Summary
Een eenvoudige en schaalbare methode werd ontwikkeld om de functionele betekenis van missense-varianten in Ube3a te beoordelen, een gen waarvan het verlies en de winst van functie verband houden met zowel het Angelman-syndroom als de autismespectrumstoornis.
Abstract
Het toegenomen gebruik van sequencing in de geneeskunde heeft miljoenen coderende varianten in het menselijk genoom geïdentificeerd. Veel van deze varianten komen voor in genen die geassocieerd zijn met neurologische ontwikkelingsstoornissen, maar de functionele betekenis van de overgrote meerderheid van de varianten blijft onbekend. Het huidige protocol beschrijft de studie van varianten voor Ube3a, een gen dat codeert voor een E3 ubiquitine ligase gekoppeld aan zowel autisme als angelmansyndroom. Duplicatie of drievoud van Ube3a is sterk gekoppeld aan autisme, terwijl de deletie ervan het Angelman-syndroom veroorzaakt. Het begrijpen van de valentie van veranderingen in UBE3A-eiwitactiviteit is dus belangrijk voor klinische resultaten. Hier wordt een snelle, op cellen gebaseerde methode beschreven die Ube3a-varianten koppelt aan een Wnt-padverslaggever. Deze eenvoudige test is schaalbaar en kan worden gebruikt om de valentie en omvang van activiteitsveranderingen in elke Ube3a-variant te bepalen. Bovendien maakt de faciliteit van deze methode het mogelijk om een schat aan structuurfunctie-informatie te genereren, die kan worden gebruikt om diepgaande inzichten te krijgen in de enzymatische mechanismen van UBE3A.
Introduction
Recente technologische ontwikkelingen hebben de sequencing van exomen en genomen routine gemaakt in klinische omgevingen 1,2. Dit heeft geleid tot de ontdekking van een groot aantal genetische varianten, waaronder miljoenen missense-varianten die meestal één aminozuur in een eiwit veranderen. Het begrijpen van de functionele betekenis van deze varianten blijft een uitdaging, en slechts een klein deel (~2%) van de bekende missense varianten heeft een klinische interpretatie 1,3.
Een prominent voorbeeld van dit probleem is Ube3a, een gen dat codeert voor een E3-ubiquitineligase dat zich richt op substraateiwitten voor afbraak4. Ube3a bevindt zich binnen chromosoom 15q11-13 en wordt uitsluitend uitgedrukt uit het maternale erfelijke allel 5,6,7. Observaties uit de ziektegenetica suggereren sterk dat onvoldoende of overmatige activiteit van het UBE3A-enzym verschillende neurologische ontwikkelingsstoornissen veroorzaakt. Deletie van maternale chromosoom 15q11-13 veroorzaakt Angelman-syndroom (AS)8, een aandoening die wordt gekenmerkt door ernstige intellectuele achterstand, motorische stoornissen, epileptische aanvallen, een gelukkige houding met frequent glimlachen en dysmorfe gelaatstrekken 8,9,10. Daarentegen veroorzaakt duplicatie of tripplicatie van maternale chromosoom 15q11-13 het Dup15q-syndroom, een heterogene aandoening die wordt erkend als een van de meest voorkomende syndromale vormen van autisme 11,12,13. Bovendien zijn er honderden missense-varianten geïdentificeerd in Ube3a, waarvan de meerderheid wordt beschouwd als varianten van onzekere betekenis (VUS) omdat hun functionele en klinische betekenis onbekend zijn. Er is dus veel interesse in het ontwikkelen van methoden die Ube3a-varianten empirisch kunnen beoordelen om te bepalen of ze bijdragen aan neurologische ontwikkelingsziekten.
Het UBE3A-enzym behoort tot de HECT-domeinfamilie (homoloog aan E6-AP C-terminus) van E3-ubiquitine-ligases die allemaal het gelijknamige HECT-domein bezitten, dat de biochemische machinerie bevat die nodig is om geactiveerd ubiquitine uit E2-enzymen te accepteren en over te brengen naar substraateiwitten14. Historisch gezien is de karakterisering van E3-enzymen gebaseerd op gereconstitueerde in vitro systemen die een ensemble van gezuiverde eiwitten vereisen 4,15,16. Dergelijke methoden zijn traag en arbeidsintensief en niet vatbaar voor het beoordelen van de activiteit van een groot aantal varianten. In eerder werk werd UBE3A geïdentificeerd om de Wnt-route in HEK293T-cellen te activeren door de functie van het proteasoom te moduleren om de afbraak van β-catenine17 te vertragen. Dit inzicht maakt het gebruik van Wnt-pathway-verslaggevers mogelijk als een efficiënte en snelle methode om zowel verlies- als gain-of-function-varianten van Ube3a18 te identificeren. Het onderstaande protocol beschrijft in detail een methode om Ube3a-varianten te genereren, evenals een op luciferase gebaseerde verslaggever om veranderingen in de activiteit van Ube3a-varianten te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mutagenese klonen om Ube3a varianten te genereren
- Kloon alle Ube3a-varianten in het pCIG2-plasmide (figuur 1A), een bicistronische vector die een kip-β-actinepromotor en een interne ribosoominvoerplaats (IRES) bevat voor EGFP-expressie19. Ube3a-constructies van volledige lengte bevatten een N-terminale Myc-tag-reeks en worden gekloond in pCIG2 met behulp van een 5 'SacI-site en een 3'XmaI-site. Bovendien worden natuurlijk voorkomende EcoRI-, EcoRV- en PstI-sites binnen de Ube3a-coderingssequentie ook gebruikt om subklonefragmenten te maken.
OPMERKING: Gedeïdentificeerde varianten voor Ube3a kunnen worden verkregen via de literatuur en in openbaar toegankelijke repositories zoals de ClinVar-database1. Aanvullende niet-gerapporteerde varianten kunnen worden verkregen via persoonlijke communicatie met medische centra. - Gebruik een aangepaste tweestaps megaprimer mutagenese methode20 om mutaties in het Ube3a-leesframe te introduceren. Ontwerp in de eerste stap het mutagene oligonucleotide dat de gewenste mutatie bevat (het voorbeeld in dit protocol is om een UBE3A Q588E-variant te genereren) geflankeerd door ten minste 30 basenparen (bp) homologie 5′ en 3′ tot de mutatie (figuur 1B en tabel 1).
- Gebruik het mutagene oligonucleotide samen met een complementair oligonucleotide voor de eerste ronde PCR om een megaprimer van 200-400 bp te genereren die de mutatie bevat (figuur 1C; Tabel 2 en tabel 3). Gebruik de volledige 50 μL van het PCR-reactievolume voor agarose gel-elektroforese met behulp van een 1% gel en daaropvolgende gelzuivering (materiaaltabel). Eluteer het PCR-product in 30 μL gedeïoniseerd H2O (diH2O) voor gebruik in de tweede ronde PCR-stap hieronder.
- Stel de tweede ronde PCR in zoals aangegeven (figuur 1C; Tabel 2 en tabel 3). Deze stap genereert grotere DNA-fragmenten (meestal ~ 1-1,5 kb lang) met de mutatie- en terminale beperkingsplaatsen die geschikt zijn voor subklonen (figuur 1C).
- Na voltooiing van de PCR-reactie, zuivert u het resulterende product met behulp van een PCR-zuiveringskit (Materiaaltabel). Eluteer in 30 μL en verteer al het gezuiverde product en de pCIG2 Ube3a WT-constructie met de juiste restrictie-enzymen (het voorbeeld toont de spijsvertering met EcoRI en XmaI).
- Na 2 uur vertering bij 37 °C, los de verteringsproducten op door middel van agarose gel elektroforese (1% gel) en gelzuiver de juiste producten. Stel ligaties in volgens het protocol van de fabrikant (Tabel van Materialen), transformeer de ligatieproducten in een DH10B-bacteriestam (Tabel van Materialen) en plaats vervolgens met ampicilline (100 μg / ml) selectie.
- Kies de volgende dag twee tot vier kolonies om 3 ml culturen met Luria Bouillon (LB) en 100 μg / ml ampicilline te enten. Laat de culturen een nacht groeien bij 37 °C in een orbitale incubator met schudden (225 rpm).
- Gebruik de volgende dag 1-1,5 ml van de bacteriecultuur om het plasmide-DNA te miniprepteren (materiaaltabel). Bewaar de resterende cultuur door ze op 4 °C te plaatsen. Screen de miniprepped plasmiden door Sanger sequencing met behulp van een oligonucleotide dat ~200 bp bindt van de gewenste mutatie.
- Gebruik de bacterieculturen die bij 4 °C zijn opgeslagen om 50 ml culturen opnieuw te enten om het juiste plasmide te midiprepen (Tabel van Materialen). Volledige sequence de Ube3a-coderende sequentie om de juiste sequentie van het DNA te valideren.
- Creëer werkvoorraden van Ube3a variant plasmiden, evenals de β-catenine geactiveerde reporter (BAR)21, TK-Renilla luciferase, ligase-dode Ube3a (UBE3A C820A mutatie), en pCIG2 lege vector in een concentratie van 100 ng/μL met behulp van steriele H2O voor de daaropvolgende transfectiestappen.
2. Bereiding en transfectie van menselijke embryonale nier 293T (HEK293T) cellen
- Voer de testen uit in HEK293T-cellen gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) vooraf aangevuld met glutamine, 10% foetaal runderserum (FBS) en antibioticum-antimycotisch middel zoals eerder beschreven17. Kweek de cellen in een steriele, bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Gebruik een bioveiligheidskast om eerst de gesuspendeerde HEK293T-cellen op weefselkweekbehandelde 96-well flat-bottomed platen te plaatsen met een dichtheid van 2,2 × 104 cellen per put in 100 μL kweekmedia en laat ze 's nachts groeien.
- Transfecteer op de tweede dag de cellen in een bioveiligheidskast met Firefly en Renilla luciferase reporter plasmiden (tabel 4) en Ube3a plasmiden in drievoud. Voer de transfecties uit in 10 μL totaal volume per put met behulp van een verhouding van 10:1:8 van plasmiden (respectievelijk 50 ng BAR, 5 ng TK-Renilla en 40 ng Ube3a plasmide per put), zoals eerder beschreven18 en 0,4 μL transfectiereagens (tabel 4).
OPMERKING: Voor elk experiment worden een lege vector (alleen GFP) en een plasmide dat codeert voor ligase-dode Ube3a ook getransfecteerd om als negatieve controles te dienen. - Maak een hoofdmengsel voor de transfecties voor elke variant in een microcentrifugebuis van 1,5 ml (tabel 4) en incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 15 minuten. Roer na de incubatie voorzichtig het transfectiemengsel door op de buis te tikken en voeg vervolgens 10 μL van het transfectiemengsel rechtstreeks toe aan de bestaande groeimedia in de putten.
- Breng daarna de cellen terug naar de couveuse en laat de plasmiden gedurende 48 uur tot expressie komen. Vervanging van de groeimedia is niet nodig.
- Bewaak de transfectie-efficiëntie door GFP-fluorescentie met behulp van een fluorescentiemicroscoop. HEK293T-cellen worden efficiënt getransfecteerd door deze methode en >80% van de cellen zou GFP na 48 uur tot expressie moeten brengen.
3. Meting van luciferase-activiteit
OPMERKING: Luciferase-activiteit wordt beoordeeld met behulp van een in de handel verkrijgbaar systeem dat zowel Firefly als Renilla luciferase (Materiaaltabel) test volgens het protocol van de fabrikant.
- Zuig de kweekmedia zorgvuldig op uit getransfecteerde HEK293T-cellen en was de cellen vervolgens met koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Aspirateer de PBS en lyseer de cellen door 25 μL niet-denaturerende lysisbuffer toe te voegen en incubeer gedurende 15 minuten met zacht schommelen op ijs.
- Voeg daarna 20 μL van het resulterende lysaat (er is geen centrifugatie nodig) toe aan een nieuwe 96-well testplaat met 100 μL van een Firefly luciferase substraatreagens. Meng het bord voorzichtig door te tikken.
- Plaats de plaat op een platenlezer en meet de luminescentie met behulp van een topdetector met een leeshoogte van 1 mm en een integratietijd van 1 s.
OPMERKING: De versterking van de detector moet mogelijk worden aangepast op basis van de sterkte van het signaal. - Voeg onmiddellijk na het uitlezen van de Firefly luciferase luminescentie 100 μL Renilla luciferase substraat toe aan de putten. Deze stap dooft tegelijkertijd de Firefly luciferase-activiteit tijdens het beoordelen van renilla luciferase-activiteit. Meng de monsters door voorzichtige beweging van de plaat en meet de luminescentie opnieuw om de Renilla luciferase-activiteit te beoordelen.
OPMERKING: Hoewel andere platen voor deze test kunnen worden gebruikt, zal het gebruik van platen met zwarte frames en witte putten de meest gevoelige resultaten opleveren, omdat dit het luciferasesignaal versterkt en ruis minimaliseert. - Kwantificeer de reacties van de verslaggever als de Firefly luciferase to Renilla luciferase ratio (Firefly/Renilla) en gemiddelde de waarden van de drievoudige metingen. Normaliseer daarna de Firefly/Renilla-waarde voor elke variant tegen de waarden voor wild-type (WT) Ube3a-expressiecellen om de relatieve activiteit van varianteiwitten te vergelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grootschalige functionele screening van Ube3a missense-varianten identificeert een breed landschap van verlies- en gain-of-function-mutaties
Eerder werk met Ube3a-mutanten suggereerde dat de Wnt-respons kan dienen als een verslaggever van cellulaire UBE3A-eiwitactiviteit. Deze waarnemingen werden uitgebreid en aanvullende validatie-experimenten werden uitgevoerd om te onderzoeken of de BAR-test geschikt is om een reeks UBE3A-activiteiten in de cel te rapporteren. Ten eerste werden HEK293T-cellen getransfecteerd met verschillende hoeveelheden plasmide-DNA die coderen voor menselijk WT Ube3a. Dit experiment toonde aan dat de BAR-respons lineair verandert met de hoeveelheid Ube3a getransfecteerd in cellen (figuur 2A). Ten tweede werd de BAR-test getest met behulp van plasmide-DNA dat codeert voor ziektegerelateerde varianten die eerder in de literatuur werden gekarakteriseerd22. Onder deze waren goedaardige varianten (R39H en A178T), een autisme-gekoppelde gain-of-function variant (T458A), en een verzameling bevestigde Angelman syndroom-gebonden varianten die een verlies van UBE3A-functie veroorzaken via verschillende mechanismen15,22. De BAR-test identificeerde correct elke variant (figuur 2B), inclusief alle varianten van functieverlies, wat de nauwkeurigheid en algemeenheid van deze methode aantoont18.
De BAR-test werd gebruikt om 152 missense-varianten te screenen, waarvan de meeste werden geïdentificeerd uit de ClinVar-database. Vergelijkbaar met genetisch bewijs met betrekking tot variaties in het aantal kopieën in Ube3a-afhankelijke aandoeningen, was de functionele impact van missense-varianten breed en omvatte goedaardige varianten, evenals zowel functieverlies- als functieversterkingsvarianten (figuur 3) 18. Van bijzonder belang was dat de gain-of-function-varianten die met deze methode werden geïdentificeerd allemaal nieuw waren, en de daaropvolgende validatie suggereerde sterk dat ze een subklasse van Ube3a-afhankelijke aandoeningen definiëren met fenotypen die verschillen van het klassieke Angelman-syndroom18.
Het effect van missense-varianten is vaak onvoorspelbaar, wat de noodzaak van functionele beoordeling onderstreept
Een intrigerende observatie van de functionele screening van Ube3a-varianten is dat veranderingen op sommige aminozuurposities drastisch verschillende effecten veroorzaken, waardoor het belang van empirische variantbeoordelingwordt onderstreept 18. Drie personen werden bijvoorbeeld geïdentificeerd met varianten op de glutamine 588 (Q588) positie in UBE3A die een gain-of-function glutamaat substitutie (Q588E), een verlies-van-functie arginine substitutie (Q588R) en een ander verlies-van-functie proline substitutie (Q588P; Figuur 4A). Een uitgebreide mutatiebenadering werd gebruikt om de Q588-positie te muteren naar elk mogelijk aminozuur. Toen de activiteit van deze varianten werd gemeten met behulp van de BAR-test, toonde dit aan dat elk negatief geladen aminozuur op de 588-positie een hyperactief enzym produceert (figuur 4B). Dit inzicht leverde belangrijke functionele aanwijzingen op die de ontdekking mogelijk maakten van een nieuwe site binnen het HECT-domein van UBE3A die ubiquitineketenverlengingfaciliteert 18.
Figuur 1: PCR-afhankelijke mutagenese van Ube3a. (A) Weergave van de Ube3a-expressievector die relevante beperkingsplaatsen aangeeft. (B) De DNA-sequentie die codeert voor UBE3A wordt bovenaan weergegeven. Het Q588 codon wordt aangegeven met vette letters. De Q588E mutagenese primer (Mut. primer) wordt uitgelijnd met de UBE3A-sequentie weergegeven. De rode letters geven de gemuteerde plaats aan. (C) Een schema van de PCR om de megaprimer te genereren en het DNA-fragment dat wordt gebruikt om het Q588E-fragment te subclone. De positie van de Q588E-mutatie wordt aangegeven met het rode sterretje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Validatie van de BAR-test als een verslaggever van UBE3A ubiquitine ligase-activiteit. (A) HEK293T-cellen getransfecteerd met toenemende hoeveelheden plasmide die coderen voor WT UBE3A vertonen een lineaire toename van de BAR-respons. Gemiddelde waarden worden weergegeven voor Firefly/Renilla luciferase ratio's ± standaard fout (SE). N= 3 onafhankelijke experimenten. (B) Eerder gekarakteriseerde Ube3a-varianten werden getest in de BAR-test. Reacties werden genormaliseerd naar WT UBE3A en de waarden worden weergegeven als het gemiddelde ± SE. Het aantal experimenten (n) en p-waarden berekend met behulp van een t-test met één monster (tweezijdig) met Benjamini-Hochberg meervoudige vergelijkingscorrectie (FDR = 0,05) is als volgt: GFP, n = 19, ***p = 1,733 × 10−31; WT UBE3A, n = 19; UBE3A LD, n = 19, ***p = 1,519 × 10−31; R39H, n = 3, p = 0,567; A178T, n = 4, p = 0,828; T485A, n = 5, *p = 0,019; C21Y, n = 3, ***p = 8,725 × 10−6; C117R, n = 3, ***p = 3,419 × 10−4; N243K, n = 3, **p = 0,0072; E269G, n = 3, **p = 7,787 × 10−4; L273F, n = 3, **p = 0,0052; S349P, n = 3, **p = 0,0016; L502P, n = 3, **p = 0,0033; R506C, n = 3, **p = 0,0033; T106K, n = 6, **p = 0,0,0078; T106P, n = 3, **p = 0,0013; I130T, n = 6, *p = 0,016; R477P, n = 3, ***p = 4,24 × 10−4; M478I, n = 3, ***p = 3,39 × 10−4; R482P, n = 3, **p = 5,82 × 10−4; I329T, n = 5, ***p = 1,22 × 10−5; E550L, n = 3, *p = 0,0013. Gegevens overgenomen met toestemming van Weston et al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: UBE3A-varianten die een breed scala aan functionele effecten omvatten. BAR-testscreening van 152 Ube3a-varianten met goedaardige (grijs), functieverlies (blauw) en gain-of-function (rode) mutaties ten opzichte van WT UBE3A. Significantie werd bepaald met behulp van een t-test met één monster (two-tailed) met Benjamini-Hochberg meervoudige vergelijkingscorrectie (FDR = 0,05). Rood, gain-of-function; Grijs, geen verandering ten opzichte van WT UBE3A; Blauw, functieverlies. Gegevens overgenomen met toestemming van Weston et al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: UBE3A-varianten die een breed scala aan functionele effecten omvatten. (A) BAR-testresultaten van varianten op positie 588 van UBE3A die zowel verlies- als gain-of-function-substituties laten zien. Q588E, n = 6; Q588P, n = 3; Q588R, n = 4; p < 0,0005, One-sample t-test (two-tailed) met Benjamini-Hochberg multiple comparison correction (FDR = 0,05). (B) Warmteplot met genormaliseerde BAR-resultaten voor uitgebreide mutatieanalyse op positie 588 in UBE3A. De witte arcering vertegenwoordigt WT UBE3A-activiteitsniveaus, de blauwe arcering duidt op functieverlies en de rode arcering geeft functieversterking aan. De schaalbalk toont de procentuele verandering ten opzichte van WT UBE3A. N = 3 onafhankelijke experimenten voor Q588S, Q588T, Q588N, Q588K, Q588P, Q588M, Q588G, Q588A, Q588F, Q588Y, Q588W, Q588L, Q588V, Q588I, Q588C; n = 8 voor Q588E, n = 6 voor Q588D, n = 5 voor Q588R, n = 4 voor Q588H, *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. One-sample t-test (two-tailed) met Benjamini-Hochberg meervoudige vergelijkingscorrectie (FDR = 0,05). Gegevens overgenomen met toestemming van Weston et al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam | Volgorde | Gebruikt voor | |
| Primer 1 | GATTATATTATGACAATAGAA TTCGCATGTACAGTGAAC |
Ube3a EcoRI-gevoel | |
| Mut. Primer | CCAGACCCAGTACTATGCCAAT CAGAGTAAACTCACCCTCAGTT TCAAAAGAAGATGGATTAAACC |
UBE3A Q588E mutagenese antisense | |
| Primer 2 | ATTATATTCCCGGGTTACAGCAT GCCAAATCCTTTGG |
Ube3a XmaI antisense | | |
Tabel 1: Primers gebruikt voor UBE3A Q588E mutagenese.
| 1e ronde PCR | |
| Reagens | Aantal reacties |
| 5x high-fidelity buffer | 10 μL |
| dNTP (10 mM voorraad) | 1 μL |
| Primer 1 (10 mM voorraad) | 1 μL |
| Primer 2 (10 mM voorraad) | 1 μL |
| WT-Ube3a DNA (150 ng/μL voorraad) | 1 μL |
| H2O | 35 μL |
| High-fidelity DNA polymerase | 1 μL |
| Totaal volume | 50 μL |
| 2e ronde PCR | |
| Reagens | Aantal reacties |
| 5x high-fidelity buffer | 10 μL |
| dNTP (10 mM voorraad) | 1 μL |
| Primer 3 (10 mM voorraad) | 1 μL |
| Gezuiverd PCR-product (Megaprimer) | 30 μL |
| WT-Ube3a DNA (150 ng/μL voorraad) | 1 μL |
| H2O | 6 μL |
| High-fidelity DNA polymerase | 1 μL |
| Totaal volume | 50 μL |
Tabel 2: PCR-parameters voor mutagenese.
| 1e ronde PCR | ||
| Stap | Temperatuur | Tijd |
| Initiële denaturatie | 95 °C | 2 min. |
| (1 cyclus) | ||
| Denaturatie | 95 °C | 30 s |
| Annealing | 50 °C | 20 s |
| Extensie | 72 °C | 15 s |
| (30 cycli) | ||
| Definitieve verlenging | 72 °C | 1 min |
| Houden | 4 °C | Oneindig |
| 2e ronde PCR | ||
| Stap | Temperatuur | Tijd |
| Initiële denaturatie | 95 °C | 2 min. |
| (1 cyclus) | ||
| Denaturatie | 95 °C | 30 s |
| Annealing | 50 °C | 20 s |
| Extensie | 72 °C | 35 s |
| (30 cycli) | ||
| Definitieve verlenging | 72 °C | 1 min |
| Houden | 4 °C | Oneindig |
Tabel 3: PCR-programmaparameters voor mutagenese.
| Reagens | Werkconcentratie | 1x transfectie | 3,5x mastermix |
| pGL3 BAR plasmide | 100 ng/μL | 0,5 μL | 1,75 μL |
| pTK Renilla plasmide | 100 ng/μL | 0,05 μL | 0,175 μL |
| Ube3a plasmide | 100 ng/μL | 0,4 μL | 1,4 μL |
| DMEM aangevuld met glutamine | 8,65 μL | 30,275 μL | |
| Transfectiereagens | 0,4 μL | 1,4 μL |
Tabel 4: Transfectiemengsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol biedt een efficiënte en schaalbare methode om de enzymatische activiteit van Ube3a-varianten te beoordelen. Er zijn verschillende technische details die een zorgvuldige overweging rechtvaardigen bij het gebruik van deze test. Een overweging is de keuze van Wnt reporter plasmiden die in deze test worden gebruikt. Het hier beschreven protocol maakt specifiek gebruik van de β-catenine activated reporter (BAR)21, een reporter die een concatemeer van 12 T-cell factor (TCF) responselementen bevat, gescheiden door specifiek ontworpen linkersequenties om recombinatie en verlies van TCF-bindingsplaatsen te minimaliseren. Er zijn aanvullende op luciferase gebaseerde Wnt-reporterplasmiden beschreven in de literatuur23, en hoewel eerdere studies aangeven dat sommige kunnen worden gebruikt om UBE3A-activiteit te beoordelen, is het BAR-plasmide het meest grondig voor dit doel gekarakteriseerd17,18. Ten tweede is de keuze voor Renilla luciferase plasmide van cruciaal belang. Een plasmide dat codeert voor Renilla luciferase wordt opgenomen tijdens de transfectiestap om de transfectie-efficiëntie te normaliseren. Het plasmide dat in dit protocol wordt gebruikt, drukt renilla luciferase constitutief uit onder controle van een thymidinekinase (TK) promotor (TK-Renilla). Het gebruik van plasmiden die andere promotors bevatten, zoals de veelgebruikte cytomegalovirus (CMV) promotor, kan leiden tot variabele uitkomsten in Renilla luciferase expressie.
Een tweede overweging is het gedrag van cellen, afhankelijk van het type en de partij FBS die worden gebruikt voor celkweek. FBS kan bijvoorbeeld variabel de groeisnelheid van HEK293T-cellen beïnvloeden. Het huidige protocol is geoptimaliseerd met cellen die een typische verdubbelingstijd van 18-24 uur vertonen, waardoor de celdichtheid op het moment van transfectie ongeveer ~ 4 × 104 cellen per put. Aangezien de celdichtheid de transfectie-efficiëntie kan beïnvloeden, moeten de celgroeisnelheden zorgvuldig door de gebruiker worden beoordeeld en moeten de celaantallen dienovereenkomstig worden aangepast op het moment van plating. Bovendien vereist de UBE3A-afhankelijke BAR-respons dat er tijdens het experiment een bepaalde hoeveelheid Wnt-ligand aanwezig is. In de meeste standaardomstandigheden zit er voldoende Wnt in de FBS om deze respons te stimuleren; deze reactie kan echter ook variëren. De titratie van plasmideverhoudingen die voor transfectie worden gebruikt, wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat de BAR-respons binnen het juiste lineaire bereik wordt gemeten. Een alternatieve benadering is het stimuleren van Wnt-signalering met behulp van een recombinant Wnt-ligand of Wnt-aangevuld groeimedium17.
Een voordeel van de BAR-test is dat het de ubiquitineligase-activiteit van alle Ube3a-isovormen kan rapporteren. Mensen drukken drie isovormen van Ube3a uit die verschillen op hun uiterste N-termini als gevolg van het gebruik van alternatieve transcriptionele startplaatsen24. De BAR-test biedt dezelfde uitlezingsagnostisch voor isovormen, en dus kan deze test worden gebruikt om alle Ube3a-varianten te beoordelen. Bovendien biedt de grootschalige karakterisering van Ube3a-varianten diepe structuurfunctiegegevens die nieuwe domeinen en mechanismen kunnen blootleggen die van cruciaal belang zijn voor de enzymfunctie. Een eerdere studie gebruikte variantgegevens om een ubiquitine-bindend domein binnen UBE3A te ontdekken dat ubiquitineketenverlengingvergemakkelijkt 18. Aanvullende structuurfunctiestudies zullen waarschijnlijk nieuwe inzichten opleveren in de biochemische mechanismen van UBE3A die kunnen worden gebruikt voor therapeutische ontwikkeling.
Er zijn enkele beperkingen aan de BAR-test die zorgvuldige overweging rechtvaardigen bij het bepalen van de pathogeniciteit van een variant. Vanwege de epigenetische inprenting van Ube3a in neuronen, kan deze test geen onderscheid maken tussen maternale en vaderlijke allelen, en aanvullend genetisch bewijs moet worden gewogen naast functionele gegevens om de pathogeniciteit van een variant te bepalen. Bovendien moeten aanvullende variabelen naast de ubiquitineligase-activiteit van UBE3A worden overwogen in de context van ziekte. Eerder werk toonde bijvoorbeeld aan dat nucleair gelokaliseerde UBE3A bijdraagt aan angelmansyndroompathologie25 en dat sommige varianten dit lokalisatiepatroon van het enzym26 verstoren. Er moeten dus aanvullende downstream-karakterisaties worden uitgevoerd om een volledig inzicht te krijgen in de bijdrage van Ube3a-varianten aan neurologische ontwikkelingspathologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; J.J.Y.), een NARSAD Young Investigator Award van de Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), een Research Fellowship van de Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.), en onderzoeksbeurzen van de Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), de Whitehall Foundation (J.J.Y.) en de NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
