Summary
Se desarrolló un método simple y escalable para evaluar la importancia funcional de las variantes sin sentido en Ube3a, un gen cuya pérdida y ganancia de función están relacionadas tanto con el síndrome de Angelman como con el trastorno del espectro autista.
Abstract
El aumento del uso de la secuenciación en medicina ha identificado millones de variantes codificantes en el genoma humano. Muchas de estas variantes ocurren en genes asociados con trastornos del neurodesarrollo, pero el significado funcional de la gran mayoría de las variantes sigue siendo desconocido. El presente protocolo describe el estudio de variantes para Ube3a, un gen que codifica una ubiquitina ligasa E3 vinculada tanto al autismo como al síndrome de Angelman. La duplicación o triplicación de Ube3a está fuertemente relacionada con el autismo, mientras que su eliminación causa el síndrome de Angelman. Por lo tanto, comprender la valencia de los cambios en la actividad de la proteína UBE3A es importante para los resultados clínicos. Aquí, se describe un método rápido basado en células que empareja variantes de Ube3a con un reportero de la vía Wnt. Este ensayo simple es escalable y se puede utilizar para determinar la valencia y magnitud de los cambios de actividad en cualquier variante de Ube3a . Además, la facilidad de este método permite la generación de una gran cantidad de información estructura-función, que se puede utilizar para obtener información profunda sobre los mecanismos enzimáticos de UBE3A.
Introduction
Los recientes avances tecnológicos han hecho que la secuenciación de exomas y genomas sea rutinaria en entornos clínicos 1,2. Esto ha llevado al descubrimiento de un gran número de variantes genéticas, incluyendo millones de variantes sin sentido que típicamente cambian un aminoácido en una proteína. Comprender el significado funcional de estas variantes sigue siendo un desafío, y solo una pequeña fracción (~2%) de las variantes sin sentido conocidas tienen una interpretación clínica 1,3.
Un ejemplo destacado de este problema es Ube3a, un gen que codifica una ubiquitina ligasa E3 que se dirige a las proteínas de sustrato para su degradación4. Ube3a reside dentro del cromosoma 15q11-13 y se expresa exclusivamente a partir del alelo heredado materno 5,6,7. Las observaciones de la genética de la enfermedad sugieren fuertemente que la actividad insuficiente o excesiva de la enzima UBE3A causa distintos trastornos del desarrollo neurológico. La deleción del cromosoma materno 15q11-13 causa el síndrome de Angelman (EA)8, un trastorno caracterizado por discapacidad intelectual grave, deficiencias motoras, convulsiones, un comportamiento feliz con sonrisas frecuentes y rasgos faciales dismórficos 8,9,10. En contraste, la duplicación o triplicación del cromosoma materno 15q11-13 causa el síndrome de Dup15q, una condición heterogénea reconocida como una de las formas sindrómicas más prevalentes de autismo11,12,13. Además, hay cientos de variantes sin sentido identificadas en Ube3a, la mayoría de las cuales se consideran variantes de significado incierto (VUS) ya que su significado funcional y clínico son desconocidos. Por lo tanto, existe un interés considerable en desarrollar métodos que puedan evaluar empíricamente las variantes de Ube3a para determinar si contribuyen a la enfermedad del desarrollo neurológico.
La enzima UBE3A pertenece a la familia de dominios HECT (homólogos a E6-AP C-terminal) de ligasas de ubiquitina E3 que poseen el dominio HECT del mismo nombre, que contiene la maquinaria bioquímica necesaria para aceptar ubiquitina activada de enzimas E2 y transferirla a proteínas sustrato14. Históricamente, la caracterización de las enzimas E3 se ha basado en sistemas in vitro reconstituidos que requieren un conjunto de proteínas purificadas 4,15,16. Tales métodos son lentos y requieren mucha mano de obra y no son susceptibles de evaluar la actividad de un gran número de variantes. En trabajos anteriores, se identificó UBE3A para activar la vía Wnt en las células HEK293T mediante la modulación de la función del proteasoma para ralentizar la degradación de la β-catenina17. Esta información permite el uso de reporteros de la vía Wnt como un método eficiente y rápido para identificar variantes de pérdida y ganancia de función de Ube3a18. El siguiente protocolo describe en detalle un método para generar variantes de Ube3a, así como un reportero basado en luciferasa para evaluar los cambios en la actividad de las variantes de Ube3a.
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Protocol
1. Clonación de mutagénesis para generar variantes de Ube3a
- Clone todas las variantes de Ube3a en el plásmido pCIG2 (Figura 1A), un vector bicistrónico que contiene un promotor de β-actina de pollo y un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) para la expresión de EGFP19. Las construcciones Ube3a de longitud completa contienen una secuencia de etiquetas Myc de N-terminal y se clonan en pCIG2 usando un sitio SacI de 5' y un sitio XmaI de 3'. Además, los sitios EcoRI, EcoRV y PstI naturales dentro de la secuencia de codificación Ube3a también se utilizan para subclonar fragmentos.
NOTA: Las variantes no identificadas para Ube3a se pueden obtener a través de la literatura y en repositorios de acceso público como la base de datos ClinVar1. Se pueden obtener variantes adicionales no reportadas a través de la comunicación personal con los centros médicos. - Utilice un método adaptado de mutagénesis de megacebadores de dos pasos20 para introducir mutaciones en el marco de lectura Ube3a . En el primer paso, diseñar el oligonucleótido mutagénico que contiene la mutación deseada (el ejemplo que se muestra en este protocolo es generar una variante UBE3A Q588E) flanqueada por al menos 30 pares de bases (pb) de homología 5' y 3' a la mutación (Figura 1B y Tabla 1).
- Utilice el oligonucleótido mutagénico junto con un oligonucleótido complementario para la primera ronda de PCR para generar un megacebador de 200-400 pb que contenga la mutación (Figura 1C; Cuadro 2 y Cuadro 3). Utilice los 50 μL completos del volumen de reacción de PCR para la electroforesis en gel de agarosa utilizando un gel al 1% y la posterior purificación del gel (Tabla de materiales). Eluya el producto de PCR en 30 μL deH2Odesionizado (diH2O) para su uso en el paso de PCR de segunda ronda a continuación.
- Configure la segunda ronda de PCR como se indica (Figura 1C; Cuadro 2 y Cuadro 3). Este paso generará fragmentos de ADN más grandes (típicamente ~ 1-1.5 kb de longitud) que contienen los sitios de mutación y restricción terminal adecuados para la subclonación (Figura 1C).
- Después de completar la reacción de PCR, purificar el producto resultante utilizando un kit de purificación de PCR (Tabla de materiales). Eluya en 30 μL y digiera todo el producto purificado y la construcción pCIG2 Ube3a WT con las enzimas de restricción apropiadas (el ejemplo muestra la digestión con EcoRI y XmaI).
- Después de 2 h de digestión a 37 °C, resolver los productos de digestión mediante electroforesis en gel de agarosa (gel al 1%) y purificar los productos apropiados. Configure las ligaduras de acuerdo con el protocolo del fabricante (Tabla de materiales), transforme los productos de ligadura en una cepa bacteriana DH10B (Tabla de materiales) y luego coloque una placa con ampicilina (100 μg / ml) selección.
- Al día siguiente, escoja de dos a cuatro colonias para inocular cultivos de 3 ml que contengan caldo Luria (LB) y ampicilina de 100 μg/ml. Dejar que los cultivos crezcan durante la noche a 37 °C en una incubadora orbital con agitación (225 rpm).
- Al día siguiente, use 1-1.5 ml del cultivo bacteriano para minipreparar el ADN plásmido (Tabla de materiales). Guardar el cultivo restante colocándolos a 4 °C. Examinar los plásmidos miniprepped mediante secuenciación de Sanger utilizando un oligonucleótido que se une a ~200 pb de la mutación deseada.
- Utilice los cultivos bacterianos guardados a 4 °C para volver a inocular 50 ml de cultivos para midiprep el plásmido correcto (Tabla de materiales). Secuencie completamente la secuencia de codificación Ube3a para validar la secuencia correcta del ADN.
- Crear existencias funcionales de plásmidos variantes de Ube3a, así como el reportero activado por β-catenina (BAR)21, TK-Renilla luciferasa, Ube3a muerto por ligasa (mutación UBE3A C820A) y vector vacío pCIG2 a una concentración de 100 ng/μL utilizandoH2Oestéril para los pasos posteriores de transfección.
2. Preparación y transfección de células embrionarias humanas 293T (HEK293T)
- Realizar los ensayos en células HEK293T cultivadas en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco presuplementado con glutamina, suero bovino fetal al 10% (FBS) y agente antibiótico-antimicótico como se describió anteriormente17. Cultivar las células en una incubadora estéril y humidificada a 37 °C con un 5% deCO2.
- Usando un gabinete de bioseguridad, primero coloque las células HEK293T suspendidas en placas de fondo plano de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejidos a una densidad de 2.2 × 104 células por pocillo en 100 μL de medios de cultivo y déjelas crecer durante la noche.
- En el segundo día, transfectar las células en un gabinete de bioseguridad con plásmidos reporteros Firefly y Renilla luciferasa (Tabla 4) y plásmidos Ube3a por triplicado. Realizar las transfecciones en 10 μL de volumen total por pocillo utilizando una relación 10:1:8 de plásmidos (50 ng de BAR, 5 ng de TK-Renilla y 40 ng de plásmido Ube3a por pocillo, respectivamente), como se describió anteriormente18, y 0,4 μL de reactivo de transfección (Tabla 4).
NOTA: Para cada experimento, un vector vacío (solo GFP) y un plásmido que codifica la ligasa-muerta Ube3a también se transfectan para servir como controles negativos. - Cree una mezcla maestra para las transfecciones para cada variante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (Tabla 4) e incube a temperatura ambiente (RT) durante 15 min. Después de la incubación, agite suavemente la mezcla de transfección golpeando el tubo y luego agregue 10 μL de la mezcla de transfección directamente a los medios de cultivo existentes en los pocillos.
- Después, devuelva las células a la incubadora y permita que los plásmidos se expresen durante 48 h. No es necesario reemplazar los medios de crecimiento.
- Monitoree la eficiencia de transfección mediante fluorescencia GFP usando un microscopio de fluorescencia. Las células HEK293T se transectan eficientemente mediante este método, y el >80% de las células deben expresar GFP después de 48 h.
3. Medición de la actividad de la luciferasa
NOTA: La actividad de la luciferasa se evalúa utilizando un sistema disponible comercialmente que analiza Firefly y Renilla luciferase (Tabla de materiales) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Aspire cuidadosamente los medios de cultivo de las células HEK293T transfectadas y luego lave las células con solución salina tamponada con fosfato frío (PBS). Aspirar el PBS y lisar las células añadiendo 25 μL de tampón de lisis no desnaturalizante e incubar durante 15 min con un suave balanceo sobre hielo.
- Después, añadir 20 μL del lisado resultante (no es necesaria centrifugación) en una nueva placa de ensayo de 96 pocillos que contenga 100 μL de un reactivo de sustrato de luciferasa Firefly. Mezclar el plato suavemente dando golpecitos.
- Cargue la placa en un lector de placas y mida la luminiscencia utilizando un detector superior con una altura de lectura de 1 mm y un tiempo de integración de 1 s.
NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la ganancia del detector en función de la intensidad de la señal. - Inmediatamente después de leer la luminiscencia de la luciferasa Firefly, agregue 100 μL de sustrato de luciferasa Renilla a los pocillos. Este paso apaga simultáneamente la actividad luciferasa Firefly mientras evalúa la actividad de la luciferasa Renilla. Mezclar las muestras agitando suavemente la placa y medir la luminiscencia de nuevo para evaluar la actividad de la Renilla luciferasa.
NOTA: Si bien se pueden usar otras placas para este ensayo, el uso de placas con marcos negros y pocillos blancos proporcionará los resultados más sensibles, ya que esto amplifica la señal de luciferasa y minimiza el ruido. - Cuantifique las respuestas del reportero como la relación luciferasa Firefly a Renilla luciferasa (Firefly/Renilla), y promedie los valores de las mediciones triplicadas. Después, normalice el valor de Firefly/Renilla para cada variante contra los valores de las células que expresan Ube3a de tipo salvaje (WT) para comparar la actividad relativa de las proteínas variantes.
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Representative Results
El cribado funcional a gran escala de las variantes sin sentido de Ube3a identifica un amplio panorama de mutaciones de pérdida y ganancia de función
Trabajos previos con mutantes Ube3a sugirieron que la respuesta Wnt puede servir como un reportero de la actividad celular de la proteína UBE3A. Estas observaciones se ampliaron y se realizaron experimentos de validación adicionales para investigar si el ensayo BAR es adecuado para informar una gama de actividades UBE3A en la célula. Primero, las células HEK293T se transfectaron con cantidades variables de ADN plásmido que codifica WT Ube3a humano. Este experimento demostró que la respuesta BAR cambia linealmente con la cantidad de Ube3a transfectada en las células (Figura 2A). En segundo lugar, el ensayo BAR fue probado utilizando ADN plásmido que codifica variantes ligadas a la enfermedad previamente caracterizadas en la literatura22. Entre ellas se encontraban variantes benignas (R39H y A178T), una variante de ganancia de función ligada al autismo (T458A) y una colección de variantes confirmadas ligadas al síndrome de Angelman que causan una pérdida de la función UBE3A a través de diversos mecanismos15,22. El ensayo BAR identificó correctamente cada variante (Figura 2B), incluyendo todas las variantes de pérdida de función, demostrando la precisión y generalidad de este método18.
El ensayo BAR se utilizó para examinar 152 variantes sin sentido, la mayoría de las cuales se identificaron en la base de datos ClinVar. De manera similar a la evidencia genética con respecto a las variaciones del número de copias en los trastornos dependientes de Ube3a, el impacto funcional de las variantes sin sentido fue amplio e incluyó variantes benignas, así como variantes de pérdida de función y ganancia de función (Figura 3)18. De particular interés, las variantes de ganancia de función identificadas utilizando este método fueron todas novedosas, y la validación posterior sugirió fuertemente que definen una subclase de trastornos dependientes de Ube3a con fenotipos que difieren del síndrome de Angelman clásico18.
El efecto de las variantes sin sentido es a menudo impredecible, lo que subraya la necesidad de una evaluación funcional
Una observación intrigante del cribado funcional de las variantes de Ube3a es que los cambios en algunas posiciones de aminoácidos producen efectos drásticamente diferentes, lo que subraya la importancia de la evaluación empírica de variantes18. Por ejemplo, se identificaron tres individuos con variantes en la posición de glutamina 588 (Q588) en UBE3A que incluían una sustitución de glutamato de ganancia de función (Q588E), una sustitución de arginina por pérdida de función (Q588R) y otra sustitución de prolina por pérdida de función (Q588P; Figura 4A). Se utilizó un enfoque de mutación integral para mutar la posición Q588 a cada aminoácido posible. Cuando la actividad de estas variantes se midió utilizando el ensayo BAR, mostró que cualquier aminoácido cargado negativamente en la posición 588 produce una enzima hiperactiva (Figura 4B). Esta información proporcionó importantes pistas funcionales que permitieron el descubrimiento de un nuevo sitio dentro del dominio HECT de UBE3A que facilita el alargamiento de la cadena de ubiquitina18.
Figura 1: Mutagénesis dependiente de PCR de Ube3a. (A) Representación del vector de expresión Ube3a que indica los sitios de restricción relevantes. (B) La secuencia de ADN que codifica UBE3A se muestra en la parte superior. El codón Q588 se indica con letras en negrita. El cebador de mutagénesis Q588E (cebador Mut.) se muestra alineado con la secuencia UBE3A. Las letras rojas indican el sitio mutagenizado. (C) Se muestra un esquema de la PCR para generar el megacebador y el fragmento de ADN utilizado para subclonar el fragmento Q588E. La posición de la mutación Q588E se indica con el asterisco rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Validación del ensayo BAR como informador de la actividad de la ubiquitina ligasa UBE3A. (A) Las células HEK293T transfectadas con cantidades crecientes de plásmidos que codifican WT UBE3A muestran un aumento lineal en la respuesta BAR. Los valores medios se muestran para las relaciones luciferasa Firefly/Renilla ± error estándar (SE). N= 3 experimentos independientes. (B) Las variantes Ube3a previamente caracterizadas se probaron en el ensayo BAR. Las respuestas se normalizaron a WT UBE3A, y los valores se muestran como la media ± EE. El número de experimentos (n) y los valores p calculados utilizando una prueba t de una muestra (dos colas) con corrección de comparaciones múltiples de Benjamini-Hochberg (FDR = 0,05) son los siguientes: GFP, n = 19, ***p = 1,733 × 10−31; WT UBE3A, n = 19; UBE3A LD, n = 19, ***p = 1,519 × 10−31; R39H, n = 3, p = 0,567; A178T, n = 4, p = 0,828; T485A, n = 5, *p = 0,019; C21Y, n = 3, ***p = 8,725 × 10−6; C117R, n = 3, ***p = 3,419 × 10−4; N243K, n = 3, **p = 0,0072; E269G, n = 3, **p = 7,787 × 10−4; L273F, n = 3, **p = 0,0052; S349P, n = 3, **p = 0,0016; L502P, n = 3, **p = 0,0033; R506C, n = 3, **p = 0,0033; T106K, n = 6, **p = 0,0,0078; T106P, n = 3, **p = 0,0013; I130T, n = 6, *p = 0,016; R477P, n = 3, ***p = 4,24 × 10−4; M478I, n = 3, ***p = 3,39 × 10−4; R482P, n = 3, **p = 5,82 × 10−4; I329T, n = 5, ***p = 1,22 × 10−5; E550L, n = 3, *p = 0,0013. Datos reproducidos con permiso de Weston et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Variantes UBE3A que abarcan una amplia gama de efectos funcionales. Cribado de ensayo BAR de 152 variantes de Ube3a que muestran mutaciones benignas (gris), pérdida de función (azul) y ganancia de función (rojo) en relación con WT UBE3A. La significancia se determinó mediante una prueba t de una muestra (dos colas) con corrección de comparaciones múltiples de Benjamini-Hochberg (FDR = 0,05). Rojo, ganancia de función; Gris, sin cambios con respecto a WT UBE3A; Azul, pérdida de función. Datos reproducidos con permiso de Weston et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Variantes de UBE3A que abarcan una amplia gama de efectos funcionales. (A) Resultados del ensayo BAR de variantes en la posición 588 de UBE3A que muestran sustituciones de pérdida y ganancia de función. Q588E, n = 6; Q588P, n = 3; Q588R, n = 4; p < 0,0005, prueba t de una muestra (dos colas) con corrección de comparación múltiple de Benjamini-Hochberg (FDR = 0,05). (B) Gráfico de calor que muestra los resultados normalizados de BAR para un análisis mutacional exhaustivo en la posición 588 en UBE3A. El sombreado blanco representa los niveles de actividad WT UBE3A, el sombreado azul indica la pérdida de función y el sombreado rojo indica la ganancia de función. La barra de escala muestra el cambio porcentual en relación con WT UBE3A. N = 3 experimentos independientes para Q588S, Q588T, Q588N, Q588K, Q588P, Q588M, Q588G, Q588A, Q588F, Q588Y, Q588W, Q588L, Q588V, Q588I, Q588C; n = 8 para Q588E, n = 6 para Q588D, n = 5 para Q588R, n = 4 para Q588H, *p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005. Prueba t de una muestra (dos colas) con corrección de comparaciones múltiples de Benjamini-Hochberg (FDR = 0,05). Datos reproducidos con permiso de Weston et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre | Secuencia | Utilizado para | |
| Cartilla 1 | GATTATATTATGACAATAGAA TTCGCATGTACAGTGAAC |
Ube3a Sentido EcoRI | |
| Cartilla mut. | CCAGACCCAGTACTATGCCAAT CAGAGTAAACTCACCCTCAGTT TCAAAAGAAGATGGATTAAACC |
UBE3A Q588E mutagénesis antisentido | |
| Cartilla 2 | ATTATATTCCCGGGTTACAGCAT GCCAAATCCTTTGG |
Ube3a XmaI antisentido | |
Tabla 1: Cebadores utilizados para la mutagénesis UBE3A Q588E.
| 1ª Ronda PCR | |
| Reactivo | Cantidad de reacción |
| 5x búfer de alta fidelidad | 10 μL |
| dNTP (10 mM de existencias) | 1 μL |
| Cebador 1 (10 mM de stock) | 1 μL |
| Cebador 2 (10 mM de stock) | 1 μL |
| ADN WT-Ube3a (150 ng/μL) | 1 μL |
| H2O | 35 μL |
| ADN polimerasa de alta fidelidad | 1 μL |
| Volumen total | 50 μL |
| 2ª Ronda PCR | |
| Reactivo | Cantidad de reacción |
| 5x búfer de alta fidelidad | 10 μL |
| dNTP (10 mM de existencias) | 1 μL |
| Cebador 3 (10 mM de material) | 1 μL |
| Producto de PCR purificado (Megaprimer) | 30 μL |
| ADN WT-Ube3a (150 ng/μL) | 1 μL |
| H2O | 6 μL |
| ADN polimerasa de alta fidelidad | 1 μL |
| Volumen total | 50 μL |
Tabla 2: Parámetros de PCR para mutagénesis.
| 1ª Ronda PCR | ||
| Paso | Temperatura | Hora |
| Desnaturalización inicial | 95 °C | 2 minutos |
| (1 ciclo) | ||
| Desnaturalización | 95 °C | 30 s |
| Recocido | 50 °C | 20 s |
| Extensión | 72 °C | 15 s |
| (30 ciclos) | ||
| Prórroga final | 72 °C | 1 minuto |
| Sostener | 4 °C | Infinito |
| 2ª Ronda PCR | ||
| Paso | Temperatura | Hora |
| Desnaturalización inicial | 95 °C | 2 minutos |
| (1 ciclo) | ||
| Desnaturalización | 95 °C | 30 s |
| Recocido | 50 °C | 20 s |
| Extensión | 72 °C | 35 s |
| (30 ciclos) | ||
| Prórroga final | 72 °C | 1 minuto |
| Sostener | 4 °C | Infinito |
Tabla 3: Parámetros del programa de PCR para mutagénesis.
| Reactivo | Concentración de trabajo | 1x transfección | Mezcla maestra 3.5x |
| plásmido pGL3 BAR | 100 ng/μL | 0,5 μL | 1,75 μL |
| pTK Plásmido de Renilla | 100 ng/μL | 0,05 μL | 0,175 μL |
| Plásmido Ube3a | 100 ng/μL | 0,4 μL | 1,4 μL |
| DMEM suplementado con glutamina | 8,65 μL | 30.275 μL | |
| Reactivo de transfección | 0,4 μL | 1,4 μL |
Tabla 4: Mezclas de transfección.
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Discussion
El protocolo descrito aquí proporciona un método eficiente y escalable para evaluar la actividad enzimática de las variantes de Ube3a. Hay varios detalles técnicos que merecen una cuidadosa consideración al usar este ensayo. Una consideración es la elección de los plásmidos reporteros Wnt utilizados en este ensayo. El protocolo descrito aquí utiliza específicamente el reportero activado por β-catenina (BAR)21, un informador que contiene un concatemer de 12 elementos de respuesta del factor de células T (TCF) separados por secuencias de enlazadores específicamente diseñadas para minimizar la recombinación y la pérdida de sitios de unión a TCF. Existen plásmidos reporteros Wnt adicionales basados en luciferasa descritos en la literatura23, y aunque estudios previos indican que algunos pueden ser utilizados para evaluar la actividad de UBE3A, el plásmido BAR ha sido más ampliamente caracterizado para este propósito17,18. En segundo lugar, la elección del plásmido de la luciferasa Renilla es crítica. Se incluye un plásmido que codifica Renilla luciferasa durante la etapa de transfección para normalizar la eficiencia de la transfección. El plásmido utilizado en este protocolo expresa constitutivamente Renilla luciferasa bajo el control de un promotor de timidina quinasa (TK) (TK-Renilla). El uso de plásmidos que contienen otros promotores, como el promotor del citomegalovirus (CMV) ampliamente utilizado, puede dar lugar a resultados variables en la expresión de la Renilla luciferasa.
Una segunda consideración es el comportamiento de las células dependiendo del tipo y lote de FBS utilizado para el cultivo celular. Por ejemplo, FBS puede afectar de manera variable la tasa de crecimiento de las células HEK293T. El protocolo actual se optimizó con células que exhiben un tiempo de duplicación típico de 18-24 h, lo que hace que la densidad celular en el momento de la transfección sea aproximadamente ~ 4 × 104 células por pocillo. Como la densidad celular puede afectar la eficiencia de la transfección, las tasas de crecimiento celular deben ser evaluadas cuidadosamente por el usuario y el número de células debe ajustarse en consecuencia en el momento del recubrimiento. Además, la respuesta BAR dependiente de UBE3A requiere cierta cantidad de ligando Wnt para estar presente durante el experimento. En la mayoría de las condiciones estándar, hay suficiente Wnt en el FBS para impulsar esta respuesta; Sin embargo, esta respuesta también puede variar. Se recomienda la titulación de las proporciones de plásmidos utilizadas para la transfección para garantizar que la respuesta BAR se mida dentro del rango lineal apropiado. Un enfoque alternativo es estimular la señalización de Wnt utilizando un ligando Wnt recombinante o medios de crecimiento suplementados con Wnt17.
Una ventaja del ensayo BAR es que puede informar la actividad ubiquitina ligasa de todas las isoformas Ube3a . Los seres humanos expresan tres isoformas de Ube3a que difieren en su extremo N-termini debido al uso de sitios de inicio transcripcionales alternativos24. El ensayo BAR proporciona la misma lectura agnóstica a las isoformas, y por lo tanto, este ensayo se puede utilizar para evaluar todas las variantes de Ube3a . Además, la caracterización a gran escala de las variantes de Ube3a proporciona datos profundos de estructura-función que pueden descubrir nuevos dominios y mecanismos que son críticos para la función enzimática. Un estudio previo utilizó datos variantes para descubrir un dominio de unión a ubiquitina dentro de UBE3A que facilita el alargamiento de la cadena de ubiquitina18. Estudios adicionales de estructura-función probablemente proporcionarán nuevos conocimientos sobre los mecanismos bioquímicos de UBE3A que pueden aprovecharse para el desarrollo terapéutico.
Existen algunas limitaciones para el ensayo BAR que merecen una consideración cuidadosa al determinar la patogenicidad de una variante. Debido a la impronta epigenética de Ube3a en las neuronas, este ensayo no puede discriminar alelos maternos y paternos, y se debe sopesar evidencia genética adicional junto con datos funcionales para determinar la patogenicidad de una variante. Además, las variables adicionales más allá de la actividad ubiquitina ligasa de UBE3A deben considerarse en el contexto de la enfermedad. Por ejemplo, trabajos previos mostraron que UBE3A localizada nuclearmente contribuye a la patología del síndrome de Angelman25 y que algunas variantes perturban este patrón de localización de la enzima26. Por lo tanto, se deben realizar caracterizaciones posteriores adicionales para obtener una comprensión completa de la contribución de las variantes de Ube3a a la patología del neurodesarrollo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por un Premio Puente a la Independencia de la Fundación Simons (Premio SFARI # 387972; J.J.Y.), un NARSAD Young Investigator Award de la Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), una beca de investigación de la Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.), y becas de investigación de la Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), la Whitehall Foundation (J.J.Y.) y el NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
