumors und senken Sie es mit 4% Paraformaldehyd in DPBS für 48 h und senden Sie es zur Paraffineinbettung und -sektion für die histologische Analyse.
  3. Verarbeiten Sie die andere Hälfte des frischen Tumors zur Zelldissoziation. Kurz den frischen Tumor in 1 mm3 Stück zur Dissoziation in einer 60 mm Schale mit 5 ml CCM (-) zerkleinern. Injizieren Sie dann, nachdem Sie die Schritte 2.2.4.-2.2.8. ausgeführt haben, die dissoziierten Zellen in neue C57BL/6J-Mäuse für die In-vivo-Übertragung gemäß Schritt 5.3. oder als In-vitro-Organoidkultur gemäß den Schritten 3.4.-3.6. aufbewahren oder direkt in flüssigem Stickstoff mit 90% mit Holzkohle-entkleidetem FBS und 10% DMSO mit 10 μM frischem Y-27632 einfrieren.
  4. Bei Bedarf die gefrorenen Zellen wiederherstellen, indem Sie sie in einem 37 ° C warmen Wasserbad schnell auftauen und mit CCM(-) waschen. Danach resuspendieren Sie sie in 100 μL 50% Matrixextrakt in DPBS zur direkten Injektion in Mäuse zur In-vivo-Tumorbildung. Verwenden Sie mindestens 2 x 10 6 aufgetaute Zellen für eine In-vivo-Injektion.

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Representative Results

Der Arbeitsablauf von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus ist in Abbildung 1A dargestellt. Das dazugehörige Video zeigt, wie die Urothelzellen vom Fundus der Blase getrennt werden und wie die dreifach floxierten Zellen ex vivo mit Ad5CMVCre transduziert werden. Abbildung 1A zeigte, dass minimale Submukosen und Muskelzellen nach der Enzymverdauung dissoziiert wurden. Um die Effizienz der Adenovirus-Cre-Abgabe zu bestätigen, wurden dissoziierte Urothelzellen von dreifach floxierten Mäusen mit membrangerichtetem tdTomato/membranlokalisiertem Enhanced Green Fluorescent Protein (mT/mG) mit Adenovirus Cre transduziert. Grün fluoreszierendes Protein (GFP) wurde in fast 100% der Zellen nachgewiesen, was auf eine hohe Effizienz der Adenovirus-Transduktion hinweist (Abbildung 1B).

Die stabilen TKO-Organoide wurden nach Standard-Organoidprotokollen (in vitro mit mehr als 5 Passagen; Abbildung 2A). H&E und Immunfluoreszenz (IF) von In-vitro-Organoidschnitten (Abbildung 2A) zeigten eine Morphologie hochgradiger Urothelkarzinome mit positiver Expression der Urothellinienmarker CK5 und p6311. Die PCR-Analyse ergab rekombinierte Allele in den TKO-Organoiden, während nicht rekombinierte floxierte Allele nur in Urothelzellen nachgewiesen wurden, die nicht mit Adenovirus behandelt wurden (Abbildung 2B). Insgesamt wurden 2 x 106 primäre Ex-vivo-Organoide in C57BL/6J für die anfängliche subkutane (SQ) Tumorbildung in 8 Wochen injiziert. Dann wurde der SQ-Tumor (Passage 1) gesammelt und in Mäusen durchgelassen. Im Allgemeinen wurden 2-3 Wochen benötigt, um einen 2 cm großen SQ-Tumor (Passagen 2-5) zu bilden (Abbildung 2C). Die Immunhistochemie (IHC) von TKO in vivo Xenotransplantat zeigte eine positive Expression von CK7 (patchy), CK5 und p63 und eine negative Expression von CK8 und Uroplakin 3 (Abbildung 2D). Um eine Kontamination von Mesenchymzellen nachzuweisen, wurden die TKO-Tumoren auf Vimentin gefärbt. Der H & E-Fleck zeigte den Tumor auf der linken Seite und die Kapsel auf der rechten Seite, die durch die gelbe Linie abgegrenzt waren. Positives Vimentin wurde nur in der Tumorkapsel oder im Stroma nachgewiesen (Abbildung 2E).

Figure 1
Abbildung 1: Adenovirus-Cre vermittelte Gendeletionen in Urothelzellen der Maus mit loxP-Stellen . (A) Der Workflow der TKO-Organoid-Generierung über ex vivo Adenovirus Ad5CMVCre. Eine kurzzeitige 30-minütige Enzymverdauung reichte aus, um Urothelzellen von der darunter liegenden Submukosa und Muscularis propria zu trennen. Die dissoziierten Urothelzellen wurden mit Ad5CMVCre für TKO-Organoide transduziert und anschließend in C57BL/6J-Mäuse injiziert. (B) Dreifach geloxte Urothelzellen mit mT/mG (konstitutive Transgenexpression von rot fluoreszierendem Protein, das nach Cre-Rekombination in grün fluoreszierendes Protein umgewandelt wird) wurden mit Ad5CMVCre transduziert. Fast 100% der Zellen waren GFP-positiv, was auf eine hocheffiziente Transduktion und Cre-Rekombination hinweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Charakterisierung von TKO-Organoiden mittels ex vivo Adenovirus-Cre-Rekombinase. (A) Die dissoziierten Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f Urothelzellen wurden mit Adenovirus (Ad5CMVCre) transduziert, um TKO-Organoide (helles Feld) zu erzeugen. Die TKO-Organoide wurden mit Speciment-Processing-Gel eingebettet und für H & E und Immunfluoreszenz gefärbt. (B) Genomische DNA wurde aus dreifach floxierten Urothelzellen (Lane 2) und TKO-Organoiden (Lane 4) extrahiert und durch PCR amplifiziert, um floxierte Allele oder Cre-rekombinierte Allele der Trp53, Rb1 und Pten nachzuweisen. PCR-Bänder wurden mit Ethidiumbromid gefärbt. Bahn 1 und Bahn 3 waren negative und positiv rekombinierte Kontrollen. (C) Ein grober TKO SQ-Tumor (Passage 4) wurde am Tag 17 nach der SQ-Injektion gezeigt. (D) Tumorgewebeschnitte aus den TKO SQ-Xenotransplantaten wurden mit H&E, IF (CK5, CK8) oder IHC (CK7, p63, Upk3) gefärbt. Abkürzungen: CK5 = Cytokeratin 5; CK20 = Cytokeratin 20; CK8 = Cytokeratin 8; CK7 = Cytokeratin 7; Upk3 = Uroplakin III. (E) Tumorgewebeschnitte aus den TKO SQ-Xenotransplantaten wurden mit H&E und IF (Vimentin) gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

GEMMs waren die Goldstandards für die Krebsmodellierung, die von normalen Zellen initiiert wurde, so dass die Folgen potenzieller onkogener Störungen (Onkogenaktivierung und / oder Verlust von Tumorsuppressoren) rigoros getestet werden konnten. Hier wird ein schnelles und effizientes Protokoll bereitgestellt, um Blasenkrebs-Organoide durch Ex-vivo-Gen-Editing von normalen Maus-Urothelzellen, die floxierte Allele in interessanten Genen tragen, zu erzeugen. H&E- und IHC-Färbungen zeigen, dass TKO-Organoide eine Histologie aufweisen, die mit hochgradigem Urothel-Urothel übereinstimmt, mit Plattenepitheldifferenzierung und einem basal-ähnlichen Subtyp sowohl als In-vitro-Organoide als auch als In-vivo-Xenotransplantate. Die TKO-Organoide können in vitro zur Untersuchung der Auswirkungen von Trp53-, Rb1- und Pten-Verlust, zum Wirkstoffscreening und zur molekularen Bewertung von Signalwegen verwendet werden. Die schnelle Tumorbildung bei C57BL/6J-Mäusen ermöglicht In-vivo-Studien zur Bewertung des Behandlungsansprechens auf systemische Therapien wie Chemotherapie oder Immuntherapie.

Das Urothel besteht aus einer Schicht von Basalzellen (positiv für CK5 und p63), 1-2 Schichten von Zwischenzellen (Uroplakins und p63 positiv) und Schirmzellen (Uroplakins, CK8 und CK20 positiv)6. Ein kritischer Schritt in der Methode ist die begrenzte Zeit (30 min) der Gewebedissoziation anstelle einer längeren (4 Stunden) Enzymverdauung, die eine minimale Kontamination von nicht-urothelialen Submukosazellen ermöglicht (Abbildung 1A). Eine längere Dissoziationszeit kann den Prozentsatz von Stromazellen wie Endothelzellen und Fibroblastenzellen erhöhen. Der Ex-vivo-Transduktionsschritt des Adenovirus ist hochwirksam. Nach der Ex-vivo-Adenovirus-Cre-Transduktion wurde GFP in fast 100% der Urothelzellen mit mT/mG-Reporterallelen sichtbar gemacht (Abbildung 1B).

Die Ex-vivo-Methode hat Einschränkungen. Erstens werden die dissoziierten Zellen vor der Adenovirus-Transduktion nicht vorselektiert. Zum Beispiel werden Zellen nicht nach Urothelzellen vs. Nicht-Urothelzellen oder Luminalzellen vs. Basalzellen differenziert. Die Zellsortierung mit EpCAM und/oder CD49f kann verwendet werden, um reine Epithelzellen und/oder Stammzellen vor der Ex-vivo-Transduktion zu sortieren 12,13. Zweitens zielt die in diesem Protokoll verwendete Adenovirus-treibende Cre-Expression mit CMV-Promotor auf eine breite Palette von Zelltypen nach Gewebedissoziation ab (Urothel- vs. Nicht-Urothel-, Basal- vs. Luminalzellen). Dieses unspezifische Targeting kann zu einer Selektionsverzerrung führen, die zu einem Überwachsen von Zellen mit dem onkogensten Potenzial führt. Zelltypspezifische Adenovirus-Vektoren wurden topisch sowohl bei Lungenkrebs als auch bei Blasenkrebs GEMMs14,15,16,17 eingesetzt. Zukünftige Studien mit Ex-vivo-Zelltyp-spezifischem Adenovirus (Adenovirus mit einem CK8-Promotor oder einem CK5-Promotor) könnten Ursprungszellenfragen beantworten, ob die TKO-Organoide aus basalen oder luminalen Zellen stammen18. Das CK20- oder Upk2-Promotor-spezifische Adenovirus (unseres Wissens nicht verfügbar) kann auch so konzipiert werden, dass es Schirmzellen im Urothel transduziert. Zukünftige Studien sind jedoch erforderlich, um die Effizienz und Spezifität dieser promotorspezifischen Adenoviren für Ex-vivo-Blaseninfektionen zu untersuchen. Aufgrund der Wirtsumgebung kann es zu einer Diskrepanz in der Adenovirus-Cre-Effizienz zwischen In-vivo- und Ex-vivo-Transduktion kommen 18. Drittens ist die Ex-vivo-Methode durch das Fehlen einer Tumorumgebung begrenzt, die sich auf die In-vivo-Tumorgenese und Histomorphologie auswirken kann. Trotz dieser Einschränkungen ist ein großer Vorteil der Ex-vivo-Methode der schnelle Workflow (1-2 Wochen statt jahrelanger Mauszucht). Der zweite Vorteil des Ex-vivo-Ansatzes besteht darin, dass Adenovirus-Cre (Ad5CMVCre) kommerziell erhältlich, unkompliziert und nahezu 100% effizient für die virale Transduktion und Cre-Rekombination ist (Abbildung 1B). Im Gegensatz dazu erfordern alternative Ex-vivo-Methoden mit CRISPR-Editierung oder lentiviraler Transduktion eine weitere Klonselektion aufgrund der weniger effizienten genomischen Editierung 5,13,19,20.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der beschriebene Ex-vivo-Adenovirus-Ansatz bequem, schnell und effizient bei der Generierung von Blasenkrebsmodellen ist, die eine beliebige Kombination von Genen von Interesse (floxierte Allele) im Zusammenhang mit menschlichem Blasenkrebs verwenden. Diese Modelle können mit zelltypspezifischen Adenoviren und Zellsortierungen kombiniert werden, um die Auswirkungen der Ursprungszelle auf den Blasenkrebsphänotyp zu untersuchen und das Ansprechen auf die Behandlung von Immuntherapien in einem Setting definierter genetischer Mutationen zu bewerten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Forschungsarbeit wurde zum Teil von NIH Grants, K08CA252161(Q.L.), R01CA234162 und R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), der Roswell Park Alliance Foundation und der Friends of Urology Foundation unterstützt. Wir danken Marisa Blask und Mila Pakhomova für das Korrekturlesen des Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 μm sterile cell strainer Corning 431752
1 mL syringe BD 309659
25G 1.5 inches needle EXELINT International 26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) UI Viral Vector Core VVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6J Jackson Lab 000664
Charcoal-stripped FBS Gibco A3382101
Collagenase/hyaluronidase Stemcell Technologies 07912
Dispase Stemcell Technologies 07913
DPBS, 1x Corning 21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX) Gibco 35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth medium Lonza CC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) Corning CB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20 DAKO M7019 IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7 Santa Cruz Biotechnology SC-23876 IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63 Abcam ab735 IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3 Fitzgerald 10R-U103A IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-Vimentin Santa Cruz Biotechnology SC-6260 IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I-s IF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubator Thermo Fisher 51033557
Polyclonal chicken anti-CK5 Biolegend 905901 IF 1:500
Primocin InvivoGen ant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) Thermo Fisher 12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575 VWR 35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel) Thermo Fisher HG-4000-012
Surgical blade size 10 Integra Miltex 4-110
Sorvall Legend RT Thermo Fisher 75004377
Sorvall T1 centrifuge Thermo Fisher 75002383
Y-27632 Selleckchem S1049

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Krebsforschung Ausgabe 183
<em>Ex vivo</em> Organoid-Modell von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus
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Xu, D., Wang, L., Wieczorek, K.,… More

Xu, D., Wang, L., Wieczorek, K., Wang, Y., Zhang, X., Goodrich, D. W., Li, Q. Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells. J. Vis. Exp. (183), e63855, doi:10.3791/63855 (2022).

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