Summary
מחקרים על ביומכניקה של דופן התא חיוניים להבנת גדילת צמחים ומורפוגנזה. הפרוטוקול הבא מוצע לחקור דפנות תאים ראשוניות דקות ברקמות הפנימיות של איברים צמחיים צעירים באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי.
Abstract
התכונות המכניות של דפנות התא הראשוניות קובעות את הכיוון והקצב של צמיחת תאי הצמח, ולכן את גודלו וצורתו העתידיים של הצמח. טכניקות מתוחכמות רבות פותחו למדידת תכונות אלה; עם זאת, מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) נותרה הנוחה ביותר לחקר גמישות דופן התא ברמה התאית. אחת המגבלות החשובות ביותר של טכניקה זו הייתה שניתן לחקור רק תאים חיים שטחיים או מבודדים. כאן מוצג השימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי כדי לחקור את התכונות המכניות של דפנות התאים הראשוניות השייכות לרקמות הפנימיות של גוף הצמח. פרוטוקול זה מתאר מדידות של מודולוס דפנות התאים של יאנג לכאורה בשורשים, אך ניתן ליישם את השיטה גם על איברים צמחיים אחרים. המדידות מבוצעות על מקטעים שמקורם ברטט של חומר צמחי בתא נוזלי, מה שמאפשר (1) להימנע משימוש בתמיסות פלסמוליזה או הספגת דגימה בשעווה או בשרף, (2) להפוך את הניסויים למהירים, ו-(3) למנוע התייבשות של הדגימה. ניתן לחקור הן את דפנות התאים האנטי-קלינליים והן את דפנות התאים הפריקלינליים, בהתאם לאופן שבו נותחה הדגימה. הבדלים בתכונות המכניות של רקמות שונות ניתן לחקור בסעיף אחד. הפרוטוקול מתאר את עקרונות תכנון המחקר, בעיות בהכנת דגימות ומדידות, וכן את השיטה לבחירת עקומות דפורמציה של כוח כדי למנוע את השפעת הטופוגרפיה על הערכים המתקבלים של מודולוס אלסטי. השיטה אינה מוגבלת על ידי גודל המדגם אלא רגישה לגודל התא (כלומר, תאים עם לומן גדול קשים לבדיקה).
Introduction
התכונות המכניות של דופן התא הצמחי קובעות את צורת התא ואת יכולתו לגדול. לדוגמה, הקצה הגדל של צינור האבקה רך יותר מהחלקים שאינם גדלים של אותו צינור1. להיווצרות הפרימורדיה ב-Arabidopsis meristem קדמה ירידה מקומית בנוקשות דופן התא באתר של הפרימורדיום 2,3 העתידי. דפנות התאים של ערבידופסיס היפוקוטיל, המקבילות לציר הצמיחה העיקרי וצומחות מהר יותר, רכות יותר מאלו הניצבות לציר זה וצומחות לאט יותר 4,5. בשורש התירס, מעבר התאים מחלוקה להתארכות לווה בירידה במודולי האלסטי בכל רקמות השורש. המודולי נשאר נמוך באזור ההתארכות ועלה באזור ההתארכות המאוחרת6.
למרות הזמינות של שיטות שונות, המערכים הגדולים של מידע ביוכימי וגנטי על ביולוגיה של דופן התא המתקבלים מדי שנה מושווים לעתים רחוקות עם התכונות המכניות של קירות התא. לדוגמה, מוטציות בגנים הקשורים לדופן התא שינו לעתים קרובות את הגדילה וההתפתחות 4,7,8, אך הן מתוארות רק לעתים רחוקות במונחים של ביומכניקה. אחת הסיבות לכך היא הקושי לבצע מדידות ברמה התאית והתת-תאית. מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) היא כיום הגישה העיקרית לניתוחים כאלה9.
בשנים האחרונות בוצעו מחקרים רבים מבוססי AFM על ביומכניקה של דופן התא הצמחי. התכונות המכניות של דפנות התאים של הרקמות החיצוניות של Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 ובצל 12, כמו גם של תאים בתרבית13,14,15, נחקרו. עם זאת, לתאים השטחיים של צמח עשויים להיות דפנות תאים שתכונותיהם המכניות שונות מאלו של הרקמות הפנימיות6. בנוסף, תאי הצמח מופעלים בלחץ על ידי טורגור, מה שהופך אותם לנוקשים יותר. כדי להיפטר מהשפעת לחץ הטורגור, החוקרים צריכים להשתמש בתמיסות פלסמוליזינג 2,3,4,5,10,11 או לפרק את הערכים המתקבלים לתרומות טורגור ודופן התא 12. הגישה הראשונה מובילה להתייבשות דגימה ומשנה את עובי ותכונות דופן התא16, ואילו הגישה השנייה דורשת מדידות נוספות ומתמטיקה מורכבת, וחלה רק על תאים בעלי צורה פשוטה יחסית12. ניתן להעריך את תכונות דופן התא של רקמות פנימיות על cryosections17 או חלקים של חומר צמחי ספוג שרף8. עם זאת, שתי השיטות כרוכות בהתייבשות ו/או הספגה של דגימות, מה שמוביל בהכרח לשינויים במאפיינים. קשה להתייחס לתכונות של תאים מבודדים או מתורבתים לפיזיולוגיה של הצמח כולו. גם טיפוח וגם בידוד של תאי צמחים יכולים להשפיע על התכונות המכניות של דפנות התאים שלהם.
השיטה המוצגת כאן משלימה את הגישות הנ"ל. באמצעותו ניתן לבחון את דפנות התאים הראשוניים של כל רקמה ובכל שלב של התפתחות הצמח. תצפיות חתך ו-AFM בוצעו בנוזל המונע התייבשות דגימה. בעיית הטורגור נפתרה כאשר התאים נחתכים. הפרוטוקול מתאר עבודה עם שורשי תירס ושיפון, אך ניתן לבחון כל דגימה אחרת אם היא מתאימה לחיתוך ויברטום.
מחקרי ה-AFM המתוארים כאן בוצעו בטכניקת כוח-נפח. מכשירים שונים משתמשים בשמות שונים לשיטה זו. עם זאת, העיקרון הבסיסי זהה; מפת נפח כוח של הדגימה מתקבלת על ידי תנועה סינוסואידלית או משולשת של הקנטילבר (או הדגימה) כדי להשיג כוח טעינה מסוים בכל נקודה מנותחת, תוך רישום סטיית הקנטילבר18. התוצאה משלבת תמונה טופוגרפית של פני השטח ומערך עקומות מרחק הכוח. כל עקומה משמשת לחישוב העיוות, הנוקשות, המודולוס, ההידבקות ופיזור האנרגיה של יאנג בנקודה מסוימת. נתונים דומים ניתן לקבל על ידי ספקטרוסקופיית כוח נקודה אחר נקודה לאחר סריקה במצב מגע19, אם כי זה יותר זמן רב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת דגימות למדידות AFM
- חומר צמחי: לעקר את זרעי התירס (Zea mays L.) והשיפון (Secale cereale L.) עם תמיסת NaOCl של 0.35% למשך 10 דקות, לשטוף פי 3 במים מזוקקים, ולאחר מכן לגדול באופן הידרופוני בחושך בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים ויומיים, בהתאמה. שורשים ראשוניים שימשו לניסוי.
- הכנת תמיסות ודוגמאות לחיתוך ויברטום
- הכינו תמיסת אגרוז להטמעת שורשים על ידי המסת 3% (w/w) נקודת התכה נמוכה של אגרוז במים באמצעות תנור מיקרוגל.
הערה: כל הניסויים בוצעו במים. אם נדרש חיץ או כל סוג אחר של מדיום למחקר, עדיף להשתמש באותו מדיום להכנת אגרוז, במהלך החתך, ובתא הנוזלי של ה- AFM כדי למנוע פגיעה בדגימה. - יוצקים שכבה של 4 מ"מ של אגרוז 3% מומס בתחתית צלחת פטרי (קוטר = 35 מ"מ), ומניחים לה להתקרר מעט כדי למנוע נזק תרמי לדגימה.
- מניחים שלוש או ארבע חתיכות קטנות (באורך של כ-5 מ"מ) של איבר הצמח הנחקר אופקית על האגרוז.
הערה: הדוגמאות צריכות להיות שקועות למחצה אך לא שקועות בשכבת האגרוז. אם הדגימה אינה שקועה, היא עלולה לפרוץ מתוך האגרוז במהלך חיתוך הוויברטום. אם הדגימה שוקעת לתחתית, היא תהיה קרובה מדי לקצה הקטע ותהפוך ללא נוחה לצעדים נוספים. - כאשר סרט דק ומוצק למחצה מופיע על גבי השכבה הראשונה של אגרוז (30-60 שניות), יוצקים בזהירות שכבה שנייה על גבי.
הערה: השכבה התחתונה של אגרוז לא אמורה להתמצק לחלוטין. אחרת, שתי השכבות עשויות להיפרד זו מזו במהלך עבודה נוספת. - לאחר שהאגרוז מתמצק לחלוטין, חותכים את הבלוק המכיל את הדגימה. עצבו את הבלוק לפירמידה חתוכה משושה כדי להבטיח את יציבותו במהלך חתכים נוספים (איור 1A).
הערה: ניתן לכוון את הדגימה אנכית או אופקית בתוך בלוק זה, בהתאם לסוג המקטע הנדרש. בעת הכנת הבלוק, להשאיר 2-3 מ"מ של agarose סביב הדגימה. במקרה זה, מקטע המדגם יישמר על ידי שכבה של 3% אגרוז, מה שיקל על אימוביליזציה נוספת שלו (איור 1B).
- הכינו תמיסת אגרוז להטמעת שורשים על ידי המסת 3% (w/w) נקודת התכה נמוכה של אגרוז במים באמצעות תנור מיקרוגל.
- חיתוך הדגימה עם הוויברטום
- הדביקו את הבלוק לשלב הוויברטום עם דבק ציאנואקרילט. מניחים את הבמה בוויברטום כך שאחת מפינות הפירמידה פונה ללהב הוויברטום. יוצקים מים לאמבטיית הוויברטום.
- הגדר את פרמטרי החתך (עובי מקטע, מהירות להב ותדירות רטט), וחתוך את הדגימה.
הערה: השתמש בעובי המקטע שבין 200 ל- 400 מיקרומטר. קטע דק מדי יכול להציג טעויות בהערכת תכונות מכניות, בעוד שקטע עבה מדי מועד לשבירה. מהירות להב של 1.3 מ"מ·s-1 ותדר תנודה של 90 הרץ שימשו לשורשי שיפון ותירס. - בעזרת מברשת עדינה, הזיזו את החלק מאמבט המים על מגלשת זכוכית, והניחו טיפת מים על החלק כדי למנוע את התייבשותו. בדוק את איכות הקטע תחת מיקרוסקופ אור.
הערה: לא ניתן להשתמש במקטעים אלכסוניים למדידת מודולוס האלסטיות. דפנות התא חייבות להיות בניצב למישור הקטע, אחרת הן עלולות להתכופף או להתכופף מתחת לקצה ה-AFM.
- שיתוק המקטע למדידות AFM (איור 1B)
- יוצקים שכבה של אגרוז מותך 1% (w/w) (~1 מ"ל) על תחתית מכסה צלחת פטרי באמצעות פיפטה.
הערה: ודא שדפנות מכסה צלחת פטרי אינן מונעות מהקצה להתקרב לדגימה. שכבת agarose צריך להיות 1 מ"מ עובי צריך לכסות את כל החלק התחתון של הכובע. - לאחר שהתמצקות ה-1% אגרוז, הסירו עודפי מים מהחלק על ידי הבאת נייר סינון לקצהו.
הערה: אין לגעת בחלק הצמח עם הנייר כדי למנוע נזק וייבוש מלא של הדגימה. - העבירו בזהירות את החלק מהשקופית למרכז מכסה צלחת פטרי באמצעות מברשת. באמצעות פיפטה של 20 μL, הוסיפו בזהירות 1% אגרוז מסביב למקטע (איור 1B).
הערה: האגרוז של 1% לא אמור לעלות על הדגימה עצמה. זה צריך רק לכסות את הקצוות של שכבת 3% agarose ששומרת על דגימת הצמח. האגרוז 1% צריך ליצור קנולים קטנים בשולי שכבת אגרוז זו של 3%. קנולים גדולים עשויים למנוע מהקנטילבר להתקרב לדגימה. - שפכו את המים או תמיסה אחרת שתשמש ל- AFM לתוך מכסה צלחת פטרי עם החלק המשותק.
- יוצקים שכבה של אגרוז מותך 1% (w/w) (~1 מ"ל) על תחתית מכסה צלחת פטרי באמצעות פיפטה.
2. הכנה וכיול AFM
הערה: שיטת כוח-נפח של AFM יוצרת מערך פתור מרחבית של עקומות כוח-מרחק המתקבלות בכל נקודה באזור שנחקר. השג את כל הפרמטרים עבור מצב כוח-נפח (קשיחות, IOS וכו ') במצב מגע. נהלים דומים עבור מכשירים מיצרנים אחרים תוארו בעבר10,20.
- בחר את סוג הקנטילבר המתאים.
הערה: הנוקשות הקנטילית חייבת להיות דומה לנוקשות הדגימה21. קנטילבר שהוא הרבה יותר נוקשה מהדגימה לא יסיט הרבה, בעוד שקנטילבר שהוא רך מדי לא יעוות את הדגימה מספיק. תדר תהודה טיפוסי אמור להספיק כדי להניף את התדר בנוזל (כלומר, להיות לפחות כמה עשרות קילוהרץ). שטח המגע צריך להיות קטן בהשוואה לגודל דופן התא, שכן הדגימה הנחקרת בחישובי המודולוס של יאנג מניחה שהיא חצי שטח אינסופי. הקנטילברים הבאים שימשו לשורשי שיפון ותירס: קנטילברים חדים עם תדר תהודה אופייני של 60 קילוהרץ, קבוע קפיץ ממוצע של 1.5 N·m-1, ורדיוס שיא של 10 ננומטר, או קנטילים כדוריים עם תדר תהודה טיפוסי של 75 קילוהרץ, קבוע קפיץ ממוצע של 2.8 N·m-1, ורדיוס שיא של 150 ננומטר. - הפעל את התקן ה-AFM ואת התוכנה המשויכת אליו (Table of Materials). הרכיבו את המכל על מחזיק הקצה של התא הנוזלי. הניחו טיפת נוזל על הקצה כדי למנוע היווצרות בועות אוויר על הקצה בזמן טבילתו בנוזל.
הערה: במקרה של היווצרות בועות, ניתן להסיר את הנוזל עם מגבון מדויק, ולאחר מכן ניתן להניח טיפה חדשה. - הרכב את מחזיק הקצה על ראש הסריקה.
- הכניסו דגימה קשה (מגלשת זכוכית טרייה) לתוך פקק צלחת פטרי. יוצקים לתוכו את הנוזל, ומוודאים שהוא מכסה את השקופית. מניחים את ראש הסריקה על הבמה ומרימים את הדגימה כך שהנוזל יכסה את הקנטילבר.
- בחר בכרטיסיה ראשים בתפריט הנפתח כלים . ודא שראש הסריקה של תא הנוזל נבחר.
- לחץ על כפתור הכוונה כדי לפתוח את חלון מכוון לייזר . לחץ על מצלמה כפתור כדי לפתוח את חלון מיקרוסקופ אופטי . מקם את הלייזר בקצה התלת-מנוף, באמצעות הברגים בראש ה-AFM ובחלון המיקרוסקופ האופטי להתמצאות.
- בחר את מצב SemiContact מהתפריט הנפתח בחלון הראשי של התוכנית.
- פתחו את הכרטיסייה ' תהודה ' ובחרו את סוג התהודה שבו נעשה שימוש בתפריט ' בדיקות' . לחץ על כפתור אוטומטי כדי לקבוע את תדירות התהודה.
הערה: אם המתקן שבו נעשה שימוש אינו מופיע ברשימה, פתח את Tools > Probe Passport. צור קובץ חדש, הזן את הפרמטרים cantilever ושמור אותו. לאחר מכן בחר אותו בתפריט הנפתח Probes . - בחר את מצב איש קשר מהתפריט הנפתח בחלון הראשי של התוכנית.
- לחץ על כפתור N_Force Cal כדי לפתוח את חלון כיול הקנטילבר. בחר את הקנטילבר שבו נעשה שימוש ולחץ על לחצן ניקוי , ולאחר מכן את הלחצן Spect Meas כדי לקבוע את קבוע הקפיץ של הקנטילבר באמצעות הליך הכוונון התרמי. סגור את החלון.
- הגדר את SetPoint ל- 1 nA. פתח את הכרטיסייה גישה ולחץ על הנחיתה כפתור כדי לגשת לדוגמה.
- פתח את הכרטיסיה סריקה . הגדר את קצב הסריקה ל- 0.5 הרץ. לחץ על לחצן שטח והגדר את גודל הסריקה ל- 10 μm x 10 μm ואת נקודת הסריקה ל- 256 x 256. לחץ על כפתור ההפעלה וסרוק כ -20 שורות כדי לבדוק שאין זיהום על הזכוכית. לחץ על תפסיק כפתור לסיום הסריקה מבלי לאבד נתונים.
- פתחו את הכרטיסיה ' עקומות' . הגדר פרמטרים לנסיגה וגישה ל -500 ננומטר ו -100 ננומטר, בהתאמה.
- בחר את הסריקה האחרונה בתפריט הנפתח בחר מסגרת כדי לצפות במשטח.
- מצא אזור נקי על הזכוכית וציין את הנקודה שבה יש לקחת את עקומת עיוות הכוח, ולחץ על כפתור ההפעלה כדי לקבל את העקומה. הקלט שלוש עד חמש עקומות כוח במקומות שונים בסריקה.
- לחץ על הלחצן נתונים כדי לפתוח את חלון הניתוח ולבחור את המסגרת עם עקומת עיוות הכוח.
- לחץ על הלחצן Pair Markers וציין את החלק הליניארי של עקומת הנסיגה כדי לחשב את היחס בין אות ה- DFL לתזוזה, שהוא רגישות אופטית הפוכה (IOS, nA nm-1) או רגישות סטייה.
- חזור על שלב 2.17 עבור כל העקומות שנרשמו ורשום את כל הערכים המחושבים של יחס אות DFL לתזוזה. הם צריכים להיות זהים.
- סגור את חלון הניתוח, לחץ על הכרטיסייה גישה ולאחר מכן על הלחצן הסר כדי לסגת את הבדיקה מהמדגם.
3. איסוף נתונים
- הדרך את הדגימה מתחת לתעלת AFM באמצעות המיקרוסקופ האופטי. לחץ על הכרטיסייה גישה ולאחר מכן על הנחיתה כפתור כדי לגשת לדוגמה במצב איש קשר עם SetPoint של 1 nA.
- לחץ על הכרטיסייה סריקה ולאחר מכן על הלחצן אזור . בחר את גודל השטח של 70 מיקרומטר x 70 מיקרומטר לסריקה.
- לחץ על ה- Move Probe כפתור ובדוק את כל אזור הסריקה על ידי הזזת הסורק מעליו. בהתבסס על מידת הבליטה של הסורק, מצא את הנקודה הגבוהה ביותר.
- פתח את הכרטיסייה גישה ולאחר מכן לחץ על הלחצן הסר כדי לסגת מהמדגם. באמצעות הנקודה הגבוהה ביותר כמטרה, לחץ על כפתור הנחיתה כדי להתקרב שוב לדגימה. לאחר מכן, בדוק שוב את המשטח על ידי לחיצה על ה- Move Probe כפתור והזזת הסורק מעליו. אף אחת מהנקודות באזור לא צריכה לדרוש הגבהה מלאה של הסורק.
הערה: באופן אידיאלי, טווח z של הסורק אמור לחרוג מהפרש הגובה של הדגימה. עם זאת, מקובל אם נקודות מסוימות באזור הסריקה נמוכות מקיבולת הסורק. יחד עם זאת, לא צריך להיות הרבה נקודות כאלה. אזורים גדולים אליהם לא ניתן להגיע באמצעות הסורק עלולים לגרום להפלת הסריקה. - הגדר את קצב הסריקה ל- 0.5 הרץ. הגדר את גודל הסריקה ל- 70 μm x 70 μm ואת נקודת הסריקה ל- 64 x 64. לחץ על כפתור ההפעלה וסרוק כדי לבדוק את פני השטח של המדגם ואת הזיהום האפשרי שלה עם agarose.
הערה: אם הדגימה כוללת תאים עם לומן גדול, ניתן להקטין את גודל אזור הסריקה, או להזיז אותה כך שיהיו יותר דפנות תאים בסריקה. - לחץ על הלחצן On בחלק העליון של החלון הראשי כדי לכבות את לולאת המשוב.
- בחר את מצב HDPlus (שיטת עוצמת הקול) בתפריט הנפתח בחלון הראשי של התוכנית. יופיע חלון נוסף (חלון HD).
- הגדר את SetPoint ל- 0.1 nA בחלון התוכנית הראשי.
- בכרטיסייה הראשית של חלון HD, הגדר את פרמטרי הסריקה (משרעת ותדירות של תנועת קנטילבר סינוסואידלי) המתאימים למדגם הנלמד.
הערה: כל סוג של דגימה ומכל דורש בחירה של פרמטרי סריקה. יש צורך בכמה ניסויים מקדימים. עבור שורשי תירס או שיפון, נעשה שימוש בקנטילים חדים וכדוריים באמפליטודה של 400 ננומטר ובתדר של 300 הרץ. - פתח את הכרטיסייה רעשים בחלון HD והזן את תדר התהודה של cantilever.
- פתח את הכרטיסייה Quant של חלון HD והזן את IOS, קשיחות קנטילבר, רדיוס קצה וזווית. בחר את מודל איש הקשר שישמש לחישובים בהתאם לגיאומטריית העצה.
הערה: מודל DMT לוקח בחשבון את כוח ההידבקות הקיים בין הגשושית לדגימה, והוא נפוץ ביותר במכנוביולוגיה21. - פתח את הכרטיסייה סריקה של חלון HD ובחר את האותות להקלטה. בחר את הכיוון שבו נרשם האות. סמן את התיבה כוח עוצמת קול כדי לקבל תיעוד של כל עקומות הכוח.
הערה: רשום את אות מודולוס האלסטיות הן בכיוון קדימה והן בכיוון אחורה. זה יספק יותר נקודות לחישוב. - לחץ על לחצן כבוי בחלק העליון של חלון התוכנית הראשי כדי להפעיל את לולאת המשוב.
- לחץ על כפתור PhaseCorr בחלון HD הראשי כדי לתקן את הרגישות של המערכת האופטית.
- הכרטיסייה vs Time של חלון ה- HD הראשי מציגה את הפונקציה של אות DFL לעומת זמן בזמן אמת; בחר את החלקים של פונקציה זו שישמשו לקביעת רמת הבסיס ולהתאמת מודל איש הקשר לחישובים נוספים.
- הגדר את ערך נקודת הסריקה ל- 256 x 256 בחלון הראשי של התוכנית. הגדר את קצב הסריקה ל - 0.2 הרץ ולחץ על הלחצן הפעל כדי לסרוק את הדגימה.
- לאחר הפסקת הסריקה, לחץ על על כפתור ההפעלה בחלק העליון של החלון הראשי כדי לכבות את לולאת המשוב.
- בחר מצב איש קשר בתפריט הנפתח, פתח את הכרטיסייה גישה ולחץ על הלחצן הסר כדי לסגת מהמדגם.
- לחץ על נתונים כפתור כדי לפתוח את תוכנת הניתוח ולשמור את הפלט.
- בסוף יום המדידה, הסירו את מחזיק קצה הכנף מהראש ושטפו אותו בזהירות במים אולטרה-פוריים מספר פעמים. בכל פעם, הסר את המים עם מגבון מדויק.
4. הערכת נתונים ולאחר עיבוד
הערה: אל תסתמך על ערכי מודולוס אלסטיים המחושבים באופן אוטומטי. מכיוון שהמשטח משתנה מאוד בגובהו, יש לגרש עקומות חפץ רבות.
- פתח את הקובץ שנשמר בתוכנת הניתוח.
- בחר במסגרת HDForceVolume .
- החזק את מקש Ctrl לחוץ ובחר מסגרת חזותית אחת המתקבלת באותו כיוון סריקה. לחץ על הלחצן טען מפה חיצונית כדי לראות היכן ממוקמים קירות התא.
הערה: כל מפת אות יכולה לשמש כמסגרת חזותית, אך שימוש במפת האותות של DFL (מכשירים שונים עשויים להתייחס אליה כאל אות סטייה או אות שגיאה) עשוי להיות הדרך הקלה ביותר. - בדוק את ערכי הנוקשות של InvOptSens (IOS) ו- cantilever בכרטיסייה הראשית.
- פתח את הכרטיסיה נוסף ובדוק את הפרמטרים של העצה ואת מודל איש הקשר.
- לחץ על נקודות שונות על קירות התא על המסגרת החזותית ובחר רק את העקומות המתוארות היטב על ידי המודל. ראה תוצאות נציג לקבלת פרטים.
- רשום את הערכים המתקבלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מפות אופייניות של מודולוס אלסטי ו-DFL, כמו גם עקומות כוח המתקבלות על שורשי שיפון ותירס בשיטה המתוארת, מוצגות באיור 2. איור 2A מראה מפות מודולוס אלסטיות ומפות DFL המתקבלות על החלק הרוחבי של השורש הראשוני של שיפון. האזורים הלבנים במפת המודולוס (איור 2A, משמאל) תואמים להערכת יתר שגויה של המודולוס של יאנג בגלל שהסורק מגיע לגבול שלו בכיוון z. תמונה זו אינה נוחה לשימוש כמפה חיצונית לבחירה נוספת של עקומות כוח משביעות רצון. מפת האותות DFL (מפת סטייה/שגיאה) המוצגת מימין (איור 2A) מתאימה יותר למטרה זו.
מפות המודולוס של מקטעים רוחביים ואורכיים של שורש התירס מוצגות באיור 2B,C. הסורק שהורחב במלואו בזמן שניסה להגיע לתחתית הדגימה יכול לגרום למדידות שגויות ואף לסריקות שנקטעו (החלק העליון של איור 2C). לפעמים, לאחר קבלת סריקה טובה במצב מגע, המכשיר פתאום מכווץ את הסורק לחלוטין, מתריע כי הוא הגיע למגבלת כיוון z המקסימלית כאשר הוא עובר למצב כוח עוצמת הקול. המשמעות היא שהמדגם לא היה משותק כראוי וצף למעלה. מדגם חדש צריך להיות מוכן.
ייתכן גם שזיהום האגרוז הוא סיבה להכנת דגימה חדשה (איור 2D,E). ניתן לבדוק את נוכחות האגרוז בעת קבלת הסריקה הראשונה במצב מגע (שלב 3.5). באופן אידיאלי, דפנות התאים וחלק מתחתיות התאים צריכות להיות גלויות בסריקות כאלה (איור 2D); עם זאת, במקרה של אימוביליזציה לא מדויקת, המשטח עשוי להיות מכוסה באגרוז (איור 2E), אשר מסווה את הטופוגרפיה של הדגימה.
איור 2F מראה ארבע עקומות כוח שונות שנרשמו בנקודות שונות של אותו דופן תא. העקומה שנרשמה בנקודה 1 אינה מראה קו בסיס. משמעות הדבר היא שלא הייתה הפרדה של קצה הקנטילבר מדופן התא. המודולוס שחושב מעקומה זו הוערך יתר על המידה. העקומה שנרשמה בנקודה 3 מראה כתף בחלק המתקרב. ממצא זה עשוי להצביע על כך שדופן התא הייתה כפופה. יש לגרש את שתי העקומות שנרשמו בנקודות 1 ו-3. נקודות 2 ו-4 מציגות עקומות כוח משביעות רצון עם ערכים דומים של מודולי. ניתן להשתמש בקריטריונים הבאים כדי להבחין בין עקומות תקינות: (1) רמת הבסיס צריכה להיות ניכרת הן בחלקים המתקרבים והן בחלקים הנסוגים של העקומה; (2) לא אמורים להיות חריגים כגון כתפיים או כשלים (מופיע כערכי כוח קבועים וירידה פתאומית של ערכי הכוח באמצע המדרון, בהתאמה); (iii) המודל שנבחר צריך להתאים היטב לעקומה. עבור כל העקומות שנבחרו, ערכי הכוח המרבי שהוחל צריכים להיות דומים. כוח הפעלה מרבי גבוה או נמוך משמעותית מהערך הצפוי יכול לשמש גם כקריטריון לגירוש עקום. שימוש ברשתות עצביות כדי להשליך עקומות באיכות ירודה19 יכול להאיץ את עיבוד התוצאות.
איור 1: שלבים קריטיים בהכנת הדגימה . (A) שבר שורש מוטבע בגוש של אגרוז ומותקן על במת הוויברטום. (B) מקטע דגימה שהונח על גבי שכבה של 1% אגרוז ומשותק עם אגרוז נוסף בכובע צלחת פטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תמונות ומדידות AFM אופייניות על שורשים ראשוניים . (A) מודולוס גמישות ומפות DFL של חתך רוחבי של שורש השיפון. מפות מתועדות במלואן (B) ומופרעות (C) של מודולוס האלסטיות המתקבלות על מקטעים אורכיים ורוחביים של שורש תירס. תצוגה תלת-ממדית של חלקים נקיים (D) ומכוסים אגרוז (E) של שורשי תירס. (F) מפת DFL של חתך רוחבי של שורש תירס. נקודות 1-4 על דופן התא מציגות את המיקומים שבהם נרשמו עקומות הכוח שהוצגו בצד ימין של התמונה. הקו האדום מיועד להתקרבות, הקו הכחול מיועד לנסיגה, והקו השחור מראה את התאמת מודל מכניקת המגע. העקומות שנרשמו בנקודות 1 ו-3 הן בעלות ממצאים ולא ניתן להשתמש בהן לחישובים. שורשי שיפון נבדקו עם קצוות חדים, ושורשי תירס נבדקו עם קצוות כדוריים. קיצורים: Rhiz = rhizodermis, Exo = exodermis, OC = קליפת המוח החיצונית, IC = קליפת המוח הפנימית, End = endodermis, Per = pericycle, ו- VP = parenchyma כלי הדם. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התכונות המכניות של דפנות התא הראשוניות קובעות את הכיוון והקצב של צמיחת תאי הצמח, ולכן את גודלו וצורתו העתידיים של הצמח. השיטה מבוססת ה-AFM המוצגת כאן משלימה את הטכניקות הקיימות המשמשות לחקר התכונות של דפנות תאי צמחים. הוא מאפשר לחקור את גמישות דפנות התא, השייכות לרקמות הפנימיות של הצמח. בשיטה המוצגת מופו התכונות המכניות של דפנות התאים ברקמות שונות של שורש התירס הגדל, ונבנה מודל מתמטי המבוסס על תכונות אלה6. השורש המדומה הגיב להפעלת לחץ המחקה טורגור על ידי שינויים בגודל ליניארי. שינויים אלה היו באותו טווח ובכיוון ההפוך לאלה שהוצגו על ידי שורש שזה עתה נכרת במדיום פלסמוליזה6.
הכנת המדגם היא קריטית עבור פרוטוקול זה. יש להימנע מייבוש המדגם במהלך כל ההכנה. מיקום נכון של החומר הצמחי שיש לחתוך הוא נושא חשוב; קירות התא חייבים להיות מכוונים אך ורק בניצב למישור הסריקה העתידי. אחרת, יתקבלו עקומות לא מספקות של עיוות כוח מכיוון שדופן התא התכופפה או נחגרה. יש לקבע היטב את החלק המוטבע באגרוז עם אגרוז נוסף (איור 2B). זה האחרון לא צריך לעלות על המדגם, אחרת, תכונות agarose יימדדו. החלק החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא לסנן את עקומות הכוח המתקבלות. אפילו חקר אובייקטי מודל, כגון רשתות כיול AFM, עשוי לגרום לחלק ניכר מעקומות עיוות כוחשגויות 22. שימוש ישיר בערכי המודולוס המחושבים ללא ניתוח עקומות דפורמציית הכוח הבסיסיות עלול להוביל למסקנות שגויות (איור 2F).
הטכניקה אינה מוגבלת על ידי לוקליזציה של התא או גודל של איברים צמחיים. עם זאת, חפצים קטנים מדי קשים לחיתוך, כיוון ושיתוק. קשה לעבוד עם תאים עם לומן גדול מאחר שיש סבירות גבוהה להפרעה בסריקה (איור 2C).
עם כל היתרונות של שימוש בחלקי צמח לא קבועים שהוכנו עם ויברטומה, יש לפחות שתי סוגיות מכריעות: האפשרות לפתח תגובת עקה לאחר חיתוך חומר צמחי, והאפשרות של סולוביזציה חלקית של חומר מדפנות התא החתוך. שניהם יכולים להוביל לשינויים בהרכב ובתכונות של קירות התא. נוכחות של תגובת לחץ מיידית על החתך נבדקה על apices Arabidopsis 10. לא דווח על השפעה משמעותית על הנכסים שנצפו. ניסויים נערכו כדי לבחון שינויים בתכונות של קירות תאים חתוכים במהלך הדגירה שלהם במים19. לא הייתה מגמה יציבה בערכי המודולוס של יאנג לכאורה שנמדדו על אותו קיר של שורש תירס במשך תקופה של חצי שעה לפחות19. עם זאת, עדיף לשמור על זמן הניסויים קצר ככל האפשר ולבדוק כל דגימה עבור שינויים כאלה במהלך הדגירה של הדגימה במים.
AFM היא טכניקה רבת עוצמה לחקר דפנות תאי צמחים. עם זאת, ברור שחישובים של מודולוס גמישות, קשיחות והידבקות מבוססים על מספר הנחות שאינן מתממשות על ידי דפנות תאי הצמח. כל המודלים של מכניקת המגע המשמשים את AFM רואים את הדגימה הנחקרת כחצי מרחב אינסופי של חומר איזוטרופי, מה שאינו נכון עבור קירות תאים צמחיים. בד בבד, ההנחה היא כי הגיאומטריה והתכונות של האינדנטר נמדדות במדויק וקבועות לאורך תוחלת החיים של הקנטילבר, מה שעשוי להיות גם שגוי. בנוסף, דפנות תאי הצמח מציגות התנהגות מכנית מורכבת הכוללת רכיבים אלסטיים, ויסקואלסטיים ופלסטיים, ובדרך כלל ניתן למדוד רק אחד מהם בניסוי אחד. עם זאת, הנתונים המתקבלים בשיטות מבוססות AFM מתואמים באופן אמין עם צמיחת תאי הצמח והביצועים המכניים באיברים ומינים שונים 3,4,5,6. כל זה אומר כי הן את הטכניקה עצמה ואת ההבנה של הנתונים המתקבלים עם זה ניתן לשפר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לד"ר דמיטרי סוסלוב (אוניברסיטת סנקט פטרבורג, סנקט פטרבורג, רוסיה) ופרופ' מירה פונומארבה (מכון המחקר המדעי הטטרי לחקלאות, FRC KazSC RAS, קאזאן, רוסיה) על אספקת זרעי תירס ושיפון, בהתאמה. השיטה המוצגת פותחה במסגרת פרויקט קרן המדע הרוסית מס '18-14-00168 שהוענק ל- LK. החלק של העבודה (קבלת התוצאות שהוצגו) בוצע על ידי AP עם תמיכה כספית של המשימה הממשלתית עבור המרכז המדעי FRC קאזאן של RAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | - | - | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | - | - | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | - | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | - | - | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | - | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | - | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813 (2013).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
- Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161 (2018).
- Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
- Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
- Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
- Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
- Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
- Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
- Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).
- Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).
- Krieg, M., et al.
- Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).
