Summary
تعد دراسات الميكانيكا الحيوية لجدار الخلية ضرورية لفهم نمو النبات والتشكل. يقترح البروتوكول التالي لدراسة جدران الخلايا الأولية الرقيقة في الأنسجة الداخلية لأعضاء النبات الفتية باستخدام مجهر القوة الذرية.
Abstract
تحدد الخواص الميكانيكية للجدران الخلوية الأولية اتجاه نمو الخلايا النباتية ومعدله، ومن ثم تحديد حجم النبات وشكله في المستقبل. تم تطوير العديد من التقنيات المتطورة لقياس هذه الخصائص. ومع ذلك ، يظل الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) هو الأكثر ملاءمة لدراسة مرونة جدار الخلية على المستوى الخلوي. كان أحد أهم قيود هذه التقنية هو أنه يمكن دراسة الخلايا الحية السطحية أو المعزولة فقط. هنا ، يتم تقديم استخدام مجهر القوة الذرية للتحقيق في الخواص الميكانيكية لجدران الخلايا الأولية التي تنتمي إلى الأنسجة الداخلية لجسم النبات. يصف هذا البروتوكول قياسات معامل يونغ الظاهر لجدران الخلايا في الجذور ، ولكن يمكن أيضا تطبيق الطريقة على أعضاء النبات الأخرى. يتم إجراء القياسات على أقسام مشتقة من الاهتزاز من المواد النباتية في خلية سائلة ، مما يسمح (i) بتجنب استخدام محاليل البلازما أو تشريب العينة بالشمع أو الراتنج ، (ii) جعل التجارب سريعة ، و (iii) منع جفاف العينة. يمكن دراسة كل من جدران الخلايا المضادة للانحناء و periclinal ، اعتمادا على كيفية تقسيم العينة. يمكن التحقيق في الاختلافات في الخواص الميكانيكية للأنسجة المختلفة في قسم واحد. يصف البروتوكول مبادئ تخطيط الدراسة ، والقضايا المتعلقة بإعداد العينات والقياسات ، وكذلك طريقة اختيار منحنيات تشوه القوة لتجنب تأثير التضاريس على القيم التي تم الحصول عليها من معامل المرونة. لا تقتصر الطريقة على حجم العينة ولكنها حساسة لحجم الخلية (أي يصعب فحص الخلايا ذات التجويف الكبير).
Introduction
تحدد الخواص الميكانيكية لجدار الخلية النباتية شكل الخلية وقدرتها على النمو. على سبيل المثال ، يكون الطرف المتنامي لأنبوب حبوب اللقاح أكثر ليونة من الأجزاء غير النامية من نفس الأنبوب1. يسبق تكوين البدائية على مرستيم أرابيدوبسيس انخفاض موضعي في صلابة جدار الخلية في موقع البدائيةالمستقبلية 2,3. جدران الخلايا في Arabidopsis hypocotyl ، الموازية لمحور النمو الرئيسي وتنمو بشكل أسرع ، أكثر ليونة من تلك المتعامدة مع هذا المحور وتنمو بشكل أبطأ 4,5. في جذر الذرة ، كان انتقال الخلايا من الانقسام إلى الاستطالة مصحوبا بانخفاض في الوحدات المرنة في جميع أنسجة الجذر. ظلت الوحدات منخفضة في منطقة الاستطالة وزادت في منطقة الاستطالةالمتأخرة 6.
على الرغم من توفر طرق مختلفة ، نادرا ما تتم مقارنة المصفوفات الكبيرة من المعلومات الكيميائية الحيوية والوراثية حول بيولوجيا جدار الخلية التي يتم الحصول عليها سنويا مع الخواص الميكانيكية لجدران الخلايا. على سبيل المثال ، غالبا ما تكون الطفرات الموجودة على الجينات المرتبطة بجدار الخلية قد غيرت النمو والتطور4،7،8 ، ولكن نادرا ما يتم وصفها من حيث الميكانيكا الحيوية. أحد أسباب ذلك هو صعوبة إجراء القياسات على المستويين الخلوي ودون الخلوي. يعد مجهر القوة الذرية (AFM) حاليا النهج الأساسي لمثل هذه التحليلات9.
في السنوات الأخيرة ، تم إجراء العديد من الدراسات القائمة على AFM حول الميكانيكا الحيوية لجدار الخلية النباتية. تم فحص الخواص الميكانيكية لجدران الخلايا للأنسجة الخارجية ل Arabidopsis2،3،4،5،10،11 والبصل 12 ، وكذلك الخلايا المستزرعة13،14،15. ومع ذلك ، قد تحتوي الخلايا السطحية للنبات على جدران خلوية تختلف خواصها الميكانيكية عن تلك الموجودة في الأنسجة الداخلية6. بالإضافة إلى ذلك ، يتم ضغط الخلايا النباتية بواسطة التورم مما يجعلها أكثر صلابة. للتخلص من تأثير ضغط التورم ، يتعين على الباحثين استخدام محاليل البلازما2،3،4،5،10،11 أو تحلل القيم التي تم الحصول عليها في مساهمات التورم وجدار الخلية 12. يؤدي النهج الأول إلى تجفيف العينة ويغير سمك وخصائص جدار الخلية16 ، بينما يتطلب النهج الثاني قياسات إضافية ورياضيات معقدة ، وينطبق فقط على الخلايا ذات الشكل البسيط نسبيا12. يمكن تقييم خصائص جدار الخلية للأنسجة الداخلية على عمليات التجميد17 أو أقسام من المواد النباتية المشربة بالراتنج8. ومع ذلك ، فإن كلتا الطريقتين تنطوي على الجفاف و / أو التشريب للعينات ، مما يؤدي حتما إلى تغييرات في الخصائص. من الصعب ربط خصائص الخلايا المعزولة أو المستزرعة بفسيولوجيا النبات بأكمله. يمكن أن تؤثر كل من زراعة الخلايا النباتية وعزلها على الخواص الميكانيكية لجدرانها الخلوية.
الطريقة المعروضة هنا تكمل النهج المذكورة أعلاه. باستخدامه ، يمكن فحص جدران الخلايا الأولية لأي نسيج وفي أي مرحلة من مراحل تطور النبات. تم إجراء ملاحظات التقسيم و AFM في السائل الذي يتجنب جفاف العينة. تم حل مشكلة التورم حيث يتم قطع الخلايا. يصف البروتوكول العمل مع جذور الذرة والجاودار ، ولكن يمكن فحص أي عينة أخرى إذا كانت مناسبة لتقسيم الاهتزاز.
تم إجراء دراسات AFM الموصوفة هنا باستخدام تقنية حجم القوة. تستخدم الأدوات المختلفة أسماء مختلفة لهذه الطريقة. ومع ذلك ، فإن المبدأ الأساسي هو نفسه. يتم الحصول على خريطة حجم القوة للعينة عن طريق حركة جيبية أو مثلثة للناتئ (أو العينة) لتحقيق قوة تحميل معينة في كل نقطة تم تحليلها ، أثناء تسجيل انحراف الكابولي18. تجمع النتيجة بين صورة طبوغرافية للسطح ومجموعة منحنيات مسافة القوة. يستخدم كل منحنى لحساب التشوه والصلابة ومعامل يونغ والالتصاق وتبديد الطاقة عند نقطة محددة. يمكن الحصول على بيانات مماثلة عن طريق التحليل الطيفي للقوة نقطة بنقطة بعد المسح في وضع الاتصال19 ، على الرغم من أنه يستغرق وقتا أطول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد عينة لقياسات AFM
- المواد النباتية: تعقيم بذور الذرة (Zea mays L.) والجاودار (Secale cereale L.) بمحلول NaOCl بنسبة 0.35٪ لمدة 10 دقائق ، وغسل 3x بالماء المقطر ، ثم تنمو في الماء في الظلام عند 27 درجة مئوية لمدة 4 أيام و 2 أيام على التوالي. تم استخدام الجذور الأولية للتجربة.
- تحضير المحاليل والعينة لتقسيم الاهتزاز
- تحضير محلول الأغاروز لتضمين الجذور عن طريق إذابة 3٪ (وزن / وزن) من الأغاروز منخفض نقطة الانصهار في الماء باستخدام فرن الميكروويف.
ملاحظة: أجريت جميع التجارب في الماء. إذا كانت هناك حاجة إلى مخزن مؤقت أو أي نوع آخر من الوسائط للدراسة ، فمن الأفضل استخدام نفس الوسيط لإعداد الأغاروز ، أثناء التقسيم ، وفي الخلية السائلة ل AFM لتجنب إتلاف العينة. - صب طبقة 4 مم من الأغاروز المذاب بنسبة 3٪ في قاع طبق بتري (القطر = 35 مم) ، واتركه يبرد قليلا لمنع التلف الحراري للعينة.
- ضع ثلاث أو أربع قطع صغيرة (طولها حوالي 5 مم) من العضو النباتي المدروس أفقيا على الأغاروز.
ملاحظة: يجب أن تكون العينات نصف مغمورة ولكن لا تغمر في طبقة الأغاروز. إذا لم تكن العينة مغمورة ، فقد تنفجر من الأغاروز أثناء تقسيم الاهتزاز. إذا غرقت العينة في القاع ، فستكون قريبة جدا من حافة القسم وتصبح غير ملائمة لمزيد من الخطوات. - عندما يظهر فيلم رقيق شبه صلب أعلى الطبقة الأولى من الأغاروز (30-60 ثانية) ، صب بعناية طبقة ثانية في الأعلى.
ملاحظة: يجب ألا تصلب الطبقة السفلية من الأغاروز تماما. خلاف ذلك ، قد تنفصل الطبقتان عن بعضهما البعض أثناء العمل الإضافي. - بعد أن يتم ترسيخ الأغاروز تماما ، اقطع الكتلة التي تحتوي على العينة. شكل الكتلة في هرم مبتور سداسي لضمان ثباتها أثناء التقسيم الإضافي (الشكل 1 أ).
ملاحظة: يمكن توجيه العينة رأسيا أو أفقيا داخل هذه الكتلة حسب نوع القسم المطلوب. عند تحضير الكتلة ، اترك 2-3 مم من الأغاروز حول العينة. في هذه الحالة ، سيتم الاحتفاظ بقسم العينة بطبقة من 3٪ من الأغاروز ، مما سيسهل المزيد من الشلل (الشكل 1 ب).
- تحضير محلول الأغاروز لتضمين الجذور عن طريق إذابة 3٪ (وزن / وزن) من الأغاروز منخفض نقطة الانصهار في الماء باستخدام فرن الميكروويف.
- تقسيم العينة بالاهتزاز
- الغراء كتلة إلى مرحلة vibratome مع لاصق cyanoacrylate. ضع المسرح في الاهتزاز بحيث تواجه إحدى زوايا الهرم شفرة الاهتزاز. صب الماء في حمام الاهتزاز.
- اضبط معلمات التقسيم (سمك المقطع وسرعة الشفرة وتردد الاهتزاز) ، وقم بقص العينة.
ملاحظة: استخدم سمك القسم بين 200 و 400 ميكرومتر. يمكن أن يؤدي القسم الرقيق جدا إلى حدوث أخطاء في تقييم الخواص الميكانيكية ، في حين أن القسم السميك جدا يكون عرضة للكسر. تم استخدام سرعة شفرة تبلغ 1.3 مم · ثانية -1 وتردد تذبذب 90 هرتز لجذور الجاودار والذرة. - باستخدام فرشاة دقيقة ، انقل القسم من الحمام المائي إلى شريحة زجاجية ، وضع قطرة ماء على القسم لمنعه من الجفاف. تحقق من جودة القسم تحت المجهر الضوئي.
ملاحظة: لا يمكن استخدام المقاطع المائلة لقياس معامل المرونة. يجب أن تكون جدران الخلايا متعامدة مع مستوى المقطع ، وإلا فقد تنحني أو تنثني تحت طرف AFM.
- شل حركة قسم قياسات AFM (الشكل 1 ب)
- صب طبقة من 1٪ (وزن / وزن) أغاروز (~ 1 مل) في الجزء السفلي من غطاء طبق بتري باستخدام ماصة.
ملاحظة: تأكد من أن جوانب غطاء طبق بتري لا تمنع الطرف من الاقتراب من العينة. يجب أن يكون سمك طبقة الأغاروز 1 مم ويجب أن تغطي الجزء السفلي من الغطاء بالكامل. - بعد أن تصلب الأغاروز بنسبة 1٪ ، قم بإزالة الماء الزائد من القسم عن طريق إحضار ورق الترشيح إلى حافته.
ملاحظة: لا تلمس قسم النبات بالورق لتجنب التلف والتجفيف الكامل للعينة. - انقل القسم بعناية من الشريحة إلى وسط غطاء طبق بتري باستخدام فرشاة. باستخدام ماصة 20 ميكرولتر ، أضف بعناية 1٪ أغاروز حول القسم (الشكل 1 ب).
ملاحظة: يجب ألا يحصل الأغاروز بنسبة 1٪ على العينة نفسها. يجب أن تغطي فقط حواف طبقة الأغاروز 3٪ التي تحتفظ بعينة النبات. يجب أن يشكل الأغاروز 1٪ ركلة صغيرة على حواف طبقة الأغاروز 3٪ هذه. قد تمنع الركبة الكبيرة الكابولي من الاقتراب من العينة. - صب الماء أو أي محلول آخر لاستخدامه في AFM في غطاء طبق بتري مع القسم الثابت.
- صب طبقة من 1٪ (وزن / وزن) أغاروز (~ 1 مل) في الجزء السفلي من غطاء طبق بتري باستخدام ماصة.
2. إعداد ومعايرة AFM
ملاحظة: تولد طريقة حجم القوة ل AFM مجموعة تم حلها مكانيا من منحنيات مسافة القوة التي تم الحصول عليها في كل نقطة من المنطقة المدروسة. احصل على جميع المعلمات لوضع حجم القوة (صلابة الكابولي ، IOS ، إلخ) في وضع الاتصال. تم وصف إجراءات مماثلة للأدوات من الشركات المصنعة الأخرى سابقا10،20.
- حدد النوع المناسب من الكابولي.
ملاحظة: يجب أن تكون صلابة الكابولي قابلة للمقارنة مع صلابة العينة21. الكابولي الأكثر صلابة من العينة لن ينحرف كثيرا ، في حين أن الكابولي الناعم جدا لن يشوه العينة بدرجة كافية. يجب أن يكون تردد الرنين النموذجي كافيا لتأرجح الكابولي في السائل (أي أن يكون على الأقل بضع عشرات من كيلو هرتز). يجب أن تكون مساحة التلامس صغيرة مقارنة بحجم جدار الخلية لأن العينة قيد الدراسة في حسابات معامل يونغ يفترض أن تكون نصف مساحة لا نهائية. تم استخدام الكابوليات التالية لجذور الجاودار والذرة: الكابوليات الحادة بتردد رنين نموذجي يبلغ 60 كيلو هرتز ، ومتوسط ثابت زنبركي يبلغ 1.5 نيوتن متر -1 ، ونصف قطر قمة يبلغ 10 نانومتر ، أو ناتئات كروية بتردد رنين نموذجي يبلغ 75 كيلو هرتز ، ومتوسط ثابت زنبركي يبلغ 2.8 نيوتن متر -1 ، ونصف قطر قمة 150 نانومتر. - قم بتشغيل جهاز AFM والبرامج المرتبطة به (جدول المواد). قم بتركيب الكابولي على حامل الطرف للخلية السائلة. ضع قطرة من السائل على الطرف لتجنب تشكل فقاعات الهواء على الطرف أثناء غمرها في السائل.
ملاحظة: في حالة تكوين الفقاعة ، يمكن إزالة السائل بمسح دقيق ، ومن ثم يمكن وضع قطرة جديدة. - قم بتركيب حامل الطرف على رأس المسح الضوئي.
- ضع عينة صلبة (شريحة زجاجية طازجة) في غطاء طبق بتري. صب السائل فيه ، والتأكد من أنه يغطي الشريحة. ضع رأس المسح على المسرح وارفع العينة بحيث يغطي السائل الكابولي.
- اختر علامة التبويب " الرؤوس " في القائمة المنسدلة "أدوات ". تأكد من تحديد رأس المسح الضوئي للخلية السائلة.
- انقر فوق الزر "التصويب" لفتح نافذة التصويب بالليزر. انقر فوق الزر "الكاميرا" لفتح نافذة المجهر الضوئي. ضع الليزر عند طرف الكابولي ، باستخدام البراغي الموجودة على رأس AFM ونافذة المجهر الضوئي للتوجيه.
- اختر وضع Semicontact من القائمة المنسدلة في النافذة الرئيسية للبرنامج.
- افتح علامة التبويب الرنين واختر نوع الكابولي المستخدم في قائمة المجسات . انقر فوق الزر تلقائي لتحديد تردد الرنين.
ملاحظة: إذا لم يكن الكابولي المستخدم مدرجا ، فافتح الأدوات > جواز سفر التحقيق. قم بإنشاء ملف جديد ، وأدخل معلمات الكابولي ، واحفظه. ثم اختره في مجسات القائمة المنسدلة. - اختر وضع الاتصال من القائمة المنسدلة في النافذة الرئيسية للبرنامج.
- انقر فوق الزر N_Force Cal لفتح نافذة معايرة الكابولي. اختر الكابولي المستخدم وانقر على زر Sweep ، ثم زر Spect Meas لتحديد ثابت الزنبرك الكابولي باستخدام إجراء الضبط الحراري. أغلق النافذة.
- اضبط SetPoint على 1 nA. افتح علامة التبويب " النهج" وانقر على زر الهبوط للاقتراب من العينة.
- افتح علامة التبويب المسح الضوئي . اضبط معدل المسح على 0.5 هرتز. انقر فوق زر المنطقة واضبط حجم المسح الضوئي على 10 ميكرومتر × 10 ميكرومتر ونقطة المسح الضوئي على 256 × 256. انقر فوق الزر " تشغيل" وامسح حوالي 20 خطا للتحقق من عدم وجود تلوث على الزجاج. انقر فوق الزر " إيقاف" لإنهاء الفحص دون فقد البيانات.
- افتح علامة التبويب المنحنيات . تعيين المعلمات للتراجع والاقتراب من 500 نانومتر و -100 نانومتر ، على التوالي.
- اختر آخر مسح ضوئي في القائمة المنسدلة حدد إطار لمراقبة السطح.
- ابحث عن منطقة نظيفة على الزجاج وحدد النقطة التي يجب أن يؤخذ فيها منحنى تشوه القوة ، وانقر فوق الزر "تشغيل " للحصول على المنحنى. سجل من ثلاثة إلى خمسة منحنيات قوة في أماكن مختلفة على الفحص.
- انقر فوق الزر "بيانات " لفتح نافذة التحليل وتحديد الإطار مع منحنى تشوه القوة.
- انقر فوق الزر Pair Markers وحدد الجزء الخطي من منحنى التراجع لحساب نسبة إشارة DFL إلى الإزاحة ، وهي الحساسية البصرية العكسية (IOS ، nA nm-1) أو حساسية الانحراف.
- كرر الخطوة 2.17 لجميع المنحنيات المسجلة واكتب جميع القيم المحسوبة لإشارة DFL إلى نسبة الإزاحة. يجب أن تكون هي نفسها.
- أغلق نافذة التحليل ، وانقر فوق علامة التبويب نهج ، ثم الزر إزالة لسحب المسبار من العينة.
3. الحصول على البيانات
- قم بتوجيه العينة تحت ناتئ AFM باستخدام المجهر الضوئي. انقر فوق علامة التبويب " النهج" ، ثم زر الهبوط للاقتراب من العينة في وضع الاتصال باستخدام SetPoint من 1 nA.
- انقر فوق علامة التبويب المسح الضوئي ، ثم زر المنطقة . حدد حجم المنطقة 70 ميكرومتر × 70 ميكرومتر للمسح الضوئي.
- انقر فوق الزر "تحريك المسبار " وتحقق من منطقة المسح بالكامل عن طريق تحريك الماسح الضوئي فوقه. بناء على درجة نتوء الماسح الضوئي ، ابحث عن أعلى نقطة.
- افتح علامة التبويب نهج ، ثم انقر فوق الزر " إزالة" للسحب من العينة. باستخدام أعلى نقطة كهدف ، انقر فوق الزر " هبوط" للاقتراب من العينة مرة أخرى. بعد ذلك ، تحقق من السطح مرة أخرى بالنقر فوق الزر "تحريك المسبار " وتحريك الماسح الضوئي فوقه. يجب ألا تتطلب أي من النقاط الموجودة في المنطقة رفع الماسح الضوئي بالكامل.
ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب أن يتجاوز نطاق z للماسحة الضوئية فرق ارتفاع العينة. ومع ذلك ، فمن المقبول إذا كانت بعض النقاط في منطقة المسح أقل من سعة الماسح الضوئي. في الوقت نفسه ، لا ينبغي أن يكون هناك الكثير من هذه النقاط. قد تتسبب المساحات الكبيرة التي لا يمكن الوصول إليها بواسطة الماسح الضوئي في الإجهاض بالمسح. - اضبط معدل المسح الضوئي على 0.5 هرتز. اضبط حجم المسح الضوئي على 70 ميكرومتر × 70 ميكرومتر ونقطة المسح الضوئي على 64 × 64. انقر فوق الزر "تشغيل " وقم بالمسح الضوئي للتحقق من سطح العينة وتلوثها المحتمل بالأغاروز.
ملاحظة: إذا كانت العينة تحتوي على خلايا ذات تجويف كبير ، فيمكن تقليل حجم منطقة المسح ، أو يجب نقلها بحيث يكون هناك المزيد من جدران الخلايا في الفحص. - انقر فوق الزر تشغيل أعلى النافذة الرئيسية لإيقاف تشغيل حلقة الملاحظات.
- اختر وضع HDPlus (طريقة حجم القوة) في القائمة المنسدلة في النافذة الرئيسية للبرنامج. ستظهر نافذة إضافية (نافذة HD).
- اضبط SetPoint على 0.1 nA في نافذة البرنامج الرئيسية.
- في علامة التبويب الرئيسية في نافذة HD ، اضبط معلمات المسح (سعة وتكرار حركة الكابولي الجيبية) المناسبة للعينة المدروسة.
ملاحظة: يتطلب كل نوع من العينات والكابولي تحديد معلمات المسح الضوئي. بعض التجارب الأولية ضرورية. بالنسبة لجذور الذرة أو الجاودار ، تم استخدام الكابوليات الحادة والكروية بسعة 400 نانومتر وتردد 300 هرتز. - افتح علامة التبويب الضوضاء في نافذة HD وأدخل تردد الرنين للناتئ.
- افتح علامة التبويب Quant في نافذة HD وأدخل IOS ، وصلابة الكابولي ، ونصف قطر الطرف والزاوية. حدد نموذج الاتصال الذي سيتم استخدامه للحسابات اعتمادا على هندسة الطرف.
ملاحظة: يأخذ نموذج DMT في الاعتبار قوة الالتصاق الموجودة بين المسبار والعينة ، وهو الأكثر استخداما في علم الأحياء الميكانيكي21. - افتح علامة التبويب Scan في نافذة HD وحدد الإشارات المراد تسجيلها. حدد الاتجاه الذي يتم فيه تسجيل الإشارة. ضع علامة في مربع مستوى صوت القوة للحصول على سجل لجميع منحنيات القوة.
ملاحظة: سجل إشارة معامل المرونة في الاتجاهين الأمامي والخلفي. سيوفر المزيد من النقاط لحسابها. - انقر فوق الزر " إيقاف التشغيل" أعلى نافذة البرنامج الرئيسية لتشغيل حلقة الملاحظات.
- انقر فوق الزر PhaseCorr في نافذة HD الرئيسية لتصحيح حساسية النظام البصري.
- تقدم علامة التبويب vs Time في نافذة HD الرئيسية وظيفة إشارة DFL مقابل الوقت في الوقت الفعلي ؛ حدد أجزاء هذه الدالة التي سيتم استخدامها لتحديد مستوى خط الأساس ولملاءمة نموذج الاتصال لمزيد من العمليات الحسابية.
- اضبط قيمة نقطة المسح الضوئي على 256 × 256 في النافذة الرئيسية للبرنامج. اضبط معدل المسح على 0.2 هرتز وانقر على زر التشغيل لمسح العينة.
- بعد توقف المسح ، انقر فوق الزر تشغيل أعلى النافذة الرئيسية لإيقاف تشغيل حلقة الملاحظات.
- اختر وضع الاتصال في القائمة المنسدلة ، وافتح علامة التبويب النهج ، وانقر فوق الزر " إزالة" للتراجع عن العينة.
- انقر فوق الزر "بيانات " لفتح برنامج التحليل وحفظ الإخراج.
- في نهاية يوم القياس ، قم بإزالة حامل طرف الكابولي من الرأس وشطفه بعناية بالماء عالي النقاء عدة مرات. في كل مرة ، قم بإزالة الماء بمسح دقيق.
4. تقييم البيانات والمعالجة اللاحقة
ملاحظة: لا تعتمد على قيم معامل المرونة المحسوبة تلقائيا. نظرا لأن السطح يختلف اختلافا كبيرا في الارتفاع ، يجب طرد العديد من منحنيات القطع الأثرية.
- افتح الملف المحفوظ في برنامج التحليل.
- حدد إطار HDForceVolume .
- اضغط باستمرار على مفتاح Ctrl وحدد إطارا مرئيا واحدا تم الحصول عليه في نفس اتجاه المسح الضوئي. انقر فوق الزر " تحميل خريطة خارجية" لمعرفة مكان جدران الخلايا.
ملاحظة: يمكن استخدام أي خريطة إشارة كإطار مرئي ، ولكن استخدام خريطة إشارة DFL (قد تشير إليها الأدوات المختلفة كإشارة انحراف أو إشارة خطأ) قد يكون أسهل طريقة. - تحقق من قيم InvOptSens (IOS) والصلابة الكابولية في علامة التبويب الرئيسية .
- افتح علامة التبويب إضافي وتحقق من معلمات التلميح ونموذج الاتصال.
- انقر فوق نقاط مختلفة على جدران الخلايا على الإطار المرئي وحدد فقط تلك المنحنيات الموصوفة جيدا بواسطة النموذج. راجع نتائج الممثل للحصول على التفاصيل.
- اكتب القيم التي تم الحصول عليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عرض معامل المرونة النموذجي وخرائط DFL ، بالإضافة إلى منحنيات القوة التي تم الحصول عليها على جذور الجاودار والذرة بالطريقة الموصوفة ، في الشكل 2. يوضح الشكل 2A معامل المرونة وخرائط DFL التي تم الحصول عليها في القسم العرضي من الجذر الأساسي للجاودار. تتوافق المساحات البيضاء في خريطة المعامل (الشكل 2 أ ، يسار) مع تقدير مبالغ فيه خاطئ لمعامل يونغ بسبب وصول الماسح الضوئي إلى الحد الأقصى في الاتجاه z. هذه الصورة ليست ملائمة لاستخدامها كخريطة خارجية لمزيد من الاختيار من منحنيات القوة المرضية. خريطة إشارة DFL (خريطة الانحراف / الخطأ) المعروضة على اليمين (الشكل 2A) هي الأنسب لهذا الغرض.
يوضح الشكل 2B,C خرائط معامل المقاطع العرضية والطولية لجذر الذرة. يمكن أن يؤدي الماسح الضوئي الذي تم تمديده بالكامل أثناء محاولة الوصول إلى الجزء السفلي من العينة إلى قياسات خاطئة وحتى عمليات مسح متقطعة (الجزء العلوي من الشكل 2C). في بعض الأحيان ، بعد الحصول على مسح جيد في وضع الاتصال ، تنقبض الأداة فجأة على الماسح الضوئي تماما ، مما ينذر بالخطر أنه وصل إلى الحد الأقصى لاتجاه z عندما يتحول إلى وضع حجم القوة. هذا يعني أن العينة لم يتم تجميدها بشكل صحيح وتعويمها. يجب إعداد عينة جديدة.
قد يكون تلوث الأغاروز أيضا سببا لإعداد عينة جديدة (الشكل 2D ، E). يمكن التحقق من وجود الأغاروز أثناء الحصول على الفحص الأول في وضع الاتصال (الخطوة 3.5). من الناحية المثالية ، يجب أن تكون جدران الخلايا وبعض قيعان الخلايا مرئية في مثل هذه الفحوصات (الشكل 2 د) ؛ ومع ذلك ، في حالة الشلل غير الدقيق ، قد يتم تغطية السطح بالأغاروز (الشكل 2E) ، الذي يخفي تضاريس العينة.
يوضح الشكل 2F أربعة منحنيات قوة مختلفة مسجلة عند نقاط مختلفة من الجدار الخلوي نفسه. لا يظهر المنحنى المسجل عند النقطة 1 أي خط أساس. هذا يعني أنه لم يكن هناك فصل بين طرف الكابولي والجدار الخلوي. تم المبالغة في تقدير المعامل المحسوب من هذا المنحنى. يظهر المنحنى المسجل عند النقطة 3 كتفا على الجزء المقترب. قد تشير هذه القطعة الأثرية إلى أن جدار الخلية كان منحنيا. يجب طرد كلا المنحنيين المسجلين عند النقطتين 1 و 3. تظهر النقطتان 2 و 4 منحنيات قوة مرضية بقيم مماثلة للموحدات. ويمكن استخدام المعايير التالية للتمييز بين المنحنيات الصحيحة: '1' ينبغي أن يكون مستوى خط الأساس واضحا في كل من الأجزاء المقتربة والخارجة من المنحنى؛ و '2' ينبغي أن يكون مستوى خط الأساس واضحا في كل من الأجزاء المقتربة والخارجة من المنحنى؛ و '2' ينبغي أن يكون مستوى خط الأساس واضحا في كل من الأجزاء المقتربة والخارجة من المنحنى؛ و '2' ينبغي أن يكون مستوى خط الأساس واضحا في كل من الأجزاء المقتربة والخارجة من (ii) يجب ألا تكون هناك مخالفات مثل الكتفين أو الفشل (تظهر كقيم قوة ثابتة وانخفاض مفاجئ في قيم القوة في منتصف المنحدر ، على التوالي) ؛ (iii) يجب أن يتناسب النموذج المحدد مع المنحنى جيدا. بالنسبة لجميع المنحنيات المحددة ، يجب أن تكون قيم القوة القصوى المطبقة متشابهة. يمكن أيضا استخدام القوة القصوى المطبقة التي تكون أعلى أو أقل بكثير من القيمة المتوقعة كمعيار لطرد المنحنى. يمكن أن يؤدي استخدام الشبكات العصبية لتجاهل المنحنيات ذات الجودة الرديئة19 إلى تسريع معالجة النتائج.
الشكل 1: الخطوات الحرجة في تحضير العينة . (أ) جزء جذر مضمن في كتلة من الأغاروز ومثبت على مرحلة الاهتزاز. (ب) قسم عينة يوضع فوق طبقة من 1٪ أغاروز ويجمد مع أغاروز إضافي في غطاء طبق بتري. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: صور AFM النموذجية والقياسات على الجذور الأولية . (أ) معامل المرونة وخرائط DFL لمقطع عرضي من جذر الجاودار. خرائط مسجلة بالكامل (B) ومتقطعة (C) لمعامل المرونة تم الحصول عليها على مقاطع طولية وعرضية من جذر الذرة. عرض 3D لأقسام نظيفة (D) ومغطاة بالأغاروز (E) من جذور الذرة. (و) خريطة DFL لمقطع عرضي من جذر الذرة. تظهر النقاط 1-4 على جدار الخلية المواضع التي تم فيها تسجيل منحنيات القوة المعروضة على الجانب الأيمن من الصورة. الخط الأحمر للاقتراب ، والخط الأزرق للتراجع ، والخط الأسود يوضح ملاءمة نموذج ميكانيكا الاتصال. تحتوي المنحنيات المسجلة عند النقطتين 1 و 3 على قطع أثرية ولا يمكن استخدامها لإجراء العمليات الحسابية. تم فحص جذور الجاودار بأطراف حادة ، وتم فحص جذور الذرة بأطراف كروية. الاختصارات: Rhiz = رهيزوديرميس ، Exo = exodermis ، OC = القشرة الخارجية ، IC = القشرة الداخلية ، النهاية = الأدمة الداخلية ، لكل = pericycle ، و VP = حمة الأوعية الدموية. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحدد الخواص الميكانيكية للجدران الخلوية الأولية اتجاه نمو الخلايا النباتية ومعدله، ومن ثم حجم النبات وشكله في المستقبل. الطريقة القائمة على AFM المقدمة هنا تكمل التقنيات الحالية التي تستخدم لدراسة خصائص جدران الخلايا النباتية. يسمح بفحص مرونة جدران الخلايا ، التي تنتمي إلى الأنسجة الداخلية للنبات. باستخدام الطريقة المقدمة ، تم تعيين الخواص الميكانيكية لجدران الخلايا في الأنسجة المختلفة لجذر الذرة المتنامي ، وتم إنشاء نموذج رياضي بناء على هذه الخصائص6. استجاب الجذر المحاكي لتطبيق الضغط الذي يقلد التورم من خلال التغييرات في الحجم الخطي. كانت هذه التغييرات في نفس النطاق وفي الاتجاه المعاكس لتلك التي أظهرها جذر مستأصل حديثا في وسط تحللالبلازما 6.
يعد تحضير العينة أمرا بالغ الأهمية لهذا البروتوكول. يجب تجنب تجفيف العينة أثناء التحضير بأكمله. يعد الموضع الصحيح للمواد النباتية المراد تقسيمها مسألة مهمة ؛ يجب أن تكون جدران الخلايا موجهة بشكل عمودي تماما على مستوى المسح المستقبلي. خلاف ذلك ، سيتم الحصول على منحنيات تشوه القوة غير المرضية لأن جدار الخلية قد تم ثنيه أو التواءه. يجب تثبيت القسم المضمن بالأغاروز بإحكام بأغاروز إضافي (الشكل 2 ب). هذا الأخير لا ينبغي أن يحصل على العينة ، وإلا ، سيتم قياس خصائص agarose. الجزء الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو تصفية منحنيات القوة الناتجة. حتى دراسة كائنات النموذج ، مثل شبكات معايرة AFM ، قد تؤدي إلى نسبة كبيرة من منحنيات تشوه القوة الخاطئة22. يمكن أن يؤدي الاستخدام المباشر لقيم المعامل المحسوبة دون تحليل منحنيات تشوه القوة الأساسية إلى استنتاجات غير صحيحة (الشكل 2F).
لا تقتصر هذه التقنية على توطين الخلية أو حجم الأعضاء النباتية. ومع ذلك ، يصعب قطع الأشياء الصغيرة جدا وتوجيهها وشل حركتها. يصعب التعامل مع الخلايا ذات التجويف الكبير نظرا لوجود احتمال كبير لانقطاع الفحص (الشكل 2C).
مع كل فوائد استخدام أقسام نباتية غير ثابتة محضرة بالاهتزاز ، هناك مسألتان حاسمتان على الأقل: إمكانية تطوير تفاعل الإجهاد بعد قطع المواد النباتية ، وإمكانية الذوبان الجزئي للمواد من جدران الخلايا المقطوعة. كلاهما يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في تكوين وخصائص جدران الخلايا. تم اختبار وجود استجابة إجهاد فورية على القطع على Arabidopsis apices 10. لم يتم الإبلاغ عن أي تأثير كبير على الخصائص المرصودة. أجريت تجارب لاختبار التغيرات في خصائص جدران الخلايا المقطوعة أثناء حضانتها في الماء19. لم يكن هناك اتجاه مستقر في قيم معامل يونغ الظاهرة المقاسة على نفس جدار جذر الذرة لمدة نصف ساعة على الأقل19. ومع ذلك ، من الأفضل الحفاظ على وقت التجارب أقصر ما يمكن والتحقق من كل عينة لمثل هذه التغييرات أثناء حضانة العينة في الماء.
AFM هي تقنية قوية لدراسة جدران الخلايا النباتية. لكن من الواضح أن حسابات معامل المرونة والصلابة والالتصاق تستند إلى عدة افتراضات لا تفي بها الجدران الخلوية للنبات. تعتبر جميع نماذج ميكانيكا الاتصال المستخدمة من قبل AFM العينة التي تم فحصها على أنها نصف مساحة لا نهائية من مادة الخواص ، وهذا لا ينطبق على جدران الخلايا النباتية. في الوقت نفسه ، من المفترض أن يتم قياس هندسة وخصائص المسافة البادئة بدقة وثابتة على مدى عمر الكابولي ، والذي قد يكون خاطئا أيضا. بالإضافة إلى ذلك، تظهر الجدران الخلوية للنبات سلوكا ميكانيكيا معقدا يتضمن مكونات مرنة ولزجة مرنة وبلاستيكية، وعادة ما يمكن قياس واحد فقط من هذه المكونات في تجربة واحدة. ومع ذلك ، فإن البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام الطرق القائمة على AFM ترتبط بشكل موثوق مع نمو الخلايا النباتية والأداء الميكانيكي في مختلف الأعضاء والأنواع3،4،5،6. كل هذا يعني أنه يمكن تحسين كل من التقنية نفسها وفهم البيانات التي تم الحصول عليها معها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نعرب عن تقديرنا للدكتور ديمتري سوسلوف (جامعة سانت بطرسبرغ الحكومية ، سانت بطرسبرغ ، روسيا) والبروفيسور ميرا بونوماريفا (معهد التتار للبحوث العلمية للزراعة ، FRC KazSC RAS ، قازان ، روسيا) لتوفير بذور الذرة والجاودار ، على التوالي. تم تطوير الطريقة المقدمة في إطار مشروع مؤسسة العلوم الروسية رقم 18-14-00168 الممنوح لشركة LK. تم تنفيذ جزء العمل (الحصول على النتائج المقدمة) من قبل AP بدعم مالي من التكليف الحكومي لمركز FRC Kazan العلمي التابع ل RAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | - | - | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | - | - | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | - | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | - | - | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | - | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | - | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813 (2013).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
- Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161 (2018).
- Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
- Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
- Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
- Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
- Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
- Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
- Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).
- Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).
- Krieg, M., et al.
- Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).
