Summary
यह काम स्किज़ोसैक्रोमाइसेस पोम्बे में एक मल्टीकॉपी सप्रेसर आनुवंशिक स्क्रीन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह स्क्रीन एक क्वेरी म्यूटेंट स्ट्रेन से जुड़े लॉस-ऑफ-फंक्शन फेनोटाइप के सप्रेसर क्लोन (ओं) की पहचान करने के लिए जीनोम-वाइड प्लास्मिड लाइब्रेरी का उपयोग करती है। इस स्क्रीन का उपयोग करके एल 1 नल उत्परिवर्ती के नए आनुवंशिक शमनकर्ताओं की पहचान की गई थी।
Abstract
आनुवंशिक अंतःक्रियाओं की पहचान जैविक मार्गों और प्रक्रियाओं में अन्य जीनों और संगठन के साथ उनके कार्यात्मक संबंधों में अंतर्दृष्टि प्रदान करके जीन (ओं) के कार्यों को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यद्यपि अधिकांश आनुवंशिक स्क्रीन शुरू में सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में विकसित किए गए थे, इन आनुवंशिक स्क्रीन को पूरा करने के लिए एक पूरक मंच स्किज़ोसैक्रोमाइसेस पोम्बे द्वारा प्रदान किया गया है। आनुवंशिक इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सामान्य तरीकों में से एक जीनोम-वाइड, हाई-कॉपी-नंबर प्लास्मिड लाइब्रेरी से क्लोन ों के ओवरएक्प्रेशन द्वारा एक लॉस-ऑफ-फंक्शन म्यूटेंट में है, इसके बाद क्लोन का चयन होता है जो उत्परिवर्ती फेनोटाइप को दबाता है।
यह पेपर एस पोम्बे में इस 'मल्टीकॉपी दमन' आधारित आनुवंशिक स्क्रीन को पूरा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस स्क्रीन ने एस पोम्बे में एल 1 प्रतिलेखन बढ़ाव कारक की अनुपस्थिति से जुड़े जीनोटॉक्सिक तनाव-संवेदनशील फेनोटाइप के मल्टीकॉपी सप्रेसर (ओं) की पहचान करने में मदद की है। स्क्रीन को उच्च-कॉपी-नंबर एस पोम्बे सीडीएनए प्लास्मिड लाइब्रेरी के साथ क्वेरी एल 1 नल उत्परिवर्ती तनाव के परिवर्तन और ईएमएम 2 प्लेटों पर 4-नाइट्रोक्विनोलिन 1-ऑक्साइड (4-एनक्यूओ), एक जीनोटॉक्सिक तनाव-उत्प्रेरण यौगिक युक्त सप्रेसर्स का चयन करके शुरू किया गया था। इसके बाद, प्लास्मिड को दो शॉर्टलिस्ट किए गए शमन कालोनियों से अलग किया गया और सम्मिलित डीएनए को छोड़ने के लिए प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा पचाया गया। एक सम्मिलित डीएनए टुकड़े को जारी करने वाले प्लास्मिड को 4-एनक्यूओ और अन्य जीनोटॉक्सिक यौगिकों की उपस्थिति में एल 1 विलोपन उत्परिवर्ती के विकास को बहाल करने के लिए इन शमन प्लास्मिड क्लोनों की क्षमता की पुष्टि करने के लिए एल 1 विलोपन तनाव में फिर से स्थानांतरित किया गया था। विलोपन फेनोटाइप के बचाव को दिखाने वाले उन प्लास्मिड को एल 1 विलोपन से जुड़े जीनोटॉक्सिक तनाव-संवेदनशील फेनोटाइप के दमन के लिए जिम्मेदार जीन (ओं) की पहचान करने के लिए अनुक्रमित किया गया था।
Introduction
आनुवंशिक इंटरैक्शन के नेटवर्क जीन के बारे में कार्यात्मक जानकारी प्रदान करते हैं और मार्गों और जैविक प्रक्रियाओं को चित्रित करते हैं जो ये जीन विवो में शामिल हो सकते हैं। इसके अलावा, वे यह भी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कि विभिन्न जीन एक दूसरे के साथ कैसे बातचीत करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक विशिष्ट फेनोटाइप 1,2,3 होता है। वर्षों से, मौलिक जैविक प्रश्नों के उत्तर देने और मानव रोगों का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं द्वारा विभिन्न प्रकार की आनुवंशिक स्क्रीन डिजाइन की गई हैं। आनुवंशिक इंटरैक्शन की पहचान के लिए स्क्रीन कई तरीकों से किया जा सकता है। विभिन्न आनुवंशिक स्क्रीन में पहचाने गए आनुवंशिक इंटरैक्शन जीन के बीच अलग-अलग यांत्रिक संबंधों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। इसके अलावा, अध्ययनों से पता चला है कि आनुवंशिक इंटरैक्शन का एक सामान्य सेट जीन द्वारा साझा किया जाता है जो एक ही मार्ग या जटिल 4,5 से संबंधित प्रोटीन को एन्कोड करता है। इस प्रकार, आनुवंशिक इंटरैक्शन नेटवर्क का उपयोग एक सेल में कार्यात्मक संगठन को स्थापित करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें सबसे समान प्रोफाइल साझा करने वाले जीन एक ही जटिल या मार्ग से संबंधित होते हैं, कुछ हद तक कम समान प्रोफाइल साझा करने वाले जीन एक ही जैविक प्रक्रिया से संबंधित होते हैं, और ओवरलैपिंग लेकिन अधिक विविध प्रोफाइल प्रदर्शित करने वाले जीन एक ही सेलुलर कम्पार्टमेंट6 से संबंधित सदस्यों को दर्शाते हैं।
खुराक दमन ('उच्च-प्रतिलिपि या मल्टीकॉपी दमन') के आधार पर आनुवंशिक इंटरैक्शन स्क्रीन आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोणों में से एक है। इन स्क्रीनों को एक उच्च-प्रतिलिपि-संख्या जीनोमिक या सीडीएनए लाइब्रेरी के साथ एक क्वेरी उत्परिवर्ती तनाव को बदलकर किया जा सकता है, इसके बाद आनुवंशिक इंटरैक्शन 7,8,9 को दबाने या बढ़ाने की पहचान करने के लिए उपयुक्त परख / चयन तकनीकें हैं। एक व्यापक जीनोम-व्यापी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए, इन स्क्रीनों को जीनोम-वाइड लॉस-ऑफ-फंक्शन म्यूटेंट के संग्रह में रुचि के एक विशिष्ट जीन को अतिरंजित करके या लॉस-ऑफ-फंक्शन क्वेरी म्यूटेंट 9,10,11,12,13,14,15 में उच्च-कॉपी-नंबर प्लास्मिड-एन्कोडेड जीनोमिक या सीडीएनए लाइब्रेरी को अतिरंजित करके भी किया गया है। . मल्टीकॉपी रणनीति एक विनियमन योग्य प्रमोटर का उपयोग करके एक प्रमुख / ओवरएक्प्रेशन दृष्टिकोण का उपयोग करके भी काम कर सकती है।
शमन-आधारित स्क्रीन का उपयोग करने के मुख्य लाभ यह हैं कि किसी अन्य जीन द्वारा उत्परिवर्ती तनाव में पहले से मौजूद फेनोटाइप का दमन इन दो जीन उत्पादों के बीच एक आनुवंशिक संबंध स्थापित करता है जो अन्य दृष्टिकोणों का उपयोग करके प्रदर्शित नहीं किया जा सकता है। दूसरा, यह देखा गया है कि पहले से मौजूद उत्परिवर्तन की उपस्थिति एक विशेष मार्ग को संवेदनशील बनाती है, जिससे उस मार्ग के अतिरिक्त घटकों को सप्रेसर्स के अलगाव द्वारा पहचाना जा सकता है, जिन्हें अधिक प्रत्यक्ष आनुवंशिक चयन द्वारा पहचाना नहीं जा सकता है। इसके अलावा, इस स्क्रीन का उपयोग दमनकर्ताओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जिनकेपास दमन के विभिन्न तंत्र हैं। सप्रेसर इंटरैक्शन आमतौर पर जीन के बीच होते हैं जो कार्यात्मक रूप से संबंधित होते हैं और मार्गों में पदानुक्रम को स्पष्ट करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। दमन का सटीक अंतर्निहित तंत्र कई कारकों के आधार पर भिन्न हो सकता है, जिसमें स्क्रीन में उपयोग किए जाने वाले क्वेरी उत्परिवर्ती का प्रकार, प्रयोगात्मक स्थितियां और जीन अभिव्यक्ति का स्तर शामिल है। सामान्य खुराक दमन तंत्र में से एक में जीन एन्कोडिंग उत्पाद शामिल हैं जो एक ही परिसर में या एक ही सेलुलर / जैविक प्रक्रिया में समानांतर में एक साथ कार्य करते हैं। खमीर जैसे सरल मॉडल जीवों में ऐसी स्क्रीन के परिणामों को उच्च यूकेरियोटिक जीवों तक बढ़ाया जा सकता है क्योंकि अधिकांश मौलिक जैविक मार्ग और प्रक्रियाएं विकास में संरक्षित हैं।
इन आनुवंशिक स्क्रीन को विभिन्न जैविक प्रश्नों के उत्तर देने के लिए कई तरीकों से संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न जीवों के ऑर्थोलॉगस जीन जो क्वेरी उत्परिवर्ती तनाव के फेनोटाइप को दबा सकते हैं, की पहचान की जा सकती है। इसका उपयोग संभावित प्रतिरोध तंत्र को चित्रित करने और नए जीवाणुरोधी17,18, एंटिफंगल 19,20, एंटीपैरासिटिक 21 और एंटीकैंसर 22 यौगिकों के प्रोटीन लक्ष्यों को निर्धारित करने के लिए भी किया गया है। इस स्क्रीन का उपयोग दवा दवाओं की गतिविधि के शमनकर्ताओं की पहचान करने के लिए भी किया गया है जिनकी कार्रवाई का तंत्र ज्ञात नहीं है। इस प्रकार, सिद्धांत रूप में, इन मल्टीकॉपी सप्रेसर स्क्रीन को विभिन्न जीवों में विभिन्न अनुप्रयोगों में अनुकूलित और उपयोग किया जा सकता है। यद्यपि खमीर शोधकर्ताओं द्वारा नियोजित अधिकांश आनुवंशिक स्क्रीन शुरू में एस सेरेविसिया में विकसित किए गए हैं, एस पोम्बे विभिन्न आनुवंशिक स्क्रीन और परख23 को पूरा करने के लिए एक पूरक मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। इसके अलावा, एस पोम्बे में जीनोमिक संगठन और जैविक प्रक्रियाएं, जैसे कि अधिक जीनों में इंट्रोन्स की घटना, डीएनए प्रतिकृति की उत्पत्ति की जटिलता, सेंट्रोमियर संरचना, कोशिका चक्र का संगठन और आरएनएआई मशीनरी की उपस्थिति, एस पोम्बे और उच्च यूकेरियोट्स23,24 के बीच अधिक समानता दिखाती हैं, जो एस पोम्बे में आनुवंशिक उपकरणों को डिजाइन करने और उपयोग करने के महत्व को रेखांकित करती हैं।
यह पेपर एस पोम्बे में लॉस-ऑफ-फंक्शन म्यूटेंट फेनोटाइप के 'खुराक दमन' के आधार पर आनुवंशिक इंटरएक्टर्स की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल का आधार यह है कि यह सीडीएनए लाइब्रेरी को मल्टीकॉपी प्लास्मिड पर और / या एक मजबूत प्रमोटर से जंगली प्रकार के जीन को अधिक व्यक्त करने के लिए एक तेज़ और कुशल तरीका है। इस प्रोटोकॉल के चार मुख्य चरण हैं: लाइब्रेरी को क्वेरी म्यूटेंट स्ट्रेन में बदलना, प्लास्मिड क्लोन का चयन जो क्वेरी म्यूटेंट स्ट्रेन के वांछित फेनोटाइप को दबाता है, इन शमन क्लोनों से प्लास्मिड (ओं) को पुनः प्राप्त करना, और फेनोटाइप के दमन के लिए जिम्मेदार जीन की पहचान करना। जैसा कि लाइब्रेरी से सीडीएनए के चयन और पहचान के आधार पर किसी भी विधि के लिए सच है, स्क्रीन की सफलता उच्च गुणवत्ता और उच्च जटिलता लाइब्रेरी का उपयोग करने पर निर्भर है क्योंकि स्क्रीन केवल उन सीडीएनए क्लोनों को पुनर्प्राप्त कर सकती है जो लाइब्रेरी में मौजूद हैं।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने क्वेरी एस पोम्बे एल 1 नल उत्परिवर्ती के जीनोटॉक्सिक तनाव-संवेदनशील फेनोटाइप के दो नए सप्रेसर्स की सफलतापूर्वक पहचान की है। प्रतिलेखन बढ़ाव कारकों का एलईएल (ग्यारह उन्नीस लाइसिन रिच ल्यूकेमिया) परिवार इन विट्रो जैव रासायनिक परखों में डीएनए टेम्पलेट्स पर आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय के क्षणिक विराम को दबा देता है और विखंडन खमीरसे मनुष्यों तक विभिन्न जीवों में संरक्षित होता है। पहले के काम ने सबूत प्रदान किया है कि एक एस पोम्बे एल 1 नल उत्परिवर्ती 4-नाइट्रोक्विनोलिन 1-ऑक्साइड (4-एनक्यूओ) और मिथाइल मीथेनसल्फोनेट (एमएमएस) 26 की उपस्थिति में जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता दिखाता है। इसलिए, हमने एक एस पोम्बे प्लास्मिड-एन्कोडेड मल्टीकॉपी सीडीएनए लाइब्रेरी को क्वेरी एस पोम्बे एल 1 नल उत्परिवर्ती में बदल दिया और दो कथित क्लोनों की पहचान की, जिन्होंने 4-एनक्यूओ की उपस्थिति में एस पोम्बे एल 1 नल उत्परिवर्ती की जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता को दबाने की क्षमता प्रदर्शित की, एक यौगिक जो डीएनए घावों को प्रेरित करता है। प्लास्मिड क्लोन में मौजूद इंसर्ट के बाद के अनुक्रमण ने पहचान की कि रैक्स 2 + और ओएसएच 6 + को एन्कोडिंग करने वाले जीन एल 1 नल उत्परिवर्ती की जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता को दबाने के लिए जिम्मेदार थे जब एल 1 नल उत्परिवर्ती में अतिरंजित किया गया था।
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Protocol
1. सीडीएनए लाइब्रेरी को क्वेरी एस पोम्बे म्यूटेंट स्ट्रेन में मल्टीकॉपी सप्रेसर्स के लिए स्क्रीन करने के लिए बदलना
नोट: मानक लिथियम-एसीटेट विधि27 का पालन एस पोम्बे सीडीएनए लाइब्रेरी को कुछ संशोधनों के साथ क्वेरी एस पोम्बे एल 1ए स्ट्रेन में बदलने के लिए किया गया था:
- एक वाईई माध्यम (तालिका 1) प्लेट पर 32 डिग्री सेल्सियस पर एस पोम्बे एल 1 ए स्ट्रेन उगाएं, जिसमें एडेनिन, ल्यूसीन और यूरैसिल प्रत्येक में 225 μg / mL के साथ पूरक हो। उपरोक्त प्लेट से एल1ए स्ट्रेन से भरे लूप को 15-20 एमएल वाईई माध्यम में एडेनिन, ल्यूसीन और यूरैसिल के 225 μg/mL के साथ पूरक करें। इसे रात भर 32 डिग्री सेल्सियस पर झटकों (200-250 आरपीएम) के साथ इनक्यूबेट करें।
- अगले दिन, 0.3 के ओडी600 एनएम (600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व) के वांछित पूरक के साथ 100 एमएल ताजा वाईई माध्यम में रात भर की संस्कृति को पतला करें और इसे 200-250 आरपीएम पर झटकों के साथ 32 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तककि ओडी 600 एनएम मध्य-लॉग चरण तक नहीं पहुंच जाता।
- 100 एमएल कल्चर को दो 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करें, इसके बाद 4,000 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें।
- सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और सेल पेलेट को 1 एमएल बाँझ पानी से धोएं, यानी, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 4,000 × ग्राम पर 1 एमएल बाँझ पानी और सेंट्रीफ्यूज में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
- सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और चरण 1.4 में वर्णित 1x LiAc-TE (100 mM लिथियम एसीटेट, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) समाधान के 1 mL के साथ प्रत्येक सेल गोली को धोएं।
- सतह पर तैरने वाले को हटा दें और प्रत्येक सेल गोली को 1x LiAc-TE के 250 μL में पुन: निलंबित करें। रुचि के डीएनए के साथ परिवर्तन के लिए इन एस पोम्बे सक्षम कोशिकाओं (500 μL) का उपयोग करें। बाद के परिवर्तन चरणों के लिए सक्षम कोशिकाओं के 125 μL को चार अलग-अलग बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
- सैल्मन वृषण या हेरिंग शुक्राणु से वाहक डीएनए को 1 मिनट के लिए उबालें और तुरंत बर्फ पर रखें। प्रत्येक परिवर्तन के लिए, सक्षम कोशिकाओं के 125 μL युक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 10 mg/ mL विकृत, एकल-फंसे वाहक डीएनए के 10 μL जोड़ें, इसके बाद माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करके कोमल मिश्रण करें। इसके बाद, सक्षम कोशिकाओं-वाहक डीएनए मिश्रण युक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एस पोम्बे सीडीएनए लाइब्रेरी के 50 μg जोड़ें।
- माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें, और फिर 260 μL पॉलीथीन ग्लाइकोल-लिथियम एसीटेट समाधान (40% [w /v] PEG 4,000, 100 mM लिथियम एसीटेट, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) को ट्यूबों में जोड़ें और माइक्रोपिपेट टिप की मदद से धीरे-धीरे मिलाएं।
- बिना हिलाए 2 घंटे के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर परिवर्तन मिश्रण वाले माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रीवार्मेड डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) का 43 μL जोड़ें और धीरे से मिलाएं। इसके बाद, ट्यूबों को 5 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के झटके के लिए उजागर करें।
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 4,000 × ग्राम पर कोशिकाओं को गोली मार दें। सुपरनैटेंट को त्याग दें और माइक्रोपिपेट टिप की मदद से अवशिष्ट पीईजी-लिसी-टीई समाधान को हटा दें।
- कोशिकाओं को 100 μL बाँझ पानी और प्लेट में एक EMM2 (तालिका 1) प्लेट (150 मिमी) पर आवश्यक पूरक और 4-NQO के 0.2 μg / mL में पुन: निलंबित करें।
- प्लेटों पर कॉलोनियों को दिखाई देने की अनुमति देने के लिए 5-6 दिनों के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें। प्राप्त कॉलोनियों को 4-एनक्यूओ के 0.2 μg/mL की उपस्थिति में एक ही मध्यम प्लेट पर स्ट्रीक करें और आगे की स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करें।
- एक पुस्तकालय परिवर्तन प्रयोग के लिए, ऊपर चरण 1.8 से 1.14 में वर्णित परिवर्तन के लिए सक्षम कोशिकाओं के 500 μL (सक्षम कोशिकाओं x 4 माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का 125 μL) का उपयोग करें।
- एक नियंत्रण के रूप में, आवश्यक पूरक के साथ एक ईएमएम 2 प्लेट (150 मिमी) पर परिवर्तन मिश्रण का 1/10वां हिस्सा , लेकिन 4-एनक्यूओ की कमी है, पुस्तकालय के परिवर्तन के बाद प्राप्त पुस्तकालय क्लोनों की कुल संख्या की गणना करने के लिए, और शमन क्लोन के अलगाव के लिए स्क्रीन।
2. कथित शमनकर्ता द्वारा क्वेरी उत्परिवर्ती तनाव से जुड़े फेनोटाइप के बचाव / दमन का परीक्षण और सत्यापन करें
नोट: कथित शमनकर्ता (ओं) द्वारा एल 1 विलोपन से जुड़े 4-एनक्यूओ तनाव संवेदनशीलता के बचाव / दमन का परीक्षण और सत्यापन करने के लिए नीचे वर्णित तनाव स्पॉट परख की गई थी।
- बाँझ 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के विभिन्न कुओं में से प्रत्येक में 100-200 μL बाँझ पानी जोड़ें।
- बाँझ टूथपिक या 20-200 μL माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करके 4-NQO युक्त प्लेट पर सीडीएनए लाइब्रेरी परिवर्तन के बाद प्राप्त विभिन्न कॉलोनियों में से प्रत्येक से इनोकुलम की एक छोटी मात्रा चुनें। प्रत्येक अलग-अलग कॉलोनियों से इनोकुलम को माइक्रोटिटर प्लेट के अलग-अलग स्वतंत्र कुओं में जोड़ें जिसमें 100-200 μL बाँझ पानी होता है। अच्छी तरह मिलाएं।
- प्रत्येक कुएं से ईएमएम 2 एगर प्लेटों पर सेल सस्पेंशन का स्पॉट 3 μL जिसमें एडेनिन (225 μg / mL) और यूरैसिल (225 μg / mL) होते हैं, लेकिन ल्यूसीन (इस काम में उपयोग किए जाने वाले पुस्तकालय के निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड वेक्टर पर मौजूद चुनिंदा ऑक्सोट्रोफिक मार्कर) की कमी होती है। आवश्यकतानुसार प्लेटों में 4-NQO की उचित सांद्रता जोड़ें।
- कोशिकाओं को बढ़ने की अनुमति देने के लिए 3-4 दिनों के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें। उन कॉलोनियों की पहचान करें जो 4-एनक्यूओ की विभिन्न सांद्रता की उपस्थिति में कथित शमनकर्ता के रूप में वृद्धि दिखाते हैं।
- सप्रेसर्स को और अधिक मान्य करने के लिए, चयनित सप्रेसर्स को रात भर 32 डिग्री सेल्सियस पर 32 डिग्री सेल्सियस पर ईएमएम 2 माध्यम में झटकों (200-250 आरपीएम) पर विकसित करें, जिसमें एडेनिन और यूरैसिल प्रत्येक में 225 μg / mL होते हैं लेकिन ल्यूसीन की कमी होती है।
- अगले दिन, कोशिकाओं को ताजा ईएमएम 2 माध्यम में 0.3 के ओडी600 एनएम तक पतला करें और उन्हें मध्य-लॉग चरण (0.6-0.8 के लगभग ओडी 600 एनएम ) तक झटकों के साथ 32 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाएं।
- ईएमएम 2 प्लेटों पर संस्कृतियों के उपयुक्त सीरियल कमजोर पड़ने (1: 10 या 1: 5) को आवश्यक पूरक के साथ देखें जिसमें या तो 0.4 μM 4-NQO या 0.01% MMS होते हैं। नियंत्रण के लिए, आवश्यक पूरक के साथ ईएमएम 2 प्लेट पर उपभेदों को देखें लेकिन किसी भी डीएनए-हानिकारक एजेंट की कमी है।
- विकास की निगरानी के लिए 3-5 दिनों के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
नोट: क्वेरी उत्परिवर्ती तनाव से जुड़े फेनोटाइप के आधार पर उपयुक्त परख का उपयोग फेनोटाइप के बचाव या दमन का परीक्षण करने के लिए किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि क्वेरी म्यूटेंट स्ट्रेन के ठंडे-संवेदनशील फेनोटाइप के सप्रेसर्स की पहचान करने की आवश्यकता होती है, तो सप्रेसर क्लोन के परीक्षण और सत्यापन के लिए परख में कम तापमान पर बढ़ते ट्रांसफॉर्मेंट्स शामिल होंगे। - लाइब्रेरी ट्रांसफॉर्मेंट्स के साथ-साथ क्रमशः पूर्ण लंबाई जीन ऑफ इंटरेस्ट (इस मामले में स्पेल 1 ) या खाली वेक्टर के साथ रूपांतरित उत्परिवर्ती उपभेदों को सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में देखें।
3. एस पोम्बे सप्रेसर क्लोन से प्लास्मिड का अलगाव
पोम्बे से प्लास्मिड अलगाव विखंडन खमीर में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करके किया गया था: कुछ संशोधनों के साथ एक प्रयोगशाला मैनुअल28।
- ईएमएम 2 माध्यम में एक एकल खमीर कॉलोनी को टीका लगाएं जिसमें एडेनिन और यूरैसिल के 225 μg / mL होते हैं और कोशिकाओं को रात भर 32 डिग्री सेल्सियस पर 200-250 आरपीएम पर झटकों के साथ विकसित करते हैं। अगले दिन, कमरे के तापमान पर 4,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजिंग करके 5 ओ.डी. कोशिकाओं (यानी, ओ.डी. 0.5 की 10 एमएल संस्कृति) की कटाई करें।
- सुपरनैटेंट को हटा दें और 0.2 एमएल लाइसिस बफर (2% ट्राइटन एक्स -100, 1% एसडीएस, 100 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम ट्राइस एचसीएल (पीएच 8.0), और 1 एमएम एनए2ईडीटीए) में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
- माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में फिनोल के 0.2 एमएल: क्लोरोफॉर्म: आइसोमिल अल्कोहल (25: 24: 1) और 0.3 ग्राम एसिड-धोए गए ग्लास मोती जोड़ें। वोर्टेक्स माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर और बर्फ पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करता है। इस चरण को 6x दोहराएँ।
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ट्यूब को 10,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। ऊपरी जलीय परत को एक ताजा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और फिनोल के 200 μL जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: आइसोएमिल अल्कोहल (25: 24: 1)।
- ट्यूब को 10 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। ऊपरी जलीय परत को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्यूब में 100% इथेनॉल (~ 400 μL) और सोडियम एसीटेट (3 M, pH 5.8) (~ 20 μL) के 1/10 वॉल्यूम के दो संस्करण जोड़ें। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब -70 डिग्री सेल्सियस को 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा डीएनए को अवक्षेपित करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। डीएनए गोली को 70% इथेनॉल (~ 500 μL) के साथ धोएं और इसे हवा में सूखने के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
- 20 μL बाँझ पानी में डीएनए को पुन: निलंबित करें। सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं के परिवर्तन के लिए प्लास्मिड डीएनए के 2-5 μL का उपयोग करें।
नोट: प्लास्मिड को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध खमीर प्लास्मिड अलगाव किट में से किसी का उपयोग करके खमीर कोशिकाओं से भी अलग किया जा सकता है।
4. शमन क्लोन द्वारा एन्कोड किए गए जीन की पहचान
- मानक प्रोटोकॉल29 का उपयोग करके पृथक खमीर प्लास्मिड को ई.कोलाई टॉप 10 स्ट्रेन [एफ-एमसीआरए (एमआर-एचएसडीआरएमएस-एमसीआरबीसी) 80एलएसीजेडएम 15 लाखएक्स 74 रेका1 एआरए139 (आरा-ल्यू)7697 गैलुगलकेआरपीएसएल (एसटीआर) एंडए1 एनयूपीजी] में बदलें और आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एलबी (लुरिया ब्रोथ) प्लेटों पर कोशिकाओं को फैलाएं।
- मानक क्षारीय लाइसिस प्रोटोकॉल29 का उपयोग करके ई कोलाई ट्रांसफॉर्मेंट्स से प्लास्मिड (ओं) को अलग करें, और प्रतिबंध पाचन द्वारा सम्मिलित डीएनए टुकड़े की रिहाई की जांच करने के लिए प्रतिबंध एंजाइमों के उचित संयोजन का पालन करें।
नोट: सप्रेसर प्लास्मिड 84 को बीएएमएचआई प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचाया गया था, और सप्रेसर प्लास्मिड 104 को पीएसटीआई / बीएएमएचआई प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पचाया गया था। - एल1एस्ट्रेन के जीनोटॉक्सिक तनाव-संवेदनशील फेनोटाइप को बचाने की उनकी क्षमता की जांच करने के लिए एल 1 ए स्ट्रेन में प्रतिबंध पाचन के बाद सम्मिलित रिलीज दिखाने वाले प्लास्मिड को फिर से ट्रांसफॉर्म करें।
- जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता के दमन को दिखाने वाले प्लास्मिड क्लोन का चयन करें और वेक्टर-विशिष्ट फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमरों का उपयोग करके इन प्लास्मिड क्लोनों में मौजूद डीएनए टुकड़े को अनुक्रमित करें।
नोट: इस अध्ययन में, एडीएच 1 प्रमोटर-विशिष्ट सार्वभौमिक फॉरवर्ड प्राइमर (5'CATTGGTTCCCCGCCG 3') का उपयोग30 किया गया था। - दमन के लिए जिम्मेदार जीन की पहचान करने के लिए, एनसीबीआई न्यूक्लियोटाइड ब्लास्ट (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) या पोम्बेस अनुक्रम संरेखण उपकरण (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core) का उपयोग करके प्राप्त अनुक्रम को संरेखित करें। अधिकतम संरेखण दिखाने वाले अनुक्रम का चयन करें और इसे मल्टीकॉपी सप्रेसर प्लास्मिड के लिए जीन के रूप में पहचानें।
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Representative Results
एस पोम्बे में एल 1 विलोपन से जुड़े जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता के मल्टीकॉपी सप्रेसर (ओं) के लिए स्क्रीनिंग
हमने क्वेरी एल 1 विलोपन उत्परिवर्ती तनाव के हानि-ऑफ-फ़ंक्शन फेनोटाइप के मल्टीकॉपी सप्रेसर्स की पहचान करने के लिए ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके आनुवंशिक स्क्रीन का प्रदर्शन किया। 4-एनक्यूओ जीनोटॉक्सिक एजेंट की उपस्थिति में देखे गए एल 1 विलोपन तनाव की वृद्धि से संबंधित संवेदनशीलता को मल्टीकॉपी सप्रेसर्स के लिए चयन करने के लिए लॉस-ऑफ-फंक्शन फेनोटाइप के रूप में अपनाया गया था। चित्रा 1 आनुवंशिक स्क्रीन का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है। स्क्रीन शुरू करने के लिए, एल 1 विलोपन उत्परिवर्ती (एच- यूआरए 4-डी 18 ल्यू 1-32 एडीई 6-एम 210 कैन 1-1 एल 1ए :: कानएमएक्स 6) की जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता की पुष्टि पहली बार 4-एनक्यूओ (चित्रा 2 ए) की उपस्थिति में इसके इसोजेनिक जंगली-प्रकार के तनाव (एच-यूआरए 4-डी 18 ल्यू 1-32 एडी 6-एम 210 कैन 1-1) के संबंध में की गई थी। इसके बाद, क्वेरी एस पोम्बे एल 1 नल उत्परिवर्ती को उन प्लास्मिड क्लोनों के लिए चयन करने के लिए एक उच्च-प्रतिलिपि-संख्या एस पोम्बे सीडीएनए लाइब्रेरी के साथ बदल दिया गया जो एल 1 नल उत्परिवर्ती की 4-एनक्यूओ विकास-संबंधी संवेदनशीलता को दबा /बचा सकते हैं। इस पुस्तकालय में ~ 6 × 105एस पोम्बे सीडीएनए टुकड़े हैं जो एडीएच 1 प्रमोटर30 के नियंत्रण में पीएलईवी 3 एस पोम्बे ओवरएक्प्रेशन वेक्टर में क्लोन किए गए हैं। एक नियंत्रण के रूप में, परिवर्तन मिश्रण के 1/10वें हिस्से को ईएमएम 2 प्लेटों पर भी चढ़ाया गया था, जिसमें पुस्तकालय के परिवर्तन के बाद प्राप्त पुनः संयोजक क्लोनों की कुल संख्या की गणना करने के लिए 4-एनक्यूओ की कमी थी, पुस्तकालय के कवरेज का संकेत, और शमन क्लोन के अलगाव के लिए जांच की गई थी। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि कम क्लोन की स्क्रीनिंग शमन क्लोन की पहचान करने की संभावना को कम कर देगी।
चित्रा 2 बी नियंत्रण और 4-एनक्यूओ युक्त प्लेटों की प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है। जैसा कि आंकड़े में दिखाया गया है, 4-एनक्यूओ की कमी वाले नियंत्रण प्लेट पर बड़ी संख्या में कॉलोनियां प्राप्त की जाती हैं जो पुस्तकालय का अच्छा कवरेज दिखाती हैं। जैसा कि अपेक्षित था, 4-एनक्यूओ प्लेट पर कम ट्रांसफॉर्मेंट्स प्राप्त किए गए थे क्योंकि ये ट्रांसफॉर्मेंट्स संभवतः एल 1 नल उत्परिवर्ती की 4-एनक्यूओ संवेदनशीलता के कथित शमनकर्ताओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके बाद, ईएमएम 2 प्लेटों पर प्राप्त विभिन्न ट्रांसफॉर्मेंट कॉलोनियों में 0.2 μM 4-NQO होता है, जिन्हें 4-NQO की उपस्थिति में बढ़ने के लिए इन ट्रांसफॉर्मेंट्स की क्षमता की पुष्टि करने के लिए 0.2 μM 4-NQO युक्त EMM2 प्लेटों पर देखा गया था। यह देखा गया कि 620 ट्रांसफॉर्मेंट कॉलोनियां 0.2 μM 4-NQO युक्त EMM2 प्लेटों पर बढ़ने में सक्षम थीं।
जीनोटॉक्सिक तनाव स्थितियों के तहत एल 1 विलोपन उत्परिवर्ती के विकास को बहाल करने के लिए कथित शमन क्लोन की क्षमता का सत्यापन
कथित शमनकर्ताओं की पुष्टि करने के लिए, योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (चित्रा 3 ए) में दिखाए गए अनुसार उच्च स्ट्रिंगेंसी स्थितियों के तहत वांछित फेनोटाइप के बचाव का परीक्षण करना महत्वपूर्ण है। इसलिए, 620 शॉर्टलिस्ट किए गए ट्रांसफॉर्मेंट्स को ईएमएम 2 प्लेटों पर 0.4 μM 4-NQO के साथ देखा गया था। जैसा कि चित्र 3 बी में देखा जा सकता है, केवल 74 ट्रांसफॉर्मेंट्स ने 0.4 μM 4-NQO पर वृद्धि दिखाई। इसके बाद, इन 74 ट्रांसफॉर्मेंट्स को ईएमएम 2 प्लेटों पर 0.8 μM 4-NQO युक्त देखा गया, और यह देखा गया कि केवल 16 ने 0.8 μM 4-NQO (चित्रा 3C) की उपस्थिति में वृद्धि दिखाई। इन अवलोकनों की और पुष्टि करने के लिए, इन 16 ट्रांसफॉर्मेंट्स को ईएमएम 2 प्लेटों पर आवश्यक पूरक के साथ देखा गया था, जिसमें या तो 0.8 μM 4-NQO या कोई 4-NQO (नियंत्रण) नहीं था, साथ ही खाली वेक्टर के साथ रूपांतरित ell1 विलोपन उत्परिवर्ती भी था। इन स्पॉटिंग परखों के परिणामों से पता चला कि, जैसा कि अपेक्षित था, खाली वेक्टर के साथ रूपांतरित एल 1 विलोपन तनाव, साथ ही सभी 16 ट्रांसफॉर्मेंट्स ने प्लेट पर 4-एनक्यूओ की कमी देखी। इसकी तुलना में, जबकि केवल खाली वेक्टर वाले एल 1 विलोपन उत्परिवर्ती ने 0.8 μM 4-NQO पर कोई वृद्धि नहीं दिखाई, छह ट्रांसफॉर्मेंट्स ने 0.8 μM 4-NQO (चित्रा 3 डी) पर वृद्धि का प्रदर्शन किया, यह सुझाव देते हुए कि उनमें मौजूद लाइब्रेरी क्लोन (ओं) में एल 1 नल उत्परिवर्ती के जीनोटॉक्सिक तनाव फेनोटाइप को दबाने की क्षमता थी।
शमन क्लोन द्वारा एन्कोड किए गए जीन की पहचान
हमने आगे एल 1 विलोपन स्ट्रेन के 02 आनुवंशिक शमनकर्ताओं का चयन किया, सूप 84 और सूप 104, जो 4-एनक्यूओ की उपस्थिति में एल 1 से जुड़ी विकास संवेदनशीलता का पूर्ण दमन दिखाते हैं। लाइब्रेरी प्लास्मिड क्लोन (ओं) को इन दो खमीर सप्रेसर्स से अलग किया गया था और सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं में बदल दिया गया था। इसके बाद, प्लास्मिड को मानक प्रोटोकॉल31 का उपयोग करके ई कोलाई कोशिकाओं से अलग किया गया था। 84 और 104 के रूप में लेबल किए गए दो पृथक प्लास्मिड को प्रतिबंध पाचन के अधीन किया गया था, जिसने क्रमशः लगभग 1,000 बीपी और 800 बीपी सम्मिलित डीएनए टुकड़े की उपस्थिति का खुलासा किया (चित्रा 4 ए, बी)। इस सप्रेसर स्क्रीन के परिणामों को और मान्य करने के लिए, इन प्लास्मिड को एल 1 विलोपन उत्परिवर्ती में पुन: रूपांतरित किया गया और जांच की गई कि क्या वे 4-एनक्यूओ की उपस्थिति में एल 1 नल उत्परिवर्ती के विकास को बहाल कर सकते हैं। स्ट्रेस स्पॉट परख से पता चला कि सप्रेसर प्लास्मिड क्लोन के परिणामस्वरूप 4-एनक्यूओ से जुड़ी विकास संवेदनशीलता का दमन हुआ जब एल 1 नल उत्परिवर्ती में फिर से पेश किया गया, यह सुझाव देते हुए कि दमन प्लास्मिड-निर्भर था (चित्रा 4 सी)। इसके अलावा, हमने यह निर्धारित करने का फैसला किया कि क्या ये शमन क्लोन एक और डीएनए क्षति-उत्प्रेरण यौगिक, एमएमएस की उपस्थिति में एल 1 विलोपन तनाव की विकास से संबंधित संवेदनशीलता को भी दबा सकते हैं। स्पॉट परीक्षणों से पता चला है कि शमन करने वाले प्लास्मिड क्लोन ों के एल 1 नल उत्परिवर्ती में परिवर्तन के परिणामस्वरूप खाली वेक्टर के साथ एल 1 विलोपन उत्परिवर्ती के परिवर्तन की तुलना में एमएमएस युक्त माध्यम पर अधिक वृद्धि हुई, यह दर्शाता है कि ये प्लास्मिड क्लोन दोनों जीनोटॉक्सिक एजेंटों की उपस्थिति में एल 1 विलोपन उत्परिवर्ती की जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता को दबा सकते हैं। यानी, 4-एनक्यूओ और एमएमएस (चित्रा 4 डी)।
इसके बाद, इन शमन प्लास्मिड क्लोनों में मौजूद जीन की पहचान करने के लिए, सम्मिलित डीएनए टुकड़े का अनुक्रमण एडीएच 1 प्रमोटर-विशिष्ट सार्वभौमिक फॉरवर्ड प्राइमर30 का उपयोग करके किया गया था। प्राप्त न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को पोमबेस वेबसाइट (https://www.pombase.org) पर उपलब्ध 'ब्लास्ट एट एनसेम्बल' टूल का उपयोग करके खोजा गया था, जिससे पता चला कि दो प्लास्मिड क्लोन 84 और 104 में क्रमशः रैक्स 2 + और ओएसएच 6 + जीन थे, जिससे सबूत मिलता है कि रेक्स 2 और ओएसएच 6 एस पोम्बे में एल 1 + की अनुपस्थिति से जुड़े जीनोटॉक्सिक तनाव-संवेदनशील फेनोटाइप को दबाने के लिए जिम्मेदार थे। . एस पोम्बे में इन दोनों प्रोटीनों के कार्यों के बारे में ज्ञान सीमित है। Rax2 को S. pombe 32 में वनस्पति विकास के दौरान सेल ध्रुवीयता को नियंत्रित करने के लिए For3p के स्थानीयकरण को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है। ओएसएच 6 एक लिपिड परिवहन प्रोटीन है जो ऑक्सीस्टेरॉल-बाइंडिंग प्रोटीन से संबंधित प्रोटीन परिवार से संबंधित है। यह एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम से प्लाज्मा झिल्ली33 तक फॉस्फेटिडिलसेरिन के परिवहन में शामिल है।
चित्रा 1: आनुवंशिक मल्टीकॉपी सप्रेसर स्क्रीन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। इस प्रोटोकॉल के चार मुख्य चरण हैं: लाइब्रेरी को क्वेरी म्यूटेंट स्ट्रेन में बदलना, प्लास्मिड क्लोन का चयन जो क्वेरी म्यूटेंट स्ट्रेन के वांछित फेनोटाइप को दबाता है, इन शमन क्लोनों से प्लास्मिड (ओं) को पुनः प्राप्त करना, और फेनोटाइप के दमन के लिए जिम्मेदार जीन की पहचान करना। संक्षिप्त नाम: 4-एनक्यूओ = 4-नाइट्रोक्विनोलिन 1-ऑक्साइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एस पोम्बे में एल 1 विलोपन से जुड़े जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता के मल्टीकॉपी सप्रेसर (ओं) के लिए स्क्रीनिंग। (ए) स्ट्रेस स्पॉट परख अपने इसोजेनिक वाइल्ड-टाइप स्ट्रेन की तुलना में एल 1-डिलीट किए गए एस पोम्बे स्ट्रेन की 4-एनक्यूओ संवेदनशीलता दिखाती है। उपयुक्त उपभेदों के सीरियल कमजोर पड़ने (1:10) को ईएमएम 2 माध्यम पर देखा गया था जिसमें एडेनिन, ल्यूसीन और यूरैसिल के 225 μg / mL प्रत्येक को (नियंत्रण) 0.4 μM 4-NQO के साथ या उसके बिना देखा गया था। (बी) एक उच्च-कॉपी-नंबर सीडीएनए लाइब्रेरी को एल 1-डिलीट किए गए एस पोम्बे स्ट्रेन में बदल दिया गया था, और रूपांतरित कॉलोनियों को ईएमएम 2 माध्यम पर चढ़ाया गया था, जिसमें ल्यूसीन की कमी थी, लेकिन इसमें 0.2 μM 4-NQO था। परिवर्तन मिश्रण का एक छोटा एलिकोट भी ईएमएम 2 प्लेटों पर चढ़ाया गया था, जिसमें नियंत्रण के रूप में 4-एनक्यूओ की कमी थी। प्लेटों को 5-6 दिनों के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया और फोटो खिंचवाया गया। पैनल बी इन प्लेटों की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है। संक्षिप्त नाम: 4-एनक्यूओ = 4-नाइट्रोक्विनोलिन 1-ऑक्साइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: एल 1 विलोपन उत्परिवर्ती की जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता को दबाने के लिए कथित शमन क्लोन की क्षमता का सत्यापन। (ए) वांछित फेनोटाइप के दमन का परीक्षण करके पुस्तकालय ट्रांसफॉर्मेंट्स की स्क्रीनिंग का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। 620 ट्रांसफॉर्मेंट्स की वृद्धि का परीक्षण ईएमएम 2 प्लेटों पर ल्यूसीन की कमी वाले विभिन्न ट्रांसफॉर्मेंट्स को ढूंढकर 4-एनक्यूओ की बढ़ती सांद्रता पर किया गया था और जिसमें (बी) 0.4 μM 4-NQO या (C) 0.8 μM 4-NQO शामिल थे। प्लेटों को 5-6 दिनों के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया और फोटो खिंचवाया गया। प्लेटों की प्रतिनिधि छवियां दिखाई गई हैं। (घ) 16 ट्रांसफॉर्मेंट्स जो 08 μM 4-NQO पर वृद्धि दिखा रहे थे, उन्हें EMM2 प्लेटों पर देखा गया था, जिनमें ल्यूसीन की कमी थी, लेकिन उनमें या तो 08 μM 4-NQO या 4-NQO (नियंत्रण) नहीं था, साथ ही खाली वेक्टर के साथ रूपांतरित ell1 विलोपन तनाव भी था। प्लेटों को 5-6 दिनों के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया और फोटो खिंचवाया गया। केवल छह कॉलोनियों ने एल 1 विलोपन से जुड़े-जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता को बचाने की क्षमता का प्रदर्शन किया। संक्षिप्त नाम: 4-एनक्यूओ = 4-नाइट्रोक्विनोलिन 1-ऑक्साइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: शमन प्लास्मिड क्लोन की पहचान। बीएएमएचआई प्रतिबंध एंजाइम के साथ सप्रेसर प्लास्मिड 84 के पाचन पर प्रतिबंध लगाने वाले (ए) एगारोस जेल छवियों ने ~ 1 केबी का सम्मिलन जारी किया। (बी) पीएसटीआई/बीएएमएचआई प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पचने वाले सप्रेसर प्लास्मिड 104 ने ~ 800 बीपी का एक सम्मिलन जारी किया। (सी) 1:10 क्रमिक रूप से पतला एल 1 नल उत्परिवर्ती प्लास्मिड के साथ रूपांतरित, सूप 84 या सूप 104, ईएमएम 2 प्लेटों पर देखा गया, जिसमें ल्यूसीन की कमी थी और जिसमें 0.4 μM 4-NQO या (D) 0.01% एमएमएस था। नियंत्रण प्लेटों में, कोई डीएनए-हानिकारक एजेंट नहीं जोड़ा गया था। प्लेटों को 4-5 दिनों के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया और फोटो खिंचवाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1: एस पोम्बे के विकास के लिए मीडिया की संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
खमीर का व्यापक रूप से बुनियादी जैविक प्रक्रियाओं और मार्गों की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है जो यूकेरियोटिक जीवों में क्रमिक रूप से संरक्षित हैं। आनुवंशिक और जीनोमिक उपकरणों की उपलब्धता के साथ-साथ विभिन्न जैव रासायनिक, आनुवंशिक और आणविक प्रक्रियाओं के लिए उनकी स्वीकार्यता खमीर को आनुवंशिक अनुसंधान के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव बनाती है 34,35,36. वर्षों से, खमीर शोधकर्ताओं द्वारा आनुवंशिक इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए विभिन्न आनुवंशिक स्क्रीन डिजाइन किए गए हैं जो व्यक्तिगत जीन (ओं) के कार्यों के साथ-साथ उन मार्गों और जैविक प्रक्रियाओं पर प्रकाश डालेंगे जिनमें वे 10,11,17,37 शामिल हो सकते हैं। आनुवंशिक इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए सामान्य और उपयोगी स्क्रीन में से एक को 'मल्टीकॉपी या उच्च कॉपी नंबर दमन' के रूप में जाना जाता है।
इस स्क्रीन के लिए एक क्वेरी म्यूटेंट स्ट्रेन (ओं) की आवश्यकता होती है जो लॉस-ऑफ-फंक्शन फेनोटाइप का प्रदर्शन करता है, इसके बाद इस उत्परिवर्ती क्वेरी स्ट्रेन (ओं) को उच्च-कॉपी-नंबर जीनोमिक या सीडीएनए लाइब्रेरी के साथ बदल दिया जाता है। इसके बाद, प्राप्त ट्रांसफॉर्मेंट्स को उन जीनों की पहचान करने के लिए जांच की जाती है, जो जब अतिरंजित होते हैं, तो क्वेरी म्यूटेंट स्ट्रेन (ओं) से जुड़े फेनोटाइप को दबा देते हैं। प्लास्मिड लाइब्रेरी क्लोन में मौजूद विशिष्ट उत्परिवर्ती तनाव और जीन (ओं) के बीच इस प्रकार की आनुवंशिक बातचीत के परिणामस्वरूप जीन उत्पादों का अलगाव और पहचान होती है जो एक ही मार्ग में कार्य करने या एक ही जैविक प्रक्रिया को प्रभावित करने की संभावनारखते हैं। इस प्रकार, यह स्क्रीन विवो में मार्गों और जैविक प्रक्रियाओं में रुचि के जीन (ओं) और उनके कार्यात्मक संगठन के कार्यों में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। परंपरागत रूप से, इस स्क्रीन का उपयोग बड़े पैमाने पर एस सेरेविसिया 38,39,40,41,42 में किया गया है।
वर्तमान कार्य का लक्ष्य एस पोम्बे में एक मल्टीकॉपी दमन आनुवंशिक स्क्रीन को पूरा करने के लिए एक सरल और सीधा प्रोटोकॉल का वर्णन करना है। हमने एस पोम्बे स्ट्रेन का उपयोग करके स्क्रीन को अंजाम दिया, जिसमें एल 1 ट्रांसक्रिप्शन बढ़ाव कारक का विलोपन था। एलईएल प्रतिलेखन बढ़ाव कारकों का एक परिवार है, जो विखंडन खमीर से मनुष्यों तक जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में मौजूद हैं। एल 1 के कार्यों को केवल एस पोम्बे में समझा जाना शुरू हो गया है। इससे पहले के काम ने सामान्य विकास स्थितियों के दौरान इष्टतम विकास में और जीनोटॉक्सिकतनाव की स्थिति के दौरान जीवित रहने में एल 1 की भूमिका पर प्रकाश डाला था। हमने एस पोम्बे26 में जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता में एल 1 की भूमिका को अंतर्निहित आणविक तंत्र को उजागर करने के लिए एक दृष्टिकोण के रूप में मल्टीकॉपी सप्रेसर स्क्रीनिंग को नियोजित किया है। पोम्बे सीडीएनए लाइब्रेरी को एस पोम्बे एल 1 नल उत्परिवर्ती में बदल दिया गया था जो 4-एनक्यूओ के प्रति संवेदनशीलता प्रदर्शित करता है। इसके बाद, उन ट्रांसफॉर्मेंट्स का चयन किया गया जो 4-एनक्यूओ की उपस्थिति में बढ़ सकते थे।
इन ट्रांसफॉर्मेंट्स से प्लास्मिड के अलगाव और इन प्लास्मिड में मौजूद इंसर्ट के अनुक्रमण ने एस पोम्बे, रैक्स 2 + और ओएसएच 6 + में एल 1 + के दो नए आनुवंशिक इंटरएक्टर्स की पहचान की। पोम्बे में एक समान आनुवंशिक स्क्रीन का उपयोग करने वाले एक पिछले अध्ययन ने एंटी-साइलेंसिंग प्रोटीन, ईपीई 1 + की पहचान एल 1 विलोपन से जुड़े फेनोटाइप्स 43 के मल्टीकॉपी सप्रेसर के रूप में की है। हमने एस पोम्बे आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय (अप्रकाशित अवलोकन) के गैर-आवश्यक आरपीबी 9 सबयूनिट के मल्टीकॉपी सप्रेसर्स की पहचान करने में भी इस विधि का उपयोग किया है। सामूहिक रूप से, ये परिणाम आनुवंशिक मल्टीकॉपी सप्रेसर स्क्रीनिंग दृष्टिकोण की उपयोगिता को मान्य करते हैं, जो रुचि के वांछित जीन के साथ आनुवंशिक बातचीत प्रदर्शित करते हैं, कार्य, मार्गों और प्रक्रियाओं को स्पष्ट करते हैं जिसमें रुचि का जीन शामिल हो सकता है।
इस काम में वर्णित स्क्रीन का उपयोग करने के लिए, पहले एक क्वेरी उत्परिवर्ती तनाव होना महत्वपूर्ण है जो उत्परिवर्तन से जुड़े एक स्पष्ट फेनोटाइप को प्रदर्शित करता है, जिसका उपयोग मल्टीकॉपी सप्रेसर (ओं) को अलग करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस स्क्रीन की सफलता एक उच्च गुणवत्ता और अच्छी प्रतिनिधि लाइब्रेरी की उपलब्धता पर निर्भर करेगी जिसमें जंगली प्रकार के जीन या उनके संबंधित सीडीएनए की अधिकतम संख्या का प्रतिनिधित्व करने वाले क्लोन होंगे। परंपरागत रूप से, इन स्क्रीनों में जीनोमिक और सीडीएनए पुस्तकालयों दोनों का उपयोग किया गया है, लेकिन सीडीएनए पुस्तकालयों को सेल / जीव में व्यक्त एमआरएनए से बनाए जाने का लाभ है। इसके अलावा, स्क्रीन की सफलता के लिए खमीर कोशिकाओं में इसके परिवर्तन की एक उच्च दक्षता अनिवार्य है क्योंकि बड़ी संख्या में ट्रांसफॉर्मेंट्स को स्क्रीन करना महत्वपूर्ण है, जिससे सप्रेसर्स की पहचान करने की संभावना बढ़ जाती है। यदि लिथियम एसीटेट प्रोटोकॉल का उपयोग करके लाइब्रेरी को क्वेरी म्यूटेंट स्ट्रेन में बदलने के बाद कंट्रोल प्लेट पर कम ट्रांसफॉर्मेंट्स प्राप्त किए जाते हैं, तो लाइब्रेरी को बदलने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग किया जा सकता है।
लाइब्रेरी को बदलने से पहले किसी अन्य प्लास्मिड के साथ परिवर्तन प्रोटोकॉल को मानकीकृत करना भी उचित है। अन्यथा, यह अनावश्यक रूप से पुस्तकालय के नुकसान का परिणाम होगा। यहां वर्णित प्रोटोकॉल उत्परिवर्ती फेनोटाइप के रूप में 4-एनक्यूओ संवेदनशीलता का उपयोग करता है, लेकिन रुचि के विशिष्ट उत्परिवर्ती फेनोटाइप के आधार पर सप्रेसर्स के चयन के लिए उपयुक्त स्क्रीनिंग विधियों / परखों को डिज़ाइन किया जाना चाहिए। यदि लाइब्रेरी को क्वेरी म्यूटेंट स्ट्रेन में बदलने के बाद सप्रेसर्स का चयन करने के लिए प्लेट पर कोई या बहुत कम ट्रांसफॉर्मेंट प्राप्त नहीं किए जाते हैं, तो यदि संभव हो, तो सप्रेसर्स का चयन करने के लिए लाइब्रेरी को चढ़ाते समय कम कठोर शर्तों / परखों का उपयोग किया जाना चाहिए ताकि उच्च-स्ट्रिंग स्थितियों के तहत उन लोगों की पुष्टि करने से पहले अधिक से अधिक आनुवंशिक सप्रेसर्स का पता लगाया जा सके। पहचाने गए शमन प्लास्मिड क्लोन में सम्मिलित की उपस्थिति के लिए परीक्षण करने के लिए प्रतिबंध पाचन का उपयोग करने के अलावा, वेक्टर-विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर का उपयोग वांछित सम्मिलित डीएनए टुकड़े को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, शमन प्लास्मिड क्लोन को सीधे अनुक्रमण के लिए दिया जा सकता है, प्रतिबंध पाचन या पीसीआर की आवश्यकता से बचते हुए।
इस स्क्रीन को एस सेरेविसिया और एस पोम्बे के अलावा अन्य खमीर के लिए भी अपनाया जा सकता है यदि उपयुक्त उत्परिवर्ती उपभेदों, प्लास्मिड और प्रमोटर संरचनाओं के संबंध में एक आनुवंशिक उपकरण किट उपलब्ध है जो जीन के अतिवृद्धि की सुविधा प्रदान करेगा, जिससे मेजबान खमीर कोशिका में मौजूद उत्परिवर्ती फेनोटाइप के बचाव की अनुमति मिलेगी। इसके अलावा, जीनोम-वाइड विलोपन म्यूटेंट44 और ओवरएक्प्रेशन लाइब्रेरी37 के संग्रह सहित जीनोम-वाइड संसाधनों की उपलब्धता के साथ, इस स्क्रीन को एक या कुछ क्वेरी प्लास्मिड को खमीर उत्परिवर्ती तनाव संग्रह की एक व्यवस्थित सरणी में परिवर्तित करके या ओवरएक्प्रेशन प्लास्मिड संग्रह की एक व्यवस्थित सरणी को एक या कुछ उत्परिवर्ती क्वेरी उपभेदों में परिवर्तित करके भी किया जा सकताहै। . अंत में, इस दृष्टिकोण को विभिन्न जीवों में प्रयोगात्मक प्रश्नों की एक विस्तृत विविधता के लिए स्पष्ट रूप से सामान्यीकृत किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस कार्य को जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत सरकार से एक अनुसंधान अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था (अनुदान सं 2006)। बीटी/पीआर12568/बीआरबी/10/1369/2015) निमिषा शर्मा को। चार्ल्स हॉफमैन (बोस्टन कॉलेज, यूएसए) को एस पोम्बे सीडीएनए लाइब्रेरी के उपहार के लिए और प्रोफेसर सुसान फोर्सबर्ग को खमीर प्लास्मिड के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-NQO | Sigma | N8141 | |
| Acetic Acid, glacial | Sigma | 1371301000 | |
| Adenine Sulphate | Himedia | GRM033 | |
| Agar | Himedia | GRM026 | |
| Agarose | Lonza | 50004L | |
| Ammonium Chloride | Himedia | MB054 | |
| BamHI | Fermentas | ER0051 | |
| Biotin | Himedia | RM095 | |
| Boric Acid | Himedia | MB007 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C4901 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma | C0549 | |
| Citric Acid | Himedia | RM1023 | |
| Disodium hydrogen phospahte anhydrous | Himedia | GRM3960 | |
| single stranded DNA from Salmon testes | Sigma | D7656 | |
| EDTA disodium | Sigma | 324503 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Himedia | RM6353 | |
| Glucose | Amresco | 188 | |
| Ionositol | Himedia | GRM102 | |
| Isopropanol | Qualigen | Q26897 | |
| Leucine | Himedia | GRM054 | |
| Lithium Acetatae | Sigma | 517992 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Himedia | MB040 | |
| Molybdic Acid | Himedia | RM690 | |
| Nicotinic Acid | Himedia | CMS177 | |
| PEG, MW 4000 | Sigma | 81240 | |
| Pentothinic Acid | Himedia | TC159 | |
| Phenol | Himedia | MB082 | |
| Plasmid Extraction Kit | Qiagen | 27104 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Potassium hydrogen Pthallate | Merc | DDD7D670815 | |
| Potassium iodide | Himedia | RM1086 | |
| RNAse | Fermentas | EN0531 | |
| SDS | Himedia | GRM205 | |
| Sodium Hydroxide | Himedia | GRM1183 | |
| Sodium Sulphate | Himedia | RM1037 | |
| Tris free Base | Himedia | MB209 | |
| Uracil | Himedia | GRM264 | |
| Yeast Extract Powder | Himedia | RM668 | |
| Zinc Sulphate Heptahydrate | Merc | DJ9D692580 |
References
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