Summary
Cerebrale organoïden bieden ongekende mogelijkheden voor het bestuderen van orgaanontwikkeling en menselijke ziektepathologie. Hoewel er veel succes is geboekt met cerebrale organoïde kweeksystemen, zijn er nog steeds operationele problemen bij het toepassen van deze technologie. Het huidige protocol beschrijft een cerebrale organoïde procedure die mediumverandering en organoïde overdracht vergemakkelijkt.
Abstract
Op dit moment is cerebrale organoïde cultuurtechnologie nog steeds ingewikkeld om te bedienen en moeilijk op grote schaal toe te passen. Het is noodzakelijk om een eenvoudige en praktische oplossing te vinden. Daarom wordt in deze studie een meer haalbaar cerebraal organoïde protocol voorgesteld. Om het onvermijdelijke ongemak bij mediumverandering en organoïde transfer in een vroeg stadium op te lossen, optimaliseert het huidige onderzoek de bedieningstechnologie door het engineeringprincipe toe te passen. Een zachte lichtlamp werd gebruikt om de embryoïde lichaamsmonsters (EB) zijdelings te verlichten, waardoor de EB's met het blote oog kunnen worden gezien door het verbeterde diffuse reflectie-effect. Met behulp van het principe van secundaire stroom gegenereerd door rotatie, verzamelen de organoïden zich naar het midden van de put, wat de werking van mediumverandering of organoïde overdracht vergemakkelijkt. In vergelijking met de gedispergeerde cel nestelt het embryoïde lichaam zich sneller in de pipet. Met behulp van dit fenomeen kunnen de meeste vrije cellen en dode celfragmenten op een eenvoudige manier effectief worden verwijderd, waardoor WORDT voorkomen dat EB's schade oplopen door centrifugatie. Deze studie vergemakkelijkt de werking van cerebrale organoïde cultuur en helpt de toepassing van hersenorganoïden te bevorderen.
Introduction
In vergelijking met tweedimensionale (2D) cultuursystemen hebben driedimensionale (3D) cultuursystemen verschillende voordelen, waaronder echte replicatie en efficiënte reproductie van complexe structuren van bepaalde organen1. Daarom zijn cerebrale organoïden een van de belangrijke hulpmethoden voor de onderzoeksgebieden van de ontwikkeling van het menselijk brein en ziekte2, geneesmiddelenscreening en celtherapie.
Het kweken van cerebrale organoïden door middel van de roterende suspensiemethode is bevorderlijk voor hun ontwikkeling en rijping3. Hoewel cerebrale organoïde kweeksystemen veel succes hebben geboekt, worden ze nog steeds geconfronteerd met kritieke uitdagingen die hun toepassing beperken. Handmatige teelt omvat bijvoorbeeld gecompliceerde manipulatiestappen en introduceert obstakels voor het bereiken van grootschalige toepassingen. Bovendien zijn in elk ontwikkelingsstadium in de cultuur van cerebrale organoïden veranderingen in verschillende media en cytokines nodig4. In het vroege stadium hebben de organoïden of EB's echter kleine afmetingen (ongeveer 200 μm tot 300 μm) en zijn ze bijna visueel ontoegankelijk zonder geschikte apparatuur. Onvermijdelijk wordt een bepaalde hoeveelheid kostbare organoïde monsters weggespoeld wanneer het medium wordt vervangen. Er zijn veel technieken onderzocht om dit in andere soorten organoïde culturen te overwinnen, en enkele voorbeelden zijn het onderdompelen van hele organoïde chips in een kweekmedium gedurende 3 dagen zonder interventie5; het toevoegen van een vers medium door de coverslip nadat het oude medium is geabsorbeerd met absorberend papier5; of het toepassen van complexe microfluïdische pijpleidingen voor vloeistofuitwisseling 6,7,8. Een ander obstakel dat in het vroege stadium van organoïdeteelt wordt ondervonden, is de moeilijkheid om directe waarnemingen met het blote oog te bereiken, wat slechte operaties kan veroorzaken die leiden tot organoïde schade en verlies tijdens de organoïde overdrachtsstappen. Daarom is het noodzakelijk om een haalbaarder protocol op te stellen dat mediumverandering en organoïde-overdracht vergemakkelijkt om organoïden te genereren.
Een overeenkomstige geoptimaliseerde werking op basis van technische principes wordt voorgesteld om deze problemen te overwinnen, wat veel organoïde procedures aanzienlijk en gemakkelijk vergemakkelijkt. In de natuur, wanneer de zon door een raamopening in een huis schijnt, kan het blote oog het stof zien dansen in de lichtstraal. Door de diffuse reflectie van zonlicht op stof wordt wat licht in de oogbol gebroken om een visueel beeld te produceren. Geïnspireerd door het principe van dit fenomeen 9,10, maakte deze studie een zachtlichtlamp en verlichtte de EB's zijdelings. Het bleek dat EV's visueel duidelijk konden zijn zonder de kijkkijker te beïnvloeden. Een secundaire stroom die naar het midden wijst, wordt in de vloeistof gegenereerd door de kweekplaat te roteren als gevolg van wervelstromen11. Oorspronkelijk verspreide EV's hopen zich op in het midden van de plaat. Op basis hiervan, en het fenomeen dat de sedimentatiesnelheid van organoïden sneller is dan die van cellen, wordt een eenvoudige werkwijze van mediumverandering en organoïde-overdracht zonder centrifugatie voorgesteld. De organoïden in het kweekmedium kunnen door deze overdrachtsoperatie effectief worden gescheiden van vrije cellen en dode celfragmenten.
Hier wordt een protocol voorgesteld dat gemakkelijk te bedienen is om cerebrale organoïden te genereren uit menselijke pluripotente stamcellen. De bedieningstechnologie werd geoptimaliseerd door het engineeringprincipe toe te passen, waardoor bewerkingen in 3D-cultuur net zo eenvoudig en haalbaar werden als die in de 2D-cultuur. De verbeterde vloeistofuitwisselingsmethode en organoïde-overdrachtsoperatie zijn ook nuttig voor andere soorten organoïde cultuur en het ontwerp van automatische kweekmachines.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol werd uitgevoerd naar aanleiding van de Verklaring van Helsinki. Goedkeuring werd verleend door de ethische commissie van het derde aangesloten ziekenhuis van de Guangzhou Medical University (medische en ethische beoordeling [2021] nr. 022). Vóór het experiment werd elk medium bereid volgens de formule12 van Juergen A. Knoblich (aanvullende tabellen 1-4), of werd een in de handel verkrijgbare cerebrale organoïde kit gebruikt (zie materiaaltabel). De iPSC's die in deze studie worden gebruikt, zijn eerder door ons laboratorium vastgesteld en hebben een geïnformeerde vrijstelling verkregen. De SCA3-iPSC's werden gegenereerd uit een 31-jarige vrouwelijke spinocerebellaire ataxie type 3 (SCA3) patiënt gegenotypeerd als herberger met 26/78 CAG-herhalingen in het ATXN3-gen13 (aanvullende figuur 1A). De normale menselijke iPSC's die in een vorig artikel werden genoemd, werden geselecteerd als NC-iPSC's14 en het ATXN3-gen werd geïdentificeerd als 14/14 CAG-herhalingen (aanvullende figuur 1B).
1. Bereiding van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's)
- Verzamel 3 ml perifeer bloed door venapunctie met de geïnformeerde toestemming van vrijwilligers en patiënten.
- Isoleer perifere mononucleaire bloedcellen volgens de Ficoll-Paque methode15.
- Stel iPSC's op volgens het protocol van de Sendai Reprogramming Kit (zie Materiaaltabel).
- Kweek de iPSC's met mTeSR1 medium in 35 mm petrischalen bedekt met Matrigel (een keldermembraanmatrix, zie Materiaaltabel). Verander het medium elke dag. De iPSC-groeidichtheid mag niet hoger zijn dan 75%.
- Verteer de cellen met PSC-dissociatie-oplossing (zie Tabel van materialen) en subcultureer ze in een verhouding van 1:5 elke 3-5 dagen.
LET OP: Sendai virus wordt hier gebruikt. Het moet worden gebruikt in de bioveiligheidskast en er moeten zelfbeschermingsmaatregelen worden genomen. Het moet duidelijk zijn of het legaal kan worden gebruikt in het lokale land. Lokale bioveiligheidswetten en -voorschriften moeten strikt worden gevolgd bij gebruik.
2. EB voorbereiding (dag 0-1)
- Verwijder het mTeSR1 medium uit de iPSC's met een pipet en was het 2x met 1 ml 1x PBS.
- Verwijder de PBS met een pipet en voeg 300 μL celloslatingsoplossing toe (zie materiaaltabel) om de iPSC's gedurende 3-4 minuten bij 37 °C in afzonderlijke cellen te verteren.
- Resuspensieer de cellen in 2 ml EB-formatiemedium (aanvullende tabel 1) en centrifugeer het monster vervolgens gedurende 5 minuten bij 300 x g (kamertemperatuur).
- Behandel de gespecialiseerde 24-well plaat met anti-hechting spoeloplossing (500 μL/put) gedurende 5 min (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Anti-adherence spoeloplossing is essentieel voor optimale EB- en sferoïdevorming. - Resuspensie van de cellen in EB-formatiemedium met Y-27632 (eindconcentratie, 10 μM, zie Tabel van materialen), met een celdichtheid van 1,5 x 106 cellen/ml.
- Verwijder de anti-hechtingsspoeloplossing en spoel elk putje af met 2 ml EB-formatiemedium.
- Voeg de cellen toe aan de gespecialiseerde 24-well platen met een dichtheid van 3 x 106 cellen/put (figuur 1A, links).
OPMERKING: Normaal gesproken kunnen in elke put 300 EV's worden bereid. Deze methode kan grote hoeveelheden EV's van dezelfde grootte bereiden. - Centrifugeer de plaat bij 100 x g gedurende 2 min bij kamertemperatuur. Verdeel de cellen in elke kamer aan de onderkant van de plaat gelijkmatig (figuur 1A, rechts).
OPMERKING: Als er geen geschikte centrifuge is, kan de plaat ook direct in de incubator worden geplaatst voor statische cultuur, maar de vormingstijd van de EB-bal zal enkele uren later zijn dan die bij normale centrifugatie. - Incubeer de monsters bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur. Als centrifugatie niet werd gebruikt in de vorige stap, incubeer dan gedurende 36 uur. Houd het monster stabiel en haal het in deze periode niet uit de incubator.
3. Voorbereiding van de zachtlichtlamp (dag 1)
- Gebruik een transparante acrylplaat met een dikte van 0,3-0,5 cm in het formaat van A5-papier. Plak witte pads op de voor- en achterkant van de acrylplaat.
- Installeer een rij witte LED-lampjes op de rand van de plaat, zodat de lichten vanaf de zijkant van de acrylplaat naar binnen kunnen komen en vervolgens parallel naar buiten kunnen schieten (aanvullende figuur 2A-F, figuur 1B).
OPMERKING: Aangezien de diameters van EV's in het vroege stadium ongeveer 200 μm tot 300 μm zijn, is het moeilijk om ze duidelijk met het blote oog onder de fluorescentielamp van schone banken waar te nemen. Door de verbetering van de diffuse reflectie daarentegen kunnen we de EB's duidelijk detecteren door zijdelings verlicht zacht licht te gebruiken (figuur 1B, C). Een 6-well plaat wordt aanbevolen voor EB-culturen in volgende experimenten. Om het visuele effect van zacht licht beter te laten zien, worden gerechten soms gebruikt om foto's en video's te maken in deze studie in plaats van borden, dus begrijp het alsjeblieft niet verkeerd. De zijdelings verlichte zachte lichtlamp kan ook worden gebruikt voor de 6-well plaat.
- Installeer een rij witte LED-lampjes op de rand van de plaat, zodat de lichten vanaf de zijkant van de acrylplaat naar binnen kunnen komen en vervolgens parallel naar buiten kunnen schieten (aanvullende figuur 2A-F, figuur 1B).
4. EB-overdracht en mediumvervanging (dag 2-5)
- Bereid een nieuwe 6-well lage hechtingsplaat voor en voeg 2 ml EB-formatiemedium toe aan elke put.
- Verwijder de EB's samen met het medium met een pipetpunt met brede boring van 1000 μL (zie Materiaaltabel) en breng ze over op de 6-well lage adhesieplaat (~ 100 EBs / put).
OPMERKING: Het bedrijfsproces maakt gebruik van een zachtlichtlamp (vermeld in stap 3.) om de EB's gemakkelijker waar te nemen. Schakel andere binnenlichtbronnen uit om het visuele effect van het zachte licht beter te krijgen. - Vervang elke dag door hetzelfde volume vers EB-formatiemedium. Gebruik de secundaire stroom om de EB's naar het midden te verzamelen en het medium te veranderen.
- Adem het oude medium op door langzaam naar de rand van de put te pipetteren. Zuig niet te hard; anders worden de EB's samen verwijderd. Voeg vervolgens vers medium toe om de EB's te resuspenderen.
OPMERKING: De belangrijkste secundaire stroom (figuur 1D). Induceer een wervelstroom door de schotel langs een cirkelvormige baan te draaien. Door de wervelstroom wordt een secundaire stroming geïnduceerd die naar het centrum is gericht. De EB's of organoïden convergeren naar het midden van de put vanwege de secundaire stroom die door rotatie wordt gegenereerd, waarna mediumverandering of embryoïde transfer gemakkelijk kan worden uitgevoerd.
- Adem het oude medium op door langzaam naar de rand van de put te pipetteren. Zuig niet te hard; anders worden de EB's samen verwijderd. Voeg vervolgens vers medium toe om de EB's te resuspenderen.
5. Pluripotentie controleren door labelen met pluripotentiemarker OCT4 (dag 4)
OPMERKING: Wanneer de diameter van de EB's groter is dan 300 μm, neem dan verschillende EV's voor OCT4 marker immunofluorescentiekleuring om hun pluripotentie te detecteren.
- Bevestig de EB's in 4% paraformaldehyde op 4 °C gedurende 30 minuten, gevolgd door wassen in 1x PBS 3x gedurende 10 minuten elke keer.
- Breng de EB's over naar PBS op kamertemperatuur met 0,3% Triton X-100 en 3% BSA gedurende 2 uur, gevolgd door wassen in PBS 3x gedurende 10 minuten elke keer.
OPMERKING: Na behandeling met Triton X-100 drijven de EB's op het vloeibare oppervlak en kunnen ze tijdens het reinigen gemakkelijk met de vloeistof worden weggezogen. Gebruik onder een stereomicroscoop wordt aanbevolen. - Verdun het oct4 primaire antilichaam (zie materiaaltabel) met 1 ml 1x PBS met 1% BSA in een verhouding van 1:200 en voeg toe aan de EB's voor incubatie bij 4 °C 's nachts, was vervolgens pbs 3x gedurende 10 minuten elke keer.
- Verdun het respectievelijke secundaire antilichaam (zie materiaaltabel) met 1x PBS op 1:500 en voeg 1 ml toe aan de EB's.
- Na 2 uur op kamertemperatuur te hebben geïncubeerd, wast u de cellen in 1x PBS 3x gedurende 10 minuten elke keer.
- Verwijder de PBS, voeg 2 ml 1x PBS-oplossing met 1 μg/ml DAPI toe, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en was vervolgens 3x in PBS gedurende 10 minuten.
- Verplaats de EB met een kleine hoeveelheid vloeistof op de dia, sluit de dia af met een afdekglas bedekt met in de handel verkrijgbare vaseline (zie Materiaaltabel) aan de rand en observeer en verzamel het beeld vervolgens onder de fluorescentie confocale microscoop.
OPMERKING: OCT4-expressie vertegenwoordigt EB-pluripotentie12. Wanneer de uitdrukking van OCT4 minder dan 90% bedraagt, moeten de EB's worden weggegooid en moeten de EV's opnieuw worden voorbereid.
6. Neurale inductie (dag 5-7)
- Bereid een nieuwe 6-wells plaat met lage hechting en voeg 3 ml neuraal inductiemedium (aanvullende tabel 2) toe aan elke put.
- Schakel het zijdelingse zachte licht in (vermeld in stap 3.) en schakel andere binnenlichtbronnen uit.
- Breng de EB's over op de 6-well plaat met toegevoegd neuraal inductiemedium (~ 100 EB / put). Voeg zo min mogelijk van het oorspronkelijke medium toe aan de nieuwe put.
OPMERKING: Introduceer eenvoudige vaardigheden vanorganoïde overdracht. Uiteraard zullen de geresuspendeerde EB's onder zwaartekracht en met een relatief hogere dichtheid dan het medium geleidelijk zinken door de in figuur 1E getoonde bewerking toe te passen. Vandaar dat de EB's gemakkelijk kunnen worden overgedragen. Omdat, in vergelijking met EB's, vrije cellen en dode celfragmenten langzamer zinken, kunnen de meeste vrije cellen en dode celfragmenten dus worden verwijderd via deze sedimentatiemethode (figuur 1F). - Incubeer de monsters bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
OPMERKING: Onder de microscoop was de diameter van de EB's ongeveer 500 μm en de rand was doorschijnend, wat aangeeft dat zich een neuro-epitheliale laag vormde. - Ga verder met de volgende stap.
7. Inbedding in de keldermembraanmatrix (dag 7-10)
- Plaats de membraanmatrix 60 minuten van tevoren in een koelkast van 4 °C om op te lossen. Bereken vooraf de hoeveelheid van de benodigde matrix. Ongeveer 100 EB's waren ingebed in 1,5 ml van de membraanmatrix.
- Schakel het zijdelingse zachte licht in en schakel de lichtbron aan de bovenkant van de console uit.
- Houd de membraanmatrix op ijs om stolling te voorkomen.
- Breng telkens een kleine hoeveelheid EB's over op een schaal van 60 mm met vers expansiemedium (aanvullende tabel 3). Verminder het aantal EB's om het gemakkelijker te maken om een enkele EB te verwijderen.
- Gebruik vervolgens een nieuwe 6-well lage hechtingsplaat. Zuig elke keer een enkele EB (met ongeveer 10 μL medium) met een 200 μL pipetpunt met brede boring (zie Materiaaltabel) en voeg deze vervolgens toe aan de onderkant van de 6-well plaat om druppels te maken. Gebruik vijf druppels per putje.
OPMERKING: De sleutel is om het bereik van het pipetpistool aan te passen tot 50 μL en een EB te zuigen en vervolgens te verwijzen naar de werking van figuur 1E. Wanneer de EB zich in de boring van de pipetpunt nestelt, raakt de punt snel de putbodem van de plaat en duwt ongeveer 10 μL vloeistof naar buiten om een druppel te vormen. - Voeg 15 μL van de membraanmatrix toe aan elke druppel die EB bevat en meng deze snel. Integreer de EB-bal in het midden van de druppel.
OPMERKING: EV's mogen niet worden aangezogen met een standaard pipetpunt, die de EB beschadigt. In plaats daarvan moet de 200 μL pipetpunt met brede boring worden gebruikt. - Plaats de 6-wells plaat gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C en stolt de membraanmatrixdruppeltjes met EB's.
- Voeg 3 ml van het expansiemedium toe aan elke put en blaas de in de matrix ingebedde EB's voorzichtig op om ze op te hangen.
- Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 3 dagen.
OPMERKING: Als ontluiking op het oppervlak van EB wordt waargenomen, betekent dit dat een uitgebreid neuro-epitheel is gevormd16.
8. Organoïde rijping (dagen 10-40)
- Verwijder voorzichtig het oorspronkelijke medium en voeg 3 ml rijpingsmedium (aanvullende tabel 4) toe aan elk putje.
- Plaats de organoïde plaat op een horizontale schudder in een incubator van 37 °C.
- Blijf de cultuur horizontaal roteren. Stel de shaker in op de juiste snelheid.
OPMERKING: Bij het kweken van cerebrale organoïden op een 6-well plaat is een relatieve centrifugale kracht (RCF) van 0,11808 x g meer geschikt, volgens de fabrikant van de horizontale shaker (zie Tabel van materialen). Volgens de conversie tussen de relatieve centrifugale kracht en rotatiesnelheid 17,18, RCF = 1,118 x 10−5 × R × rpm2, waarbij RCF = relatieve centrifugale kracht (g), rpm = omwentelingen per minuut (r/min) en R = rotatieradius (cm), ook wel shaking throw genoemd. De schudworpparameters van verschillende shakers kunnen verschillen. Daarom kan worden geschat dat het toerental rpm = 299 x (RCF/R)1/2 is. - Vervang het verse rijpingsmedium om de 2-3 dagen.
- Na 20-30 dagen kweekt u geleidelijk de cerebrale organoïden tot volwassenheid.
OPMERKING: Tijdens deze periode kunnen organoïden worden gebruikt voor experimenten en detectie, zoals neurale markerdetectie en transcriptoomsequencing 19,20,21.
9. Bevroren secties en immunofluorescentie van cerebrale organoïden
- Bevestig de organoïden in 4% paraformaldehyde op 4 °C gedurende 16 uur en was ze vervolgens 3x met 1x PBS gedurende 10 minuten per keer.
- Verwijder de PBS en dompel de organoïden een nacht onder in 30% sucrose bij 4 °C.
- Integreer de organoïden in 10%/7,5% gelatine/sucrose bij 37 °C gedurende 1 uur en breng ze vervolgens snel over naar de insluitvorm.
- Voeg droogijs toe aan 100% ethanol om een droogijs / ethanol slurry te bereiden en plaats de organoïde monsters erin voor snel invriezen.
- Bewaar de bevroren monsters in een -80 °C vriezer. Maak indien nodig bevroren secties met een dikte van 20 μm.
- Raadpleeg stappen 5.3.-5.5. voor immunofluorescentie. Gebruik het PAX6-antilichaam om apicale voorlopercellen te labelen, het TUJ1-antilichaam (zie Materiaaltabel) om neuronale cellen 22,23,24 te labelen en DAPI voor nucleaire DNA-kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De huidige studie induceerde iPSC's (figuur 2B) in cerebrale organoïden (figuur 2C). De in een vroeg stadium gekweekte EB's drukten de OCT4-marker (figuur 2A) uit, wat duidde op een goede pluripotentie. In het latere stadium ontwikkelden de EB's zich tot volwassen cerebrale organoïden (figuur 2D). Het onderzoek kweekte iPSC's van normale gezonde personen en SCA3-patiënten tot cerebrale organoïden (figuur 3A). SCA3, ook bekend als de ziekte van Machado-Joseph (MJD), is een neurodegeneratieve aandoening die wordt veroorzaakt door een polyglutamine-expansie in het ATXN3-gen25. De RNA-seq-gegevens (geüpload naar een openbare opslagplaats, zie Tabel van materialen) onthulden significante verschillen in genexpressieprofielen tussen de normale cerebrale organoïdegroep en de SCA3-cerebrale organoïdegroep in routes zoals neurotransmittertransport, synapsvorming en regulatie (figuur 3B). Cufflinks-software werd gebruikt om het genexpressieniveau en -verschil te berekenen26. DEseq2 werd verder gebruikt om de gegevens te analyseren27.
Figuur 1: Geoptimaliseerde mediumveranderings- en overdrachtsbewerkingen van EB's. (A) EB-voorbereiding. De iPSC's werden verteerd en toegevoegd aan de gespecialiseerde 24-well platen (links). De cellen vormden EB's (rechts). De schaalbalk is 400 μm. (B) Schematisch diagram van zijdelings verlicht zacht licht om te helpen bij het observeren van organoïden. (C) De EB's werden waargenomen met verschillende lichtbronnen. Gele pijl: zijdelings verlicht licht; rode pijl: donkere achtergrond; groene pijlen: EB's. (D) Een wervelstroom wordt geïnduceerd door de schotel langs een cirkelvormige baan te draaien. Door de wervelstroom wordt een secundaire stroom naar het centrum geïnduceerd. De EB's convergeren naar het midden van de schotel, aangedreven door de secundaire stroom die door rotatie wordt gegenereerd. Witte pijlen: EB's. (E) Organoïde overdracht. (I) Ten eerste wordt een pipetpunt met brede mond gebruikt om de mengseloplossing op te zuigen, met inbegrip van zowel de EB's als het kweekmedium. (II) Vervolgens, terwijl de pipet rechtop wordt gehouden, zinken de EB's geleidelijk onder het zwaartekrachteffect en convergeren ze naar de mond van de pipetpunt. (III) Als de mond van de pipetpunt het vloeibare (meestal het verse medium) oppervlak weer raakt, en als gevolg van vloeistofoppervlakspanning, (IV) zinken de EB's snel in het medium (geen extra uitblazen nodig door handmatig pipetteren). Rode lijn: het vloeistofniveau; gele pijlen: EB's. (F) Aangezien vrije cellen en dode celfragmenten langzamer zinken dan EV's, kunnen de meeste vrije cellen en dode celfragmenten dus worden verwijderd via de bovengenoemde sedimentatiemethode om de embryoïde overdracht te vergemakkelijken. Het rode vak in de rechterbovenhoek is een vergrote afbeelding. De schaalbalk is 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Inductie van iPSC's in cerebrale organoïden. (A) Immunofluorescentiekleuring van EB's. OCT4: octameerbindende transcriptiefactor-4; DAPI: DAPI dihydrochloride. De schaalbalk is 100 μm. (B) iPSC's. De schaalbalk is 400 μm. (C) Cerebrale organoïden. De schaalbalk is 200 μm. (D) Immunofluorescentiekleuring van cerebrale organoïden. PAX6: gepaarde box 6 is de marker van apicale voorlopercellen; TUJ1: neuron-specifieke klasse III β-tubuline is een neuron-specifieke marker. De schaalbalk is 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Teelt van iPSC's van gezonde personen en SCA3-patiënten tot cerebrale organoïden. (A) Verschillende stadia die betrekking hebben op de rijping van cerebrale organoïden vanaf EB's. NC: normale groep; SCA3: SCA3/MJD groep. Schaalbalken van afbeeldingen met een lage en hoge vergroting zijn respectievelijk 400 μm en 200 μm. (B) GO-verrijkingsanalysekaart van down-gereguleerde, differentieel tot expressie gebrachte genen tussen normale organoïden en SCA3-organoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Identificatie van ATXN3 CAG herhaalt zich door capillaire elektroforese. (A) De SCA3-patiënt iPSC (SCA3-iPSC) werd geïdentificeerd met 26/78 CAG-herhalingen in het ATXN3-gen. (B) De normale humane iPSC (NC-iPSC) werd geïdentificeerd met 14/14 CAG-herhalingen in het ATXN3-gen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Voorbereiding van de zachtlichtlamp. (A) De voeding en de LED-lampjes werden aan één kant van de acrylplaat geïnstalleerd (zoals weergegeven in het rode stippelvak). De verstrooiingsgolflengte van de LED-zachtlichtlamp is 450-470 nm, de lichtstroom is 1300-1800 lm en de kleurweergave-index is 75-85 Ra. (B) Er werd gecontroleerd of de LED-lampen normaal konden branden (zoals weergegeven in het rode gestippelde vak). (C) Op de voor- en achterkant van de acrylplaat werd een witte pad geplakt (zoals aangegeven door de rode pijlen). (D) Het algemene uiterlijk van de lamp met zacht licht. (E) De zachtlichtlamp kan ook worden vervangen door een commerciële LED-schilderlamp zonder lijst, die meestal wordt gebruikt voor het volgen bij het kopiëren van schetsen. Een laag witte film moet direct boven het LED-schilderlichtkussen worden geplakt. F) De zachte lichtlamp aan het werk. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Samenstelling van het EB-formatiemedium. In het beginstadium van eb-vorming (meestal de eerste 2 dagen) moeten Y-27632 (50 μM) en bFGF (4 ng/ml) aan het EB-vormingsmedium worden toegevoegd. Het medium moet worden gefilterd met een filtereenheid van 0,2 μm en worden bewaard bij −20 °C. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Samenstelling van het neurale inductiemedium. Het medium moet worden gefilterd met een filtereenheid van 0,2 μm en worden bewaard bij −20 °C. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 3: Samenstelling van het expansiemedium. Een 1:100 verdunning van 2-Mercaptoethanol werd bereid in DMEM-F12, en 87,5 μL hiervan werd toegevoegd aan het expansiemedium. B27 mag geen vitamine A bevatten. Het medium moet worden gefilterd met een filtereenheid van 0,2 μm en worden bewaard bij −20 °C. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 4: Samenstelling van het rijpingsmedium. Een 1:100 verdunning van 2-Mercaptoethanol in DMEM-F12 werd bereid en 87,5 μL hiervan werd toegevoegd aan het rijpingsmedium. B27 mag geen vitamine A bevatten. Het medium moet worden gefilterd met een filtereenheid van 0,2 μm en worden bewaard bij −20 °C. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cerebrale organoïden openen nieuwe wegen voor medisch onderzoek. Veel nuttige toepassingen van deze technologie beginnen pas te worden onderzocht28. Uit dit onderzoek bleek dat de transcriptoomsequencingresultaten van genetisch zieke cerebrale organoïden en normale cerebrale organoïden de verschillen tussen ziekte en gezondheid kunnen weerspiegelen. De resultaten van de RNA-seq-gegevensanalyse (figuur 3B) zijn bijvoorbeeld consistent met veel gerapporteerde studies over SCA3-ziekten 29,30,31,32. Experimentele operaties, zoals mediumverandering, EB-overdracht en wrapping, zijn cruciaal voor het cultiveren van cerebrale organoïden en het bepalen of organoïden met een goede uniformiteit kunnen worden bereid33,34. In deze studie wordt een cerebraal organoïde protocol geïntroduceerd dat mediumverandering en organoïde overdracht vergemakkelijkte. Een laterale zachte lichtlamp kan enorm helpen bij de werking van organoïde cultuur. Het is echter niet moeilijk om te maken, de LED-schilderlichtpad en eenvoudige verwerking kunnen deze ook vervangen. De eenvoudige vloeistofuitwisselingsmethode en organoïde overdracht maken het hele kweekproces eenvoudiger. De toepassing van cerebrale organoïden wordt vaak beïnvloed door het probleem van slechte uniformiteit35. Het grootste verschil tussen deze studie en andere cerebrale organoïde kweekrichtlijnen is dat de focus ligt op het optimaliseren van de operatie om het experiment herhaalbaarder te maken.
Het is erg belangrijk om de stabiliteit van het cultuursysteem te behouden. Als de omstandigheden het toelaten, wordt voorgesteld om prioriteit te geven aan het commerciële cerebrale organoïde medium, dat de grote verschillen in experimentele resultaten in verschillende batches effectief kan verminderen als gevolg van de instabiliteit van het medium. Bovendien mag cerebrale organoïde mediumopslag bij 4 °C niet langer dan 2 weken duren; anders zal het de stabiliteit van het cultuursysteem aantasten. Natuurlijk is het ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de gebruikte iPSC's pluripotent zijn in plaats van gedifferentieerd. OCT4 immunofluorescentie detectie kan worden gebruikt. Als OCT4-positieve cellen minder dan 90% zijn, wordt aanbevolen om ze te vervangen door iPSC's van hogere kwaliteit en cerebrale organoïden opnieuw te kweken.
Er zijn enkele beperkingen in de cerebrale organoïde cultuurtechnologie die in deze studie is geïntroduceerd. Cerebrale organoïden kunnen bijvoorbeeld niet intensief worden gekweekt in het latere stadium van ontwikkeling, wat een verspilling van cultuurruimte is. Dit is ook een dringend probleem dat moet worden opgelost bij het toepassen van cerebrale organoïden. Als veel cerebrale organoïden holle expansie vertonen, wordt het aantal organoïden in elke put verminderd, neemt de gemiddelde uitwisselingsfrequentie toe en bevinden de organoïden zich in een niet-hypoxische toestand met voldoende voedingsstoffen.
Deze studie is een operationele aanvulling op veel bestaande cerebrale organoïde kweekmethoden 12,36,37 en zelfs andere soorten orgaankweekmethoden38,39. Dit zal in de toekomst helpen bij het ontwikkelen van geautomatiseerde organoïde kweeksystemen en het bevorderen van het onderzoek en de toepassing van organoïden. Als de technologie van het verbeteren van het lichtverspreidische reflectie-effect van organoïden wordt gebruikt in het automatische intelligente teeltsysteem, kan het theoretisch de zeer nauwkeurige beeldversterkingscamera vervangen en hoeft alleen een gewoon beeldherkenningsapparaat te worden geïnstalleerd. Bovendien zijn mediumuitwisseling en organoïde overdracht door secundaire stroming gegenereerd door rotatie en natuurlijke sedimentatie op de zuigkop theoretisch haalbaarder dan centrifugatie in toekomstige automatische kweekapparatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (Grant No. 2020A0505100062), het Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (Grant No. 201904020025), de National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31872800, 32070582, 82101937) en het Guangzhou City Postdoctoral Research Grant-project (aan Bangzhu Chen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7.1 (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W.
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L.
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, Pt 11 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B.
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
