Summary
Le présent protocole décrit l’optimisation des paramètres expérimentaux lors de l’utilisation de la stimulation auriculaire transœsophagienne pour évaluer la susceptibilité à la fibrillation auriculaire chez la souris.
Abstract
Les modèles murins de facteurs de risque génétiques et acquis de fibrillation auriculaire (FA) se sont révélés utiles pour étudier les déterminants moléculaires de la FA. La stimulation électrique programmée peut être réalisée en utilisant la stimulation auriculaire transœsophagienne comme procédure de survie, permettant ainsi des tests en série sur le même animal. Cependant, de nombreux protocoles de stimulation existent, ce qui complique la reproductibilité. Le présent protocole vise à fournir une stratégie normalisée pour développer des paramètres expérimentaux spécifiques au modèle afin d’améliorer la reproductibilité entre les études. Des études préliminaires sont effectuées pour optimiser les méthodes expérimentales du modèle spécifique à l’étude, y compris l’âge au moment de l’étude, le sexe et les paramètres du protocole de stimulation (p. ex. mode de stimulation et définition de la susceptibilité à la FA). Il est important de noter que l’on prend soin d’éviter les énergies de stimulation élevées, car cela peut provoquer une stimulation du plexi ganglionnaire avec une activation parasympathique par inadvertance, se manifestant par un bloc auriculo-ventriculaire (AV) exagéré pendant la stimulation et souvent associé à une induction artificielle de la FA. Les animaux présentant cette complication doivent être exclus de l’analyse.
Introduction
La fibrillation auriculaire (FA) représente une dernière voie commune pour de multiples facteurs de risque acquis et génétiques. Pour les études portant sur les mécanismes physiopathologiques du substrat de la FA, les modèles murins sont avantageux compte tenu de la facilité de manipulation génétique et du fait que, en général, ils reproduisent la susceptibilité à la FA observée chez l’homme pour différents phénotypes cliniques 1,2,3. Cependant, les souris développent rarement une AF4 spontanée, ce qui nécessite l’utilisation d’études de stimulation auriculaire provocatrices.
La stimulation électrique programmée (PES) peut être effectuée pour évaluer l’électrophysiologie auriculaire murine et la susceptibilité à la FA en utilisant une stimulation intracardiaque5 ou transœsophagienne6. Si l’approche transœsophagienne est particulièrement avantageuse comme procédure de survie, son utilisation est compliquée par les nombreux protocoles expérimentaux publiés 7,8 et les sources de variabilité qui peuvent entraver la reproductibilité9. De plus, les comparaisons limitées des protocoles rapportés rendent difficile le choix d’un protocole de stimulation approprié.
Le protocole actuel vise à utiliser une stratégie systématique pour développer des méthodes de PES transœsophagiennes spécifiques au modèle pour évaluer la susceptibilité à la FA murine afin d’augmenter la reproductibilité. Il est important de noter que des études pilotes initiales sont réalisées pour optimiser le protocole de stimulation en tenant compte de l’âge, du sexe et de la variabilité du mode de stimulation, avec une stimulation parasympathique conçue pour minimiser la stimulation parasympathique accidentelle qui peut confondre les résultats9.
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Protocol
Cette procédure a été approuvée par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Établissement Vanderbilt et est conforme au Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole a été élaboré à l’aide de modèles murins génétiques9 etacquis de 10 (p. ex. hypertension) de susceptibilité à la FA. L’opérateur a été aveuglé par le phénotype de la souris étudiée.
1. Sélection des animaux
- Pour les modèles génétiques, soumettre les souris à une stimulation auriculaire bihebdomadaire (c.-à-d. toutes les deux semaines) comme décrit ci-dessous (voir l’étape 6.) afin de déterminer la période optimale de susceptibilité à la FA.
- Commencez les cent pas toutes les deux semaines à l’âge de 8 semaines. Utilisez des compagnons de portée de type sauvage comme témoins pour réduire la variabilité. Étudiez les deux sexes, car il se peut que l’on ne développe pas de phénotypeAF 9.
- Pour les modèles acquis, effectuer un rythme après que les souris ont atteint la maturité physique (~12 semaines)10. Comme mentionné ci-dessus, étudiez les deux sexes.
- Au cours de ces études préliminaires, effectuez à la fois la stimulation en rafale8 (en utilisant une longueur de cycle de stimulation fixe [CL]) et la stimulation décrémentielle7 (avec une CL de stimulation progressivement plus courte) pour déterminer le mode de stimulation optimal. Séparer chaque procédure par un minimum de 24 h.
REMARQUE: À mesure qu’un nombre croissant de souris sont étudiées, examinez les données accumulées pour déterminer l’âge, le sexe et le mode de stimulation optimaux qui favorisent la FA chez les souris sensibles à la FA, mais pas chez les témoins.- Analyser les données à l’aide de plusieurs définitions de la susceptibilité à la FA (p. ex., nombre d’épisodes de FA8, durée totale dela FA 9, incidence de la FA4 et incidence de la FA soutenue, communément définie comme 10 s 11 ou 15 s 12, et même jusqu’à 5 min13,14), car certains modèles peuvent afficher un phénotype de FA pour une définition, mais pas pour toutes les définitions9.
REMARQUE :La définition d’un épisode de FA et la sensibilité à la FA diffèrent d’une étude publiéeà l’autre 4,7. Les épisodes 8 de FA sont généralement définis comme une activité auriculaire rapide avec une réponse ventriculaire irrégulière irrégulière survenant pendant au moins1s (Figure 1). En plus de la FA, la stimulation auriculaire peut également induire un flottement auriculaire avec une réponse ventriculaire régulière ou irrégulière.
- Analyser les données à l’aide de plusieurs définitions de la susceptibilité à la FA (p. ex., nombre d’épisodes de FA8, durée totale dela FA 9, incidence de la FA4 et incidence de la FA soutenue, communément définie comme 10 s 11 ou 15 s 12, et même jusqu’à 5 min13,14), car certains modèles peuvent afficher un phénotype de FA pour une définition, mais pas pour toutes les définitions9.
- Utiliser les paramètres optimisés propres au modèle et la définition de la sensibilité à la FA pour les études ultérieures sur d’autres souris.
2. Préparation des animaux
- Anesthésier la souris dans une chambre à induction en utilisant de l’isoflurane à 3 % (voir le tableau des matières) dans 1 L/min d’oxygène à 100 %.
NOTE: L’isoflurane est nocif. Il peut irriter la peau ou les yeux et peut causer des étourdissements, de la fatigue et des maux de tête, entre autres toxicités du système nerveux central. Utiliser dans un endroit bien ventilé avec une méthode de récupération appropriée (p. ex. cartouche de charbon actif). - Après la perte du réflexe de pédale, placez la souris en décubitus dorsal sur un coussin chauffant conçu pour maintenir la température corporelle à environ 37 °C avec les membres postérieurs collés à la surface du coussinet.
- Appliquez une pommade oculaire lubrifiante sur les yeux pour éviter le dessèchement.
- Placez solidement un masque anesthésique sur le nez de la souris. Commencer l’entretien de l’anesthésie en utilisant 1% d’isoflurane dans 1 L/min d’oxygène à 100%. Assurez-vous que les narines sont exemptes d’obstruction car les souris sont obligées de respirer le nez.
- Obtenir un électrocardiogramme de surface (ECG, dérivation I) par la mise en place sous-cutanée d’électrodes à aiguille ECG de 27 G (voir Tableau des matériaux) reliées à un amplificateur biologique et à du matériel d’acquisition de données dans les membres antérieurs. Mettez le signal à la terre en plaçant une électrode à aiguille dans le membre postérieur gauche.
3. Mise en place du cathéter
- Retirez brièvement le masque isoflurane de la souris.
- Insérez dans l’œsophage un cathéter à électrode octapolaire 2-F (largeur et espacement des électrodes = 0,5 mm) relié à un stimulateur et à un isolateur de stimulus (voir le tableau des matériaux) (figure 2).
- Insérez à une profondeur qui se rapproche de la distance de la bouche (avec le cou tendu) juste au-dessus du cartilage xiphoïde.
- Repositionnez le masque d’isoflurane sur les narines de la souris.
- Commencer l’acquisition des données par l’enregistrement continu de la dérivation ECG I à l’aide d’un logiciel d’analyse (voir le tableau des matériaux).
- Réglez le mode isolateur de stimulus sur bipolaire. Utilisez la paire d’électrodes la plus distale pendant la stimulation.
- Positionnez correctement le cathéter dans l’œsophage pour permettre la capture. Pour ce faire, appliquez un stimulus de 1,5 mA avec une largeur d’impulsion de 2 ms à une CL légèrement plus courte que la CL sinusale (par exemple, utilisez une CL de 100 ms si la CL sinusale est de 120 ms). Positionner soigneusement le cathéter jusqu’à ce que la capture auriculaire soit constante.
4. Détermination du seuil
- Pour déterminer le seuil de capture diastolique auriculaire (TH), initier la stimulation à 1,5 mA avec une largeur d’impulsion de 2 ms au CL utilisé pour la capture auriculaire. Diminuer l’amplitude du stimulus par incréments de 0,05 mA jusqu’à la perte de la capture auriculaire, avec augmentation ultérieure jusqu’à la capture.
NOTE: L’amplitude la plus faible à laquelle une capture auriculaire cohérente est obtenue est le TH auriculaire. En raison de la préoccupation pour la stimulation parasympathique à des amplitudes de stimulus élevées, qui se traduit par un blocage excessif de l’AV pendant la stimulation avec induction artificielle de la FA 9, le TH maximal acceptable estde 0,75 mA. Si nécessaire, repositionner le cathéter pour obtenir un TH ≤0,75 mA. - Ajustez l’amplitude du stimulus à deux fois TH.
5. Détermination des propriétés électrophysiologiques
- Mesurer les paramètres électrophysiologiques, y compris le temps de récupération du nœud sinusal (SNRT), la longueur du cycle de Wenckebach (WCL) et la période réfractaire effective auriculo-ventriculaire (AVERP) avant la stimulation auriculaire rapide pour l’induction de la FA15.
6. Susceptibilité à l’arythmie auriculaire
- Effectuer une stimulation à deux fois TH avec une largeur d’impulsion de 2 ms en utilisant soit une stimulation en rafale à différentes CL, soit une stimulation décrémentielle déterminée par les études initiales (étapes 1.1.-1.4.).
- Pour la cadence en rafale, allure à une CL initiale de 50 ms pendant 15 s et les trains suivants se produisant à des CL de 40 ms, 30 ms, 25 ms, 20 ms et 15 ms 8,10. Interrompez le rythme pendant 30 s après chaque train pour permettre la récupération avant de continuer. Si la mise au point automatique se produit après un train de stimulation, attendez 30 s après la fin avant de procéder à la stimulation suivante.
- Pour un rythme décrémentiel, rythmer à une CL de 40 ms et diminuer la CL de 2 ms toutes les 2 s jusqu’à la fin à 20 ms7. Effectuer des trains en triple16 ou quintuple17, avec une pause de 30 s pour la récupération après chaque train. Comme ci-dessus, si la FA se développe, attendez 30 s après la fin avant de continuer.
REMARQUE : Lors de l’optimisation des paramètres de protocole au cours d’expériences préliminaires (c.-à-d. étapes 1.1.-1.5.), effectuez un rythme décrémentiel avec cinq trains. Effectuer une analyse a posteriori pour déterminer si trois ou cinq trains offrent la plus grande sensibilité. - Terminez la procédure après 30 s de rythme sinusal après le dernier train de stimulation ou après un épisode de FA de 10 minutes, selon la première éventualité.
7. Post-procédure
- Arrêtez l’acquisition de données.
- Retirez délicatement le cathéter et les électrodes ECG.
- Arrêtez l’anesthésie.
- Placez la souris anesthésiée dans une cage et observez pendant 10 minutes pour assurer la récupération.
- Enregistrez le fichier de données. Dans le cas d’un test sériel, attendez au moins 24 heures avant de répéter la procédure de stimulation.
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Representative Results
Les études de stimulation auriculaire transœsophagienne évaluent les propriétés électrophysiologiques des ganglions SA et AV en déterminant la SNRT et l’AVERP, ainsi que la susceptibilité à la FA6 (Figure 1). L’enregistrement ECG permet de mesurer la durée de l’onde P, l’intervalle PR, la durée QRS et les intervalles QT/QTc. L’enregistrement continu de l’ECG pendant la stimulation auriculaire rapide peut fournir les mesures suivantes de la vulnérabilité à la FA : le nombre d’épisodes induits au cours de l’étude, la durée cumulative et moyenne des épisodes et le nombre d’épisodes de FA soutenus. Les épisodes de blocage excessif de l’AV pendant la stimulation peuvent démontrer des périodes de stimulation parasympathique induite par la stimulation (Figure 3), ce qui signifie que la FA associée est un artefact de ce phénomène plutôt que la physiopathologie du modèle lui-même9.
Figure 1 : Résultats représentatifs de la stimulation auriculaire. Enregistrements ECG de surface représentant (A) le rythme sinusal et (B) la fibrillation auriculaire après une stimulation auriculaire rapide. La vitesse de stimulation dépasse Wenckebach CL, ce qui entraîne la perte de la conduction ganglionnaire AV 1:1 pendant la stimulation. L’artefact de base est lié à la respiration de la souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Représentation visuelle du cathéter transœsophagien et de sa proximité avec le plexi ganglionnaire. (A) Une photographie représentant le cathéter octapolaire 2-F. (B) Représentation de la proximité du cathéter avec le plexi ganglionnaire postérieur gauche gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Résultats représentatifs d’un blocage excessif de l’AV au cours d’une stimulation auriculaire rapide. Enregistrements ECG de surface démontrant un rythme auriculaire avec (A) et sans (B) bloc AV excessif qui peut se produire pendant la stimulation auriculaire, en particulier pendant la stimulation avec une intensité de stimulus plus élevée et à des CL courtes. Les flèches rouges indiquent les complexes QRS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La stimulation auriculaire transœsophagienne permet non seulement des études en série chez le même animal, mais sa durée est généralement plus courte que les études intracardiaques (~20 min), minimisant ainsi l’utilisation d’anesthésiques et ses effets sur les paramètres électrophysiologiques.
Il est essentiel d’optimiser initialement les méthodes pour chaque modèle de souris. Le vieillissement augmente l’inducibilité de la FA chez les souris normales18,19, et les modèles génétiques individuels peuvent démontrer l’inductibilité de la FA sur une période de temps limitée. La réalisation d’études pilotes toutes les deux semaines peut déterminer une fenêtre d’âge pendant laquelle la souris phénotype AF est inductible, mais pas les souris témoins. Le sexe peut être un facteur déterminant, car l’un ou les deux sexes peuvent afficher une AF9 inductible. En outre, des souris spécifiques peuvent présenter une sensibilité à la FA en réponse à un seul type de mode de stimulation, tandis que d’autres démontrent une sensibilité à la FA à un mode différent ou à plusieurs modes9.
Au cours d’une stimulation auriculaire rapide, les souris peuvent présenter un blocage AV excessif qui coïncide souvent avec l’induction de la FA. Ce phénomène est causé par une stimulation involontaire du plexi ganglionnaire situé sur l’oreillette postérieure gauche, entraînant une activation parasympathique9. Un bloc AV significatif est défini comme une bradycardie ventriculaire qui dure ≥10% d’un seul train de stimulation et est le plus souvent rencontrée lors de la stimulation avec des intensités de stimulus élevées et à des CL à courte allure. Ce type d’induction d’arythmie augmente l’incidence de la FA chez les souris témoins et provoque une plus grande variabilité de l’arythmie au sein d’un groupe expérimental. Compte tenu de ces caractéristiques contaminantes, les animaux qui souffrent de FA dans ces conditions doivent être exclus de l’analyse.
Si un blocage AV profond se produit pendant la stimulation malgré TH ≤0,75 mA, il est raisonnable de réduire l’amplitude de stimulation à 1,5x TH7. De plus, si aucun phénotype AF n’est observé au cours des expériences préliminaires, il est concevable de réessayer en utilisant 10 ms comme CL16 à plus faible rythme. Si aucun phénotype de FA n’est observé à l’âge de 12 semaines pour un modèle acquis, envisager des études préliminaires bihebdomadaires pour explorer les effets de l’augmentation de la maturité du phénotype20.
Une limite de cette approche est l’utilisation de l’anesthésie à l’isoflurane. L’isoflurane est connu pour supprimer la fonction autonome21, et cet effet ne peut être exclu malgré une exposition relativement courte. Ce protocole représente le premier rapport détaillé d’une stratégie optimisée pour développer des méthodes de PES transœsophagiennes chez la souris. Bien que cette étude se concentre sur la susceptibilité à la FA, les applications futures de ce protocole pourraient être utilisées pour évaluer les arythmies ventriculaires22,23.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La figure 2 a été créée avec BioRender.com. Ce travail a été soutenu par des subventions du National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health (HL096844 et HL133127); l’American Heart Association (2160035, 18SFRN34230125 et 903918 [MBM]); et le National Center for Advancing Translational Sciences du National Institute of Health (UL1 TR000445).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G ECG electrodes | ADInstruments | MLA1204 | |
| 2-F octapolar electrode catheter | NuMED | CIBercath | |
| Activated carbon canister | VetEquip | 931401 | |
| Analysis software | ADInstruments | LabChart v8.1.13 | |
| Biological amplifier | ADInstruments | FE231 | |
| Data acquisition hardware | ADInstruments | PowerLab 26T | |
| Eye ointment | MWI Veterinary | NC1886507 | |
| Heating pad | Braintree Scientific | DPIP | |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Stimulator | Bloom Associates | DTU-210 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | Model A365 |
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