Summary
Церебральные органоиды предоставляют беспрецедентные возможности для изучения развития органов и патологии заболеваний человека. Хотя большие успехи были достигнуты с системами церебральных органоидных культур, все еще существуют операционные трудности в применении этой технологии. Настоящий протокол описывает церебральную органоидную процедуру, которая облегчает изменение среды и перенос органоидов.
Abstract
В настоящее время технология церебральной органоидной культуры все еще сложна в эксплуатации и трудна для применения в больших масштабах. Необходимо найти простое и практичное решение. Поэтому в настоящем исследовании предлагается более осуществимый церебральный органоидный протокол. Чтобы решить неизбежные неудобства в изменении среды и переносе органоидов на ранней стадии, текущие исследования оптимизируют технологию работы, применяя инженерный принцип. Для бокового освещения образцов эмбриоидного тела (EB) была принята лампа мягкого света, позволяющая ЭБ быть видимыми невооруженным глазом через усиленный эффект диффузного отражения. Используя принцип вторичного потока, генерируемого вращением, органоиды собираются к центру скважины, что облегчает операцию изменения среды или переноса органоидов. По сравнению с дисперсной клеткой, эмбриональное тело быстрее оседает в пипетке. Используя это явление, большинство свободных клеток и фрагментов мертвых клеток могут быть эффективно удалены простым способом, предотвращая повреждение ЭБ от центрифугирования. Это исследование облегчает работу мозговой органоидной культуры и способствует применению органоидов головного мозга.
Introduction
По сравнению с двумерными (2D) системами культур, трехмерные (3D) системы культур имеют ряд преимуществ, включая подлинную репликацию и эффективное воспроизведение сложных структур определенных органов1. Поэтому церебральные органоиды являются одним из важных вспомогательных методов для исследований в области развития мозга человека и болезни2, скрининга лекарств и клеточной терапии.
Культивирование церебральных органоидов методом вращающейся суспензии способствует их развитию и созреванию3. Хотя системы церебральных органоидных культур достигли больших успехов, они по-прежнему сталкиваются с критическими проблемами, которые ограничивают их применение. Например, ручное выращивание включает в себя сложные этапы манипуляции и создает препятствия для достижения крупномасштабных применений. Дополнительно на каждом этапе развития в культуре церебральных органоидов необходимы изменения в различных средах и цитокинах4. Однако на ранней стадии органоиды или ЭБ имеют крошечные размеры (примерно от 200 мкм до 300 мкм) и почти визуально недоступны без соответствующего аппарата. Неизбежно, определенное количество драгоценных образцов органоидов вымывается при изменении среды. Было изучено много методов преодоления этого в других видах органоидных культур, и некоторые примеры включают погружение целых органоидных чипов в культуральную среду в течение 3 дней без вмешательства5; добавление свежей среды через крышку после поглощения старой среды с использованием абсорбирующей бумаги5; или применение сложных микрофлюидных трубопроводов для жидкостообмена 6,7,8. Другим препятствием, встречающимся на ранней стадии культивирования органоидов, является трудность достижения прямых наблюдений невооруженным глазом, что может привести к плохим операциям, которые приводят к повреждению и потере органоидов во время этапов переноса органоидов. Поэтому необходимо установить более осуществимый протокол, который облегчает изменение среды и перенос органоидов для генерации органоидов.
Для преодоления этих проблем предлагается соответствующая оптимизированная операция, основанная на инженерных принципах, что значительно и удобно облегчает многие органоидные процедуры. В природе, когда солнце светит в дом через оконную щель, невооруженным глазом можно увидеть пыль, танцующую в луче света. Из-за диффузного отражения солнечного света на пыли часть света преломляется в глазное яблоко для получения визуального изображения. Вдохновленный принципом этого явления 9,10, это исследование сделало лампу мягкого света и осветило ЭБ сбоку. Было обнаружено, что ЭБ могут быть визуально чистыми, не влияя на область просмотра. Вторичный поток, указывающий на центр, генерируется в жидкости путем вращения культуральной пластины за счет вихревых токов11. Первоначально дисперсные ЭБ накапливаются в центре пластины. Исходя из этого, а также явления, что скорость осаждения органоидов быстрее, чем у клеток, предложен простой в эксплуатации метод изменения среды и переноса органоидов без центрифугирования. Органоиды в культуральной среде могут быть эффективно отделены от свободных клеток и фрагментов мертвых клеток с помощью этой операции переноса.
Здесь предлагается протокол, который прост в эксплуатации, для генерации церебральных органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека. Технология работы была оптимизирована за счет применения инженерного принципа, что делает операции в 3D-культуре такими же простыми и осуществимыми, как и в 2D-культуре. Улучшенный метод обмена жидкости и операция переноса органоидов также полезны для других типов органоидных культур и конструкции автоматических культуральных машин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол был составлен после Хельсинкской декларации. Одобрение было предоставлено Комитетом по этике Третьей аффилированной больницы Медицинского университета Гуанчжоу (Медицинский и этический обзор [2021] No 022). Перед экспериментом каждую среду готовили по формуле12 Юргена А. Кноблиха (дополнительные таблицы 1-4) или использовали коммерчески доступный церебральный органоидный набор (см. Таблицу материалов). IPSCs, используемые в этом исследовании, были ранее установлены нашей лабораторией и получили обоснованное исключение. SCA3-iPSCs были получены от 31-летней пациентки со спиноцеребеллярной атаксией типа 3 (SCA3), генотипированной как содержащая 26/78 ЦАГ-повторов в гене ATXN313 (дополнительный рисунок 1A). Нормальные человеческие IPSCs, упомянутые в предыдущей статье, были выбраны как NC-iPSCs14, а ген ATXN3 был идентифицирован как имеющий 14/14 ЦАГ-повторов (дополнительный рисунок 1B).
1. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)
- Собирают 3 мл периферической крови методом венипункции с информированного согласия добровольцев и пациентов.
- Выделяют мононуклеарные клетки периферической крови по методу Фиколла-Паке15.
- Установить ИПСК в соответствии с протоколом Набора перепрограммирования Сендая (см. Таблицу материалов).
- Культивируйте ИПСК со средой mTeSR1 в 35 мм чашках Петри, покрытых Матригелем (базальная мембранная матрица, см. Таблицу материалов). Меняйте среду каждый день. Плотность роста iPSC не должна превышать 75%.
- Переваривать клетки раствором диссоциации ПСК (см. Таблицу материалов) и субкультурировать их в соотношении 1:5 каждые 3-5 дней.
ВНИМАНИЕ: Здесь используется вирус Сендай. Он должен эксплуатироваться в кабинете биобезопасности, и должны быть приняты меры самозащиты. Должно быть ясно, можно ли легально использовать его в местной стране. Местные законы и правила в области биобезопасности должны строго соблюдаться при использовании.
2. Подготовка EB (дни 0-1)
- Извлеките среду mTeSR1 из iPSCs с помощью пипетки и промыть ее 2x с 1 мл 1x PBS.
- Удаляют PBS пипеткой и добавляют 300 мкл раствора для отсоединения клеток (см. Таблицу материалов) для переваривания ИПСК в отдельные клетки в течение 3-4 мин при 37 °C.
- Повторно суспендируют клетки в 2 мл EB-пластовой среды (дополнительная таблица 1) и затем центрифугируют образец в течение 5 мин при 300 х г (комнатная температура).
- Предварительно обработать специализированную 24-луночную пластину антиадгезионным раствором (500 мкл/лунку) в течение 5 мин (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Антиадгезивный промывочный раствор необходим для оптимального образования ЭБ и сфероидов. - Повторно суспендируют клетки в EB-пластовой среде, содержащей Y-27632 (конечная концентрация, 10 мкМ, см. Таблицу материалов), с плотностью клеток 1,5 х 106 клеток/мл.
- Удалите антиадгезивный промывочный раствор и промыть каждую лунку 2 мл EB-пластовой среды.
- Добавьте ячейки к специализированным 24-луночным пластинам с плотностью 3 х 106 ячеек/лунка (рисунок 1А, слева).
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, в каждой скважине можно приготовить 300 ЭБ. Этот метод позволяет получать большие количества ЭБ одинакового размера. - Центрифугировать пластину при 100 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Равномерно распределите ячейки в каждой камере в нижней части пластины (рисунок 1А, справа).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет подходящей центрифуги, пластина также может быть непосредственно помещена в инкубатор для статической культуры, но время образования шарика EB будет на несколько часов позже, чем при обычном центрифугировании. - Инкубировать образцы при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 ч. Если центрифугирование не применялось на предыдущей стадии, инкубируют в течение 36 ч. Держите образец устойчивым и не вынимайте его из инкубатора в течение этого периода.
3. Подготовка лампы мягкого света (день 1)
- Используйте прозрачную акриловую доску толщиной 0,3-0,5 см размером с бумагу формата А5. Наклейте белые подушечки на переднюю и заднюю части акриловой пластины.
- Установите ряд светодиодных белых огней на край пластины, чтобы огни могли входить со стороны акриловой пластины, а затем стрелять параллельно (дополнительный рисунок 2A-F, рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку диаметры ЭБ на ранней стадии составляют приблизительно от 200 мкм до 300 мкм, трудно четко наблюдать их невооруженным глазом под люминесцентной лампой чистых скамеек. Напротив, благодаря усилению диффузного отражения мы можем четко обнаружить ЭБ с помощью мягкого света с боковой подсветкой (рисунок 1B, C). 6-луночная пластина рекомендуется для EB культур в последующих экспериментах. Однако, чтобы лучше показать визуальный эффект мягкого света, посуда иногда используется для съемки и видео в этом исследовании вместо тарелок, поэтому, пожалуйста, не поймите неправильно. Лампа мягкого света с боковым освещением также может быть использована для 6-луночной пластины.
- Установите ряд светодиодных белых огней на край пластины, чтобы огни могли входить со стороны акриловой пластины, а затем стрелять параллельно (дополнительный рисунок 2A-F, рисунок 1B).
4. Перенос EB и замена среды (дни 2-5)
- Подготовьте новую 6-луночную пластину с низкой адгезией и добавьте 2 мл EB-пластовой среды в каждую скважину.
- Удалите ЭБ вместе со средой с помощью широкопроходного наконечника пипетки объемом 1000 мкл (см. Таблицу материалов) и перенесите их на пластину с низкой адгезией с 6 лунками (~100 ЭБ/лунка).
ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе эксплуатации используется лампа мягкого света (упомянутая на шаге 3.), чтобы облегчить наблюдение за ЭБ. Выключите другие внутренние источники света, чтобы получить визуальный эффект мягкого света лучше. - Заменяйте одним и тем же объемом свежую EB-пластовую среду каждый день. Используйте вторичный поток, чтобы собрать ЭБ в центр и изменить среду.
- Аспирируйте старую среду, медленно пипетируя до края лунки. Не сосите слишком сильно; в противном случае ЭБ будут удалены вместе. Затем добавьте свежую среду, чтобы повторно использовать EB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Принцип вторичного потока (рисунок 1D). Индуцируйте поток вихря, вращая тарелку по круговой орбите. Из-за вихревого потока индуцируется вторичный поток, направленный к центру. ЭБ или органоиды сходятся к центру скважины из-за вторичного потока, генерируемого вращением, после чего может быть легко выполнено изменение среды или перенос эмбрионов.
- Аспирируйте старую среду, медленно пипетируя до края лунки. Не сосите слишком сильно; в противном случае ЭБ будут удалены вместе. Затем добавьте свежую среду, чтобы повторно использовать EB.
5. Проверка плюрипотентности путем маркировки маркером плюрипотентности OCT4 (день 4)
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда диаметр ЭБ превышает 300 мкм, возьмите несколько ЭБ для окрашивания маркером иммунофлуоресценции OCT4, чтобы обнаружить их плюрипотентность.
- Фиксируйте ЭБ в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение 30 мин, затем промывая в 1x PBS 3x в течение 10 мин каждый раз.
- Переводят ЭБ при комнатной температуре PBS, содержащей 0,3% Triton X-100 и 3% BSA в течение 2 ч, с последующей промывкой в PBS 3x в течение 10 мин каждый раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: После обработкиtriton X-100 ЭБ плавают на поверхности жидкости и могут легко всасываться вместе с жидкостью во время очистки. Рекомендуется операция под стереомикроскопом. - Разбавляют первичное антитело OCT4 (см. Таблицу материалов) 1 мл 1x PBS, содержащим 1% BSA в соотношении 1:200, и добавляют к EBs для инкубации при 4 °C на ночь, затем промывают pBS 3x в течение 10 мин каждый раз.
- Разбавьте соответствующее вторичное антитело (см. Таблицу материалов) 1x PBS при 1:500 и добавьте 1 мл к ЭБ.
- После инкубации при комнатной температуре в течение 2 ч промывайте клетки в 1x PBS 3x в течение 10 мин каждый раз.
- Удалите PBS, добавьте 2 мл 1x раствора PBS, содержащего 1 мкг/мл DAPI, инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем промывайте в PBS 3x в течение 10 мин каждый раз.
- Переместите ЭБ, содержащий небольшое количество жидкости, на затвор, запечатайте затвор покровным стеклом, покрытым коммерчески доступным вазелином (см. Таблицу материалов) по краю, а затем наблюдайте и собирайте изображение под флуоресцентным конфокальным микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выражение OCT4 представляет плюрипотентность EB12. Если выражение OCT4 составляет менее 90%, ЭБ следует отбросить, а ЭБ подготовить заново.
6. Нейронная индукция (дни 5-7)
- Подготовьте новую 6-луночную пластину с низкой адгезией и добавьте в каждую скважину 3 мл нейронной индукционной среды (дополнительная таблица 2).
- Включите боковой мягкий свет (упомянутый в шаге 3.) и выключите другие внутренние источники света.
- Перенесите ЭБ на 6-луночную пластину с добавлением нейронной индукционной среды (~100 ЭБ/лунка). Добавьте как можно меньше исходной среды в новую лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Введите простые навыки переносаорганоидов. Естественно, под действием силы тяжести и с относительно более высокой плотностью, чем среда, повторно суспендированные ЭБ будут постепенно опускаться, применяя операцию, показанную на рисунке 1E. Следовательно, ЭБ могут быть удобно переданы. Поскольку, по сравнению с ЭБ, свободные клетки и фрагменты мертвых клеток опускаются медленнее, большинство свободных клеток и фрагментов мертвых клеток, таким образом, могут быть удалены с помощью этого метода осаждения (рисунок 1F). - Инкубировать образцы при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Под микроскопом диаметр ЭБ составлял примерно 500 мкм, а край был полупрозрачным, что указывает на то, что образовался нейроэпителиальный слой. - Перейдите к следующему шагу.
7. Встраивание в матрицу базальной мембраны (7-10 дней)
- Поместите мембранную матрицу в холодильник с температурой 4 °C за 60 мин до растворения. Заранее рассчитайте сумму необходимой матрицы. Приблизительно 100 ЭБ были встроены в 1,5 мл мембранной матрицы.
- Включите боковой мягкий свет и выключите источник света в верхней части консоли.
- Держите мембранную матрицу на льду, чтобы предотвратить затвердевание.
- Каждый раз перекладывайте небольшое количество ЭБ в 60-миллиметровую посуду, содержащую свежую расширительную среду (дополнительная таблица 3). Уменьшите количество ЭБ, чтобы упростить удаление одного ЭБ.
- Затем используйте новую 6-луночную пластину с низкой адгезией. Каждый раз всасывайте один ЭБ (содержащий приблизительно 10 мкл среды) с широкопроходным наконечником пипетки объемом 200 мкл (см. Таблицу материалов), а затем добавляйте его на дно 6-луночной пластины, чтобы сделать капли. Используйте по пять капель на лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ключ состоит в том, чтобы отрегулировать диапазон пипетки до 50 мкл и высосать EB, а затем обратиться к операции на рисунке 1E. Когда EB оседает в отверстии наконечника пипетки, наконечник быстро касается дна пластины колодца и выталкивает примерно 10 мкл жидкости с образованием капли. - Добавьте 15 мкл мембранной матрицы к каждой капле, содержащей EB, и быстро перемешайте ее. Вставьте шарик EB в центр капли.
ПРИМЕЧАНИЕ: ЭБ не должны быть аспирированы стандартным наконечником пипетки, который повреждает ЭБ. Вместо этого необходимо использовать широкопроходный наконечник пипетки объемом 200 мкл. - Поместите 6-луночную пластину в инкубатор с температурой 37 °C на 30 минут и затвердите капли мембранной матрицы, содержащие ЭБ.
- Добавьте 3 мл среды расширения к каждой скважине и осторожно взорвите встроенные в матрицу ЭБ, чтобы приостановить их.
- Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 3 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается почкование на поверхности ЭБ, это означает, что образовался расширенный нейроэпителий16.
8. Созревание органоидов (10-40 дней)
- Аккуратно удалите исходную среду и добавьте 3 мл среды созревания (дополнительная таблица 4) в каждую лунку.
- Поместите органоидную пластину на горизонтальный шейкер в инкубаторе при температуре 37 °C.
- Продолжайте поворачивать язык и региональные параметры по горизонтали. Установите шейкер на соответствующую скорость.
ПРИМЕЧАНИЕ: При культивировании церебральных органоидов на 6-луночной пластине более уместна относительная центробежная сила (RCF) 0,11808 х г, по словам производителя горизонтального шейкера (см. Таблицу материалов). В соответствии с преобразованием между относительной центробежной силой и скоростью вращения17,18, RCF = 1,118 x 10−5 × R × об/мин2, где RCF = относительная центробежная сила (g), rpm = обороты в минуту (r/min) и R = радиус вращения (см), также известный как бросок встряхивания. Параметры встряхивания разных шейкеров могут быть разными. Таким образом, можно оценить, что скорость вращения составляет rpm = 299 x (RCF/R)1/2. - Меняйте свежую среду созревания каждые 2-3 дня.
- Через 20-30 дней постепенно культивируют церебральные органоиды до зрелости.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого периода органоиды могут быть использованы для экспериментов и обнаружения, таких как обнаружение нейронных маркеров и секвенирование транскриптома 19,20,21.
9. Замороженные срезы и иммунофлуоресценция церебральных органоидов
- Зафиксируйте органоиды в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение 16 ч, а затем промывайте их 3 раза с 1x PBS в течение 10 мин каждый раз.
- Удалите PBS и погрузите органоиды в 30% сахарозы при 4 °C в течение ночи.
- Встраивают органоиды в 10%/7,5% желатин/сахароза при 37 °C в течение 1 ч, а затем быстро переносят их во встраиваемую форму.
- Добавьте сухой лед к 100% этанолу, чтобы приготовить суспензию сухого льда / этанола, и поместите в него образцы органоидов для быстрой заморозки.
- Храните замороженные образцы в морозильной камере при температуре −80 °C. При необходимости делают замороженные срезы толщиной 20 мкм.
- Обратитесь к шагам 5.3.-5.5. для иммунофлуоресценции. Используйте антитело PAX6 для маркировки апикальных клеток-предшественников, антитело TUJ1 (см. Таблицу материалов) для маркировки нейронных клеток 22,23,24 и DAPI для окрашивания ядерной ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Настоящее исследование индуцировало ИПСК (Рисунок 2В) в церебральные органоиды (Рисунок 2С). ЭБ, культивируемые на ранней стадии, выражали маркер OCT4 (рисунок 2A), который указывал на хорошую плюрипотентность. На более поздней стадии ЭБ развились в зрелые церебральные органоиды (рисунок 2D). Исследование культивировало иПСК от нормальных здоровых людей и пациентов с SCA3 в церебральные органоиды (рисунок 3A). SCA3, также известный как болезнь Мачадо-Джозефа (MJD), является нейродегенеративным расстройством, вызванным расширением полиглутамина в гене ATXN325. Данные RNA-seq (загруженные в общедоступный репозиторий, см. Таблицу материалов) выявили значительные различия в профилях экспрессии генов между нормальной церебральной органоидной группой и SCA3-церебральной органоидной группой в таких путях, как транспорт нейротрансмиттеров, образование синапсов и регуляция (рисунок 3B). Программное обеспечение Cufflinks использовалось для вычисления уровня экспрессии генов и разницы26. DEseq2 был дополнительно использован для анализа данных27.
Рисунок 1: Оптимизированные операции по изменению среды и переносу ЭБ. (А) Подготовка ЭБ. ИПСК переваривали и добавляли в специализированные 24-луночные пластины (слева). Клетки образовали ЭБ (справа). Шкала составляет 400 мкм. (B) Принципиальная диаграмма бокового освещения мягкого света для помощи в наблюдении органоидов. С) ЭБ наблюдались с различными источниками света. Желтая стрелка: боковой свет; красная стрелка: темный фон; зеленые стрелки: EB. (D) Вихревой поток индуцируется вращением тарелки по круговой орбите. Из-за вихревого потока индуцируется вторичный поток, направленный к центру. ЭБ сходятся к центру тарелки, приводимой в движение вторичным потоком, генерируемым вращением. Белые стрелки: ЭБ. (E) Перенос органоидов. (I) Во-первых, для всасывания раствора смеси, включая как ЭБ, так и питательную среду, используется наконечник пипетки с широким горлом. (II) Затем, удерживая пипетку в вертикальном положении, ЭБ постепенно погружаются под действием силы тяжести и сходятся к устью кончика пипетки. (III) Когда горлышко кончика пипетки снова касается поверхности жидкости (обычно свежей среды) и из-за поверхностного натяжения жидкости (IV) ЭБ быстро погружаются в среду (нет необходимости в дополнительном выдувании путем пипетки вручную). Красная линия: уровень жидкости; желтые стрелки: EB. (F) Поскольку свободные клетки и фрагменты мертвых клеток погружаются медленнее, чем ЭБ, большинство свободных клеток и фрагментов мертвых клеток могут быть удалены с помощью вышеупомянутого метода осаждения для облегчения переноса эмбрионов. Красное поле в правом верхнем углу представляет собой увеличенное изображение. Шкала составляет 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Индукция ИПСК в церебральные органоиды. (А) Иммунофлуоресцентное окрашивание ЭБ. OCT4: октамер-связывающий транскрипционный фактор-4; DAPI: ДАПИ дигидрохлорид. Шкала составляет 100 мкм. (B) iPSCs. Шкала шкалы составляет 400 мкм. (C) Церебральных органоидов. Шкала бара составляет 200 мкм. (D) Иммунофлуоресцентное окрашивание церебральных органоидов. PAX6: парная коробка 6 является маркером апикальных клеток-предшественников; TUJ1: нейрон-специфический класс III β-тубулин является нейрон-специфическим маркером. Шкала составляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Культивирование ИПСК у здоровых людей и пациентов с SCA3 в церебральные органоиды. (A) Различные этапы, охватывающие созревание церебральных органоидов, начиная с ЭБ. НК: нормальная группа; SCA3: Группа SCA3/MJD. Масштабные полосы изображений с низким и высоким увеличением составляют 400 мкм и 200 мкм соответственно. (B) Диаграмма анализа обогащения GO пониженных, дифференциально экспрессированных генов между нормальными органоидами и органоидами SCA3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Идентификация ЦАГ-повторов ATXN3 методом капиллярного электрофореза. (A) Пациент с SCA3 iPSC (SCA3-iPSC) был идентифицирован как имеющий 26/78 CAG-повторов в гене ATXN3. (B) Нормальный человеческий iPSC (NC-iPSC) был идентифицирован как имеющий 14/14 ЦАГ-повторов в гене ATXN3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Подготовка лампы мягкого света. (A) Блок питания и светодиодные фонари были установлены на одной стороне акриловой доски (как показано на красной пунктирной коробке). Длина волны рассеяния светодиодной лампы мягкого света составляет 450-470 нм, световой поток составляет 1300-1800 лм, а индекс цветопередачи составляет 75-85 Ra. (B) Было проверено, могут ли светодиодные лампы нормально светиться (как показано в красном пунктирном поле). (C) На переднюю и заднюю части акриловой пластины была наклеена белая подушечка (на что указывают красные стрелки). D) Общий внешний вид лампы мягкого света. (E) Лампа мягкого света также может быть заменена коммерческой светодиодной покрасочной лампой без рамы, которая обычно используется для отслеживания при копировании эскизов. Слой белой пленки должен быть наклеен непосредственно над светодиодной покрасочной панелью. (Ф) Лампа мягкого света в работе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 1: Состав ЭБ-пластовой среды. На начальной стадии формирования ЭБ (как правило, первые 2 дня) к EB-пластовой среде необходимо добавить Y-27632 (50 мкМ) и bFGF (4 нг/мл). Среда должна быть отфильтрована с помощью фильтрующего блока 0,2 мкм и сохранена при температуре −20 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Дополнительная таблица 2: Состав среды нейронной индукции. Среда должна быть отфильтрована с помощью фильтрующего блока 0,2 мкм и сохранена при температуре −20 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Дополнительная таблица 3: Состав расширительной среды. В DMEM-F12 готовили разбавление 2-меркаптоэтанола 1:100, и 87,5 мкл этого добавляли в расширительную среду. B27 не должен содержать витамин А. Среда должна быть отфильтрована с помощью фильтрующего блока 0,2 мкм и сохранена при температуре −20 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Дополнительная таблица 4: Состав среды созревания. Было приготовлено разбавление 2-меркаптоэтанола в DMEM-F12 в соотношении 1:100 и добавление 87,5 мкл этого вещества в среду созревания. B27 не должен содержать витамин А. Среда должна быть отфильтрована с помощью фильтрующего блока 0,2 мкм и сохранена при температуре −20 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Церебральные органоиды открывают новые возможности для медицинских исследований. Многие полезные применения этой технологии только начинают изучаться28. Это исследование показало, что результаты секвенирования транскриптома генетически больных церебральных органоидов и нормальных церебральных органоидов могут отражать различия между болезнью и здоровьем. Например, результаты анализа данных RNA-seq (рисунок 3B) согласуются со многими зарегистрированными исследованиями заболеваний SCA3 29,30,31,32. Экспериментальные операции, такие как изменение среды, перенос ЭБ и обертывание, имеют решающее значение для культивирования церебральных органоидов и определения того, можно ли приготовить органоиды с хорошей однородностью33,34. В этом исследовании вводится мозговой органоидный протокол, который способствовал изменению среды и переносу органоидов. Боковая лампа мягкого света может значительно помочь в работе органоидной культуры. Тем не менее, это не сложно сделать, светодиодная покрасочная световая подушка и простая обработка также могут заменить ее. Простой метод обмена жидкости и операция переноса органоидов облегчают весь процесс культивирования. На применение церебральных органоидов часто влияет проблема плохого однородности35. Самое большое различие между этим исследованием и другими рекомендациями по культуре церебральных органоидов заключается в том, что основное внимание уделяется оптимизации операции, чтобы сделать эксперимент более повторяемым.
Очень важно поддерживать стабильность системы культуры. Если условия позволяют, предлагается отдать приоритет коммерческой мозговой органоидной среде, которая может эффективно уменьшить большие различия в экспериментальных результатах в разных партиях из-за нестабильности среды. Кроме того, хранение церебральной органоидной среды при 4 °C не должно длиться более 2 недель; в противном случае это повлияет на стабильность системы культуры. Конечно, также важно обеспечить, чтобы используемые ИПСК были плюрипотентными, а не дифференцированными. Может быть использовано иммунофлуоресцентное обнаружение OCT4. Если OCT4-положительные клетки составляют менее 90%, рекомендуется заменить их более качественными ИПСК и снова культивировать церебральные органоиды.
Существуют некоторые ограничения в технологии церебральной органоидной культуры, представленной в этом исследовании. Например, церебральные органоиды не могут интенсивно культивироваться на более поздней стадии развития, что является пустой тратой культурального пространства. Это также актуальная проблема, которую необходимо решить при применении церебральных органоидов. Если многие церебральные органоиды демонстрируют полое расширение, количество органоидов в каждой лунке уменьшается, частота среднего обмена увеличивается, и органоиды находятся в негипоксическом состоянии с достаточным количеством питательных веществ.
Это исследование является оперативным дополнением ко многим существующим методам церебральной органоидной культуры 12,36,37 и даже другим типам методов культивирования органов 38,39. Это поможет разработать автоматизированные системы органоидных культур в будущем и будет способствовать исследованию и применению органоидов. Если в автоматической интеллектуальной системе культивирования используется технология усиления эффекта светодиффузного отражения органоидов, то теоретически она может заменить высокоточную камеру усиления изображения, и нужно установить только обычное устройство распознавания изображений. Кроме того, средообмен и перенос органоидов через вторичный поток, генерируемый вращением и естественным осаждением на всасывающей головке, теоретически более осуществимы, чем центрифугирование в будущем автоматическом культуральном оборудовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Фондом естественных наук провинции Гуандун (грант No 2020A0505100062), Проектом по ключевым темам науки и техники города Гуанчжоу (грант No 201904020025), Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 31872800, 32070582, 82101937) и проектом постдокторских исследований города Гуанчжоу (Бангчжу Чену).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7.1 (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W.
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L.
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, Pt 11 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B.
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
