Summary
本プロトコルは、マウスにおける心房細動感受性を評価するために経食道心房ペーシングを使用する場合の実験パラメータの最適化を記載する。
Abstract
心房細動(AF)の遺伝的および後天的危険因子のマウスモデルは、AFの分子決定要因の研究において価値があることが証明されています。プログラムされた電気刺激は、生存手順として経食道心房ペーシングを使用して実行できるため、同じ動物での連続試験が可能になります。ただし、ペーシングプロトコルが多数存在するため、再現性が複雑になります。本プロトコルは、研究間の再現性を向上させるためにモデル固有の実験パラメータを開発するための標準化された戦略を提供することを目的としています。予備研究は、研究時の年齢、性別、およびペーシングプロトコルのパラメーター(例えば、ペーシングのモードおよびAF感受性の定義)を含む、調査中の特定のモデルの実験方法を最適化するために実施される。重要なことに、これは不注意な副交感神経叢の活性化を伴う神経節神経叢の刺激を引き起こす可能性があり、ペーシング中の誇張された房室(AV)ブロックによって現れ、しばしば人工的なAF誘導に関連するため、高い刺激エネルギーを避けるように注意が払われます。この合併症を示す動物は分析から除外する必要があります。
Introduction
心房細動(AF)は、複数の後天性および遺伝的危険因子の最終的な共通経路を表します。AF基質の病態生理学的メカニズムを調査する研究では、マウスモデルは、遺伝子操作の容易さおよび一般に、異なる臨床表現型についてヒトで観察されるAF感受性を再現するという事実を考えると有利である1,2,3。しかし、マウスが自発的なAF4を発症することはめったになく、挑発的な心房ペーシング研究の使用が必要です。
プログラムされた電気刺激(PES)を実行して、心臓内5または経食道6ペーシングのいずれかを使用して、マウス心房電気生理学およびAF感受性を評価することができます。経食道アプローチは生存手順として特に有利であるが、その使用は、多数の公開された実験プロトコル7,8および再現性を妨げる可能性のある変動性の原因9によって複雑である。さらに、報告されたプロトコルの比較が限られているため、適切なペーシングプロトコルを選択することは困難です。
現在のプロトコルは、再現性を高めるためにマウスAF感受性を評価するためのモデル固有の経食道PES法を開発するための体系的な戦略を利用することを目的としています。重要なことに、最初のパイロット研究は、年齢、性別、およびペーシングモードの変動性を考慮してペーシングプロトコルを最適化するために実行され、ペーシングは結果を混乱させる可能性のある不注意な副交感神経刺激を最小限に抑えるように設計されています9。
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Protocol
この手順は、ヴァンダービルト施設動物管理および使用委員会によって承認され、実験動物の世話と使用に関するガイドと一致しています。このプロトコルは、遺伝的9 と取得したAF感受性の10 (例えば、高血圧)マウスモデルの両方を使用して開発されました。オペレーターは、研究中のマウスの表現型を知らされていませんでした。
1.動物の選択
- 遺伝子モデルの場合、マウスを隔週(すなわち、隔週)に供し、以下に述べるような心房ペーシング(ステップ6を参照されたい)して、AF感受性の最適な期間を決定する。
- 8週齢で隔週のペーシングを開始します。野生型の同腹仔を対照として使用して、変動性を減らします。AF表現型9を発症しない可能性があるため、男女ともに研究してください。
- 獲得モデルでは、マウスが身体的成熟(~12週齢)に達した後にペーシングを実施します10。上記のように、男女両方を研究してください。
- これらの予備調査では、バーストペーシング8 (固定ペーシングサイクル長[CL]を使用)とデクリメンタルペーシング7 (ペーシングCLを徐々に短く)の両方を実行して、最適なペーシングモードを決定します。各手順を最低24時間離します。
注:研究されるマウスの数が増えるにつれて、蓄積されたデータを確認して、AF感受性マウスでAFを促進するが対照では促進しない最適な年齢、性別、およびペーシングモードを決定します。- 一部のモデルでは、すべての定義9ではなく1つのAF表現型が表示される可能性があるため、AF感受性の複数の定義(たとえば、AFエピソードの数8、合計AF継続時間9、AF発生率4、および持続AF発生率、一般に10秒11または15秒12、さらには最大5分13,14と定義)を使用してデータを分析します。
注:AFエピソードの定義とAF感受性は、発表された研究間で異なります4,7。AFエピソード8は、一般的に、少なくとも1秒間発生する不規則な不規則な心室反応を伴う急速な心房活動として定義されます(図1)。AFに加えて、心房ペーシングはまた、定期的または不規則な心室反応のいずれかで心房粗動を誘発する可能性があります。
- 一部のモデルでは、すべての定義9ではなく1つのAF表現型が表示される可能性があるため、AF感受性の複数の定義(たとえば、AFエピソードの数8、合計AF継続時間9、AF発生率4、および持続AF発生率、一般に10秒11または15秒12、さらには最大5分13,14と定義)を使用してデータを分析します。
- 最適化されたモデル固有のパラメーターとAF感受性の定義を使用して、追加のマウスでのその後の研究を行います。
2.動物の準備
- 1 L / minの100%酸素で3%イソフルラン( 材料の表を参照)を使用して、誘導チャンバーでマウスを麻酔します。
注:イソフルランは有害です。皮膚や目を刺激する可能性があり、他の中枢神経系の毒性の中でも、めまい、倦怠感、頭痛を引き起こす可能性があります。適切な清掃方法(活性炭キャニスターなど)を使用して換気の良い場所で使用してください。. - ペダル反射を失った後、後肢をパッド表面にテープで留めた状態で、体温を約37°Cに維持するように設計された加熱パッドの上にマウスを仰臥位に置きます。
- 乾燥を防ぐために、潤滑性の目の軟膏を目に塗ります。
- 麻酔マスクをマウスの鼻の上にしっかりと置きます。100%酸素1L /分で1%イソフルランを使用して麻酔の維持を開始します。マウスは義務的な鼻呼吸者であるため、鼻孔に閉塞がないことを確認してください。
- 生物学的アンプとデータ収集ハードウェアに接続された27 G ECG針電極( 材料の表を参照)を前肢に皮下配置することにより、表面心電図(ECG、リードI)を取得します。左後肢に針電極を配置して信号を接地します。
3.カテーテル留置
- マウスからイソフルランマスクを簡単に取り外します。
- 刺激装置と刺激アイソレーター( 材料の表を参照)に接続された2-Fオクタポーラ電極カテーテル(電極の幅と間隔= 0.5 mm)を食道に挿入します(図2)。
- 口から(首を伸ばした状態)から剣状軟骨のすぐ上までの距離に近い深さまで挿入します。
- イソフルランマスクをマウスの鼻孔の上に再配置します。
- 分析ソフトウェアを使用してECGリードIの連続記録からデータ収集を開始します( 材料表を参照)。
- スティミュラス・アイソレータ・モードをバイポーラに調整します。刺激中は、最も遠位の電極のペアを使用します。
- カテーテルを食道内に適切に配置して、キャプチャできるようにします。これを行うには、洞CLよりわずかに短いCLでパルス幅2msの1.5mA刺激を適用します(たとえば、洞CLが120ミリ秒の場合は100ミリ秒のCLを使用します)。一貫した心房捕捉が得られるまで、カテーテルを慎重に配置します。
4. 閾値決定
- 心房拡張期捕捉閾値(TH)を決定するには、心房捕捉に使用されるCLで1.5mA、パルス幅2msでペーシングを開始します。心房捕捉が失われるまで刺激振幅を0.05mA刻みで減少させ、その後捕捉まで増加させる。
注:一貫した心房キャプチャが得られる最も低い振幅は心房THです。人工的なAF誘導9によるペーシング中の過剰なAVブロックによって反映される高刺激振幅での副交感神経刺激の懸念により、最大許容THは0.75mAです。必要に応じて、TH ≤0.75 mAになるようにカテーテルの位置を変更します。 - 刺激振幅を2倍THに調整します。
5.電気生理学的特性の決定
- AF誘導の急速な心房ペーシングの前に、洞結節回復時間(SNRT)、ウェンケバッハサイクル長(WCL)、房室有効不応期(AVERP)などの電気生理学的パラメータを測定します15。
6.心房性不整脈感受性
- 異なるCLでのバーストペーシングまたは初期研究から決定されたデクリメンタルペーシングのいずれかを使用して、パルス幅2ミリ秒で2倍THでペーシングを実行します(ステップ1.1.-1.4)。
- バーストペーシングの場合、50ミリ秒の初期CLで15秒間ペースを上げ、後続のトレインは40ミリ秒、30ミリ秒、25ミリ秒、20ミリ秒、および15ミリ秒のCLで発生します8,10。各ペーシングトレインの後に30秒間ペーシングを一時停止して、先に進む前に回復できるようにします。ペーシングトレインの後にAFが発生した場合は、終了後30秒待ってから、後続のペーシングに進みます。
- デクリメントペーシングの場合は、40ミリ秒のCLでペースを上げ、20ミリ秒で終了するまで2秒ごとにCLを2ミリ秒ずつ減らします7。3連の16 または五重の17でペーシングトレインを実行し、各トレインの後に回復のために30秒一時停止します。上記のように、AFが発生した場合は、終了後30秒待ってから続行します。
注:予備実験(つまり、ステップ1.1.-1.5)中にプロトコルパラメータを最適化する場合は、5つのトレインでデクリメントペーシングを実行します。事後解析を実行して、3 つまたは 5 つの列車が最大の感度を提供するかどうかを判断します。 - 最後のペーストレインの後の30秒の洞調律、またはAFの10分のエピソードのいずれか早い方で手順を終了します。
7. 事後手続き
- データ集録を停止します。
- カテーテルとECG電極をそっと取り外します。
- 麻酔をやめます。
- 麻酔をかけたマウスをケージに入れ、10分間観察して回復を確実にします。
- データ ファイルを保存します。シリアルテストの場合は、ペーシング手順を繰り返す前に、最低24時間待ちます。
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Representative Results
経食道心房ペーシング研究では、SNRTとAVERP、およびAF感受性6を決定することにより、SAおよびAVノードの電気生理学的特性を評価します(図1)。ECG記録により、P波持続時間、PR間隔、QRS期間、およびQT/QTc間隔の測定が可能になります。急速な心房ペーシング中のECGの継続的な記録は、AFの脆弱性の次の測定値を提供できます:研究中に誘発されたエピソードの数、エピソードの累積および平均期間、および持続的なAFエピソードの数。ペーシング中の過剰なAVブロックのエピソードは、ペーシング誘発副交感神経刺激の期間を示すことができ(図3)、関連するAFがモデル自体の病態生理学ではなく、この現象のアーティファクトであることを示しています9。
図1:心房ペーシングの代表的な結果。 (A)洞調律および(B)急速な心房ペーシング後の心房細動を描写する表面ECG記録。ペーシングレートはウェンケバッハCLを超えているため、ペーシング中に1:1のAV節点伝導が失われます。ベースラインアーティファクトはマウス呼吸に関連しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:経食道カテーテルと神経節神経叢への近接性の視覚的表現 。 (A)2-F八極カテーテルを描いた写真。(B)カテーテルが左心房神経節神経叢後部に近接している描写。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:急速な心房ペーシング中の過剰なAVブロックの代表的な結果。 心房ペーシング中、特に刺激強度が高く、CLが短いペーシング中に発生する可能性のある過剰なAVブロック(A)およびなし(B)の心房ペースリズムを示す表面ECG記録。 赤い矢印はQRS複合体を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
経食道心房ペーシングは、同じ動物での連続研究を可能にするだけでなく、その期間は通常、心臓内研究よりも短い(~20分)ため、麻酔薬の使用と電気生理学的パラメーターへの影響を最小限に抑えます。
個々のマウスモデルごとに最初に方法を最適化することが重要です。加齢は正常マウスにおけるAF誘導能を増加させ18,19、そして個々の遺伝子モデルは限られた期間にわたってAF誘導能を実証し得る。隔週でパイロット研究を実施することで、AF表現型マウスが誘導可能であるが対照マウスが誘導できない年齢ウィンドウを決定できます。一方または両方の性別が誘導可能なAF9を表示できるため、性別が決定因子となり得る。さらに、特定のマウスは、1つのタイプのペーシングモードのみに応答してAF感受性を示すことができるが、他のマウスは、異なるモードまたは複数のモードに対するAF感受性を示す9。
急速な心房ペーシングの間、マウスは、しばしばAF誘導と一致する過剰なAVブロックを経験することがある。この現象は、左後心房に位置する神経節神経叢の不注意な刺激によって引き起こされ、副交感神経の活性化をもたらします9。有意なAVブロックは、単一のペーシングトレインの≥10%続く心室徐脈として定義され、高い刺激強度でペーシングし、短いペーシングCLで最も頻繁に遭遇します。このタイプの不整脈誘導は、対照マウスにおけるAFの発生率を増加させ、実験群内でより大きな不整脈変動を引き起こす。これらの汚染の特徴を考えると、これらの条件下でAFを経験する動物は分析から除外されなければなりません。
TH ≤0.75 mAにもかかわらずペーシング中に深刻なAVブロックが発生した場合は、ペーシング振幅を1.5倍TH7に減らすのが妥当です。さらに、予備実験中にAF表現型が観察されない場合は、最低ペーシングCL16として10msを用いて再試行することが考えられる。獲得したモデルの12週齢でAF表現型が観察されない場合は、表現型の成熟度を高める効果を調べるために隔週の予備研究を検討してください20。
このアプローチの制限は、イソフルラン麻酔の使用である。イソフルランは自律神経機能を抑制することが知られており21、比較的短時間の曝露にもかかわらず、この効果を排除することはできません。このプロトコルは、マウスで経食道PES法を開発するための最適化された戦略の最初の詳細なレポートを表しています。この研究はAF感受性に焦点を当てていますが、このプロトコルの将来のアプリケーションは、心室性不整脈の評価に使用できます22,23。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
図 2 は BioRender.com で作成されました。この研究は、国立衛生研究所の国立心臓、肺、血液研究所(HL096844およびHL133127)からの助成金によってサポートされました。アメリカ心臓協会(2160035、18SFRN34230125および903918 [MBM]);国立衛生研究所のトランスレーショナルサイエンス推進センター(UL1 TR000445)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G ECG electrodes | ADInstruments | MLA1204 | |
| 2-F octapolar electrode catheter | NuMED | CIBercath | |
| Activated carbon canister | VetEquip | 931401 | |
| Analysis software | ADInstruments | LabChart v8.1.13 | |
| Biological amplifier | ADInstruments | FE231 | |
| Data acquisition hardware | ADInstruments | PowerLab 26T | |
| Eye ointment | MWI Veterinary | NC1886507 | |
| Heating pad | Braintree Scientific | DPIP | |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Stimulator | Bloom Associates | DTU-210 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | Model A365 |
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