Summary
Eine einfache und skalierbare Methode wurde entwickelt, um die funktionelle Bedeutung von Missense-Varianten in Ube3a zu bewerten, einem Gen, dessen Verlust und Funktionsgewinn sowohl mit dem Angelman-Syndrom als auch mit der Autismus-Spektrum-Störung verbunden sind.
Abstract
Der verstärkte Einsatz von Sequenzierung in der Medizin hat Millionen von kodierenden Varianten im menschlichen Genom identifiziert. Viele dieser Varianten kommen in Genen vor, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, aber die funktionelle Bedeutung der überwiegenden Mehrheit der Varianten bleibt unbekannt. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung von Varianten für Ube3a, ein Gen, das eine E3-Ubiquitin-Ligase kodiert, die sowohl mit Autismus als auch mit Angelman-Syndrom verbunden ist. Die Duplikation oder Verdreifachung von Ube3a ist stark mit Autismus verbunden, während seine Deletion das Angelman-Syndrom verursacht. Daher ist das Verständnis der Valenz von Veränderungen der UBE3A-Proteinaktivität wichtig für klinische Ergebnisse. Hier wird eine schnelle, zellbasierte Methode beschrieben, die Ube3a-Varianten mit einem Wnt-Signalweg-Reporter paart. Dieser einfache Assay ist skalierbar und kann verwendet werden, um die Wertigkeit und das Ausmaß von Aktivitätsänderungen in jeder Ube3a-Variante zu bestimmen. Darüber hinaus ermöglicht die Einrichtung dieser Methode die Generierung einer Fülle von Struktur-Funktions-Informationen, die verwendet werden können, um tiefe Einblicke in die enzymatischen Mechanismen von UBE3A zu gewinnen.
Introduction
Jüngste technologische Fortschritte haben die Sequenzierung von Exomen und Genomen in klinischen Umgebungen zur Routine gemacht 1,2. Dies hat zur Entdeckung einer großen Anzahl genetischer Varianten geführt, darunter Millionen von Missense-Varianten, die typischerweise eine Aminosäure in einem Protein verändern. Das Verständnis der funktionellen Bedeutung dieser Varianten bleibt eine Herausforderung, und nur ein kleiner Bruchteil (~2%) der bekannten Missense-Varianten hat eine klinische Interpretation 1,3.
Ein prominentes Beispiel für dieses Problem ist Ube3a, ein Gen, das für eine E3-Ubiquitin-Ligase kodiert, die auf Substratproteine für den Abbauabzielt 4. Ube3a befindet sich auf Chromosom 15q11-13 und wird ausschließlich aus dem mütterlich vererbten Allel 5,6,7 exprimiert. Beobachtungen aus der Krankheitsgenetik deuten stark darauf hin, dass eine unzureichende oder übermäßige Aktivität des UBE3A-Enzyms unterschiedliche neurologische Entwicklungsstörungen verursacht. Die Deletion des mütterlichen Chromosoms 15q11-13 verursacht das Angelman-Syndrom (AS)8, eine Störung, die durch schwere geistige Behinderung, motorische Beeinträchtigungen, Krampfanfälle, ein fröhliches Auftreten mit häufigem Lächeln und dysmorphe Gesichtszüge gekennzeichnetist 8,9,10. Im Gegensatz dazu verursacht die Duplikation oder Verdreifachung des mütterlichen Chromosoms 15q11-13 das Dup15q-Syndrom, eine heterogene Erkrankung, die als eine der häufigsten syndromalen Formen von Autismus anerkanntwird 11,12,13. Darüber hinaus gibt es Hunderte von Missense-Varianten, die in Ube3a identifiziert wurden, von denen die meisten als Varianten von ungewisser Signifikanz (VUS) gelten, da ihre funktionelle und klinische Bedeutung unbekannt ist. Daher besteht ein erhebliches Interesse an der Entwicklung von Methoden, die Ube3a-Varianten empirisch bewerten können, um festzustellen, ob sie zu neurologischen Entwicklungsstörungen beitragen.
Das UBE3A-Enzym gehört zur HECT-Domänenfamilie (homolog to E6-AP C-terminus) von E3-Ubiquitin-Ligasen, die alle die gleichnamige HECT-Domäne besitzen, die die biochemische Maschinerie enthält, die notwendig ist, um aktiviertes Ubiquitin von E2-Enzymen aufzunehmen und auf Substratproteine zu übertragen14. In der Vergangenheit stützte sich die Charakterisierung von E3-Enzymen auf rekonstituierte In-vitro-Systeme, die ein Ensemble gereinigter Proteineerfordern 4,15,16. Solche Methoden sind langsam und arbeitsintensiv und können die Aktivität einer großen Anzahl von Varianten nicht beurteilen. In früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass UBE3A den Wnt-Signalweg in HEK293T-Zellen aktiviert, indem es die Funktion des Proteasoms moduliert, um den Abbau von β-Catenin17 zu verlangsamen. Diese Erkenntnis ermöglicht den Einsatz von Wnt-Signalwegreportern als effiziente und schnelle Methode, um sowohl Loss- als auch Gain-of-Function-Varianten von Ube3a18 zu identifizieren. Das folgende Protokoll beschreibt detailliert eine Methode zur Erzeugung von Ube3a-Varianten sowie einen Luciferase-basierten Reporter zur Beurteilung von Veränderungen in der Aktivität von Ube3a-Varianten.
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Protocol
1. Mutagenese-Klonierung zur Erzeugung von Ube3a-Varianten
- Klonen Sie alle Ube3a-Varianten in das pCIG2-Plasmid (Abbildung 1A), einen bicistronischen Vektor, der einen Hühner-β-Aktin-Promotor und eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) für die EGFP-Expression19 enthält. Ube3a-Konstrukte in voller Länge enthalten eine N-terminale Myc-Tag-Sequenz und werden unter Verwendung einer 5'-SacI-Site und einer 3'-XmaI-Site in pCIG2 geklont. Darüber hinaus werden natürlich vorkommende EcoRI-, EcoRV- und PstI-Stellen innerhalb der Ube3a-Kodierungssequenz auch zum Subklonen von Fragmenten verwendet.
HINWEIS: De-identifizierte Varianten für Ube3a können über die Literatur und in öffentlich zugänglichen Repositorien wie der ClinVar-Datenbank1 bezogen werden. Zusätzliche nicht gemeldete Varianten können durch persönliche Kommunikation mit medizinischen Zentren erhalten werden. - Verwenden Sie eine angepasste zweistufige Megaprimer-Mutagenesemethode20 , um Mutationen in den Ube3a-Leserahmen einzuführen. Im ersten Schritt entwerfen Sie das mutagene Oligonukleotid, das die gewünschte Mutation enthält (das in diesem Protokoll gezeigte Beispiel ist die Erzeugung einer UBE3A Q588E-Variante), flankiert von mindestens 30 Basenpaaren (bp) der Homologie 5' und 3' zur Mutation (Abbildung 1B und Tabelle 1).
- Verwenden Sie das mutagene Oligonukleotid zusammen mit einem komplementären Oligonukleotid für die erste Runde der PCR, um einen 200-400 bp Megaprimer zu erzeugen, der die Mutation enthält (Abbildung 1C; Tabelle 2 und Tabelle 3). Verwenden Sie die gesamten 50 μL des PCR-Reaktionsvolumens für die Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung eines 1%igen Gels und anschließender Gelreinigung (Table of Materials). Eluieren Sie das PCR-Produkt in 30 μL deionisiertemH2O(diH2O) zur Verwendung in der zweiten PCR-Runde unten.
- Richten Sie die PCR der zweiten Runde wie angegeben ein (Abbildung 1C; Tabelle 2 und Tabelle 3). Dieser Schritt erzeugt größere DNA-Fragmente (typischerweise ~1-1,5 kb Länge), die die Mutations- und terminalen Restriktionsstellen enthalten, die für die Subklonierung geeignet sind (Abbildung 1C).
- Nach Abschluss der PCR-Reaktion wird das resultierende Produkt mit einem PCR-Aufreinigungskits (Table of Materials) gereinigt. Eluieren Sie in 30 μL und verdauen Sie das gesamte gereinigte Produkt und das pCIG2 Ube3a WT-Konstrukt mit den entsprechenden Restriktionsenzymen (das Beispiel zeigt die Verdauung mit EcoRI und XmaI).
- Nach 2 h Aufschluss bei 37 °C die Aufschlussprodukte durch Agarosegelelektrophorese (1% Gel) auflösen und die entsprechenden Produkte gelreinigen. Richten Sie Ligaturen gemäß dem Protokoll des Herstellers (Table of Materials) ein, wandeln Sie die Ligationsprodukte in einen DH10B-Bakterienstamm (Table of Materials) um und legen Sie dann eine Platte mit Ampicillin (100 μg / ml) Auswahl.
- Wählen Sie am nächsten Tag zwei bis vier Kolonien aus, um 3-ml-Kulturen mit Luria-Brühe (LB) und 100 μg / ml Ampicillin zu impfen. Lassen Sie die Kulturen über Nacht bei 37 °C in einem Orbitalbrutschrank mit Schütteln (225 U/min) wachsen.
- Verwenden Sie am nächsten Tag 1-1,5 ml der Bakterienkultur, um die Plasmid-DNA (Table of Materials) zu minimieren. Speichern Sie die restliche Kultur, indem Sie sie bei 4 °C platzieren. Screenen Sie die miniprepped Plasmide durch Sanger-Sequenzierung mit einem Oligonukleotid, das ~ 200 bp von der gewünschten Mutation bindet.
- Verwenden Sie die bei 4 °C gespeicherten Bakterienkulturen, um 50-ml-Kulturen auf das richtige Plasmid (Table of Materials) umzuimpfen. Sequenzieren Sie die Ube3a-Kodierungssequenz vollständig, um die korrekte Sequenz der DNA zu validieren.
- Erstellen Sie Arbeitsbestände von Ube3a-Variantenplasmiden sowie dem β-Catenin-aktivierten Reporter (BAR)21, TK-Renilla-Luciferase, ligasetotem Ube3a (UBE3A C820A-Mutation) und pCIG2-leerem Vektor in einer Konzentration von 100 ng/μL unter Verwendung von sterilemH2Ofür die nachfolgenden Transfektionsschritte.
2. Vorbereitung und Transfektion menschlicher embryonaler Nierenzellen 293T (HEK293T)
- Durchführung der Assays an HEK293T-Zellen, die in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gezüchtet wurden, das mit Glutamin, 10% fetalem Rinderserum (FBS) und antibiotisch-antimykotischem Wirkstoff wie zuvor beschrieben vorergänzt wurde17. Die Zellen werden in einem sterilen, befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 gezüchtet.
- Mit einer Biosicherheitswerkbank werden die suspendierten HEK293T-Zellen zunächst auf gewebekulturbehandelte 96-Well-Platten mit flachem Boden mit einer Dichte von 2,2 × 104 Zellen pro Vertiefung in 100 μL Kulturmedien geschichtet und über Nacht wachsen lassen.
- Am zweiten Tag transfizieren Sie die Zellen in einer Biosicherheitswerkbank mit Firefly- und Renilla-Luciferase-Reporterplasmiden (Tabelle 4) und Ube3a-Plasmiden in dreifacher Ausfertigung. Die Transfektionen werden in 10 μL Gesamtvolumen pro Vertiefung unter Verwendung eines 10:1:8-Verhältnisses von Plasmiden (50 ng BAR, 5 ng TK-Renilla bzw. 40 ng Ube3a-Plasmid pro Well) durchgeführt, wie zuvor beschrieben18, und 0,4 μL Transfektionsreagenz (Tabelle 4).
HINWEIS: Für jedes Experiment werden auch ein leerer Vektor (nur GFP) und ein Plasmid, das für Ligase-totes Ube3a kodiert, transfiziert, um als Negativkontrollen zu dienen. - Erstellen Sie eine Mastermischung für die Transfektionen für jede Variante in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (Tabelle 4) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur (RT) für 15 min. Nach der Inkubation rühren Sie die Transfektionsmischung vorsichtig durch Klopfen des Röhrchens und fügen Sie dann 10 μL der Transfektionsmischung direkt zu den vorhandenen Wachstumsmedien in den Vertiefungen hinzu.
- Danach bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück und lassen Sie die Plasmide 48 h lang exprimieren. Ein Austausch der Wachstumsmedien ist nicht erforderlich.
- Überwachen Sie die Transfektionseffizienz durch GFP-Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop. HEK293T-Zellen werden mit dieser Methode effizient transfiziert, und >80% der Zellen sollten nach 48 h GFP exprimieren.
3. Messung der Luciferase-Aktivität
HINWEIS: Die Luciferase-Aktivität wird mit einem kommerziell erhältlichen System bewertet, das sowohl Firefly als auch Renilla luciferase (Table of Materials) gemäß dem Protokoll des Herstellers untersucht.
- Saugen Sie die Kulturmedien vorsichtig aus transfizierten HEK293T-Zellen ab und waschen Sie die Zellen dann mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Das PBS absaugen und die Zellen durch Zugabe von 25 μL nicht denaturierendem Lysepuffer lysieren und 15 min unter leichtem Schaukeln auf Eis inkubieren.
- Anschließend werden 20 μL des resultierenden Lysats (keine Zentrifugation erforderlich) in eine neue 96-Well-Assay-Platte gegeben, die 100 μL eines Firefly-Luciferase-Substratreagenz enthält. Mischen Sie den Teller vorsichtig durch Tippen.
- Laden Sie die Platte auf einen Plattenleser und messen Sie die Lumineszenz mit einem Top-Detektor mit einer Lesehöhe von 1 mm und einer Integrationszeit von 1 s.
HINWEIS: Die Verstärkung des Detektors muss möglicherweise basierend auf der Stärke des Signals angepasst werden. - Unmittelbar nach dem Lesen der Firefly-Luciferase-Lumineszenz 100 μL Renilla-Luciferase-Substrat in die Vertiefungen geben. Dieser Schritt löscht gleichzeitig die Firefly-Luciferase-Aktivität und bewertet gleichzeitig die Renilla-Luciferase-Aktivität. Mischen Sie die Proben durch sanftes Rühren der Platte und messen Sie erneut die Lumineszenz, um die Renilla-Luciferase-Aktivität zu beurteilen.
HINWEIS: Während andere Platten für diesen Assay verwendet werden können, liefert die Verwendung von Platten mit schwarzen Rahmen und weißen Vertiefungen die empfindlichsten Ergebnisse, da dies das Luciferase-Signal verstärkt und gleichzeitig das Rauschen minimiert. - Quantifizieren Sie die Antworten des Reporters als Firefly-Luciferase zu Renilla-Luciferase-Verhältnis (Firefly / Renilla) und mitteln Sie die Werte der dreifachen Messungen. Normalisieren Sie anschließend den Firefly/Renilla-Wert für jede Variante mit den Werten für Wildtyp-(WT) Ube3a-exprimierende Zellen, um die relative Aktivität varianter Proteine zu vergleichen.
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Representative Results
Großflächiges funktionelles Screening von Ube3a-Missense-Varianten identifiziert eine breite Landschaft von Loss- und Gain-of-Function-Mutationen
Frühere Arbeiten mit Ube3a-Mutanten deuteten darauf hin, dass die Wnt-Antwort als Reporter der zellulären UBE3A-Proteinaktivität dienen kann. Diese Beobachtungen wurden erweitert und zusätzliche Validierungsexperimente durchgeführt, um zu untersuchen, ob der BAR-Assay geeignet ist, eine Reihe von UBE3A-Aktivitäten in der Zelle zu melden. Zunächst wurden HEK293T-Zellen mit unterschiedlichen Mengen an Plasmid-DNA transfiziert, die für humanes WT Ube3a kodiert. Dieses Experiment zeigte, dass sich die BAR-Antwort linear mit der Menge an Ube3a ändert, die in Zellen transfiziert wird (Abbildung 2A). Zweitens wurde der BAR-Assay mit Plasmid-DNA getestet, die krankheitsgebundene Varianten kodiert, die zuvor in der Literatur22 charakterisiert wurden. Darunter waren gutartige Varianten (R39H und A178T), eine autismus-verknüpfte Gain-of-Function-Variante (T458A) und eine Sammlung bestätigter Angelman-Syndrom-verknüpfter Varianten, die einen Verlust der UBE3A-Funktion durch verschiedene Mechanismen verursachen15,22. Der BAR-Assay identifizierte jede Variante korrekt (Abbildung 2B), einschließlich aller Varianten mit Funktionsverlust, was die Genauigkeit und Allgemeingültigkeit dieser Methode18 zeigt.
Der BAR-Assay wurde verwendet, um 152 Missense-Varianten zu screenen, von denen die meisten aus der ClinVar-Datenbank identifiziert wurden. Ähnlich wie bei genetischen Beweisen bezüglich Kopienzahlvariationen bei Ube3a-abhängigen Erkrankungen waren die funktionellen Auswirkungen von Missense-Varianten breit und umfassten gutartige Varianten sowie sowohl Funktionsverlust- als auch Funktionsgewinnvarianten (Abbildung 3)18. Von besonderem Interesse war, dass die mit dieser Methode identifizierten Gain-of-Function-Varianten alle neu waren, und die anschließende Validierung deutete stark darauf hin, dass sie eine Unterklasse von Ube3a-abhängigen Störungen mit Phänotypen definieren, die sich vom klassischen Angelman-Syndromunterscheiden 18.
Die Auswirkungen von Missense-Varianten sind oft unvorhersehbar, was die Notwendigkeit einer funktionalen Bewertung unterstreicht
Eine faszinierende Beobachtung aus dem funktionellen Screening von Ube3a-Varianten ist, dass Veränderungen an einigen Aminosäurepositionen drastisch unterschiedliche Effekte hervorrufen, was die Bedeutung der empirischen Variantenbewertung unterstreicht18. Zum Beispiel wurden drei Individuen mit Varianten an der Position von Glutamin 588 (Q588) in UBE3A identifiziert, die eine Gain-of-Function-Glutamatsubstitution (Q588E), eine Funktionsverlustsubstitution (Q588R) und eine weitere Funktionsverlust-Prolinsubstitution (Q588P; Abbildung 4A). Ein umfassender Mutationsansatz wurde verwendet, um die Q588-Position zu jeder möglichen Aminosäure zu mutieren. Als die Aktivität dieser Varianten mit dem BAR-Assay gemessen wurde, zeigte sich, dass jede negativ geladene Aminosäure an der Position 588 ein hyperaktives Enzym produziert (Abbildung 4B). Diese Erkenntnis lieferte wichtige funktionelle Hinweise, die die Entdeckung einer neuen Stelle innerhalb der HECT-Domäne von UBE3A ermöglichten, die die Verlängerung der Ubiquitinketteerleichtert 18.
Abbildung 1: PCR-abhängige Mutagenese von Ube3a. (A) Darstellung des Ube3a-Expressionsvektors unter Angabe relevanter Restriktionsstellen. (B) Die DNA-Sequenz, die UBE3A kodiert, ist oben dargestellt. Das Q588-Codon ist fett gedruckt. Der Q588E-Mutagenese-Primer (Mut. Primer) ist auf die UBE3A-Sequenz ausgerichtet. Die rote Beschriftung zeigt die mutagenisierte Stelle an. (C) Ein Schema der PCR zur Erzeugung des Megaprimers und des DNA-Fragments, das zum Subklonieren des Q588E-Fragments verwendet wird, wird gezeigt. Die Position der Q588E-Mutation wird durch das rote Sternchen angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Validierung des BAR-Assays als Reporter der UBE3A-Ubiquitin-Ligase-Aktivität. (A) HEK293T-Zellen, die mit zunehmenden Mengen an Plasmid transfiziert wurden, das WT UBE3A kodiert, zeigen einen linearen Anstieg der BAR-Antwort. Mittelwerte werden für Firefly/Renilla-Luciferase-Verhältnisse ± Standardfehler (SE) angezeigt. N= 3 unabhängige Experimente. (B) Zuvor charakterisierte Ube3a-Varianten wurden im BAR-Assay getestet. Die Antworten wurden auf WT UBE3A normalisiert, und die Werte werden als Mittelwert ± SE angezeigt. Die Anzahl der Experimente (n) und p-Werte, die mit einem Ein-Stichproben-t-Test (zweiseitig) mit Benjamini-Hochberg-Mehrfachvergleichskorrektur (FDR = 0,05) berechnet wurden, ist wie folgt: GFP, n = 19, ***p = 1,733 × 10−31; WT UBE3A, n = 19; UBE3A LD, n = 19, ***p = 1,519 × 10−31; R39H, n = 3, p = 0,567; A178T, n = 4, p = 0,828; T485A, n = 5, *p = 0,019; C21Y, n = 3, ***p = 8,725 × 10−6; C117R, n = 3, ***p = 3,419 × 10−4; N243K, n = 3, **p = 0,0072; E269G, n = 3, **p = 7,787 × 10−4; L273F, n = 3, **p = 0,0052; S349P, n = 3, **p = 0,0016; L502P, n = 3, **p = 0,0033; R506C, n = 3, **p = 0,0033; T106K, n = 6, **p = 0,0,0078; T106P, n = 3, **p = 0,0013; I130T, n = 6, *p = 0,016; R477P, n = 3, ***p = 4,24 × 10−4; M478I, n = 3, ***p = 3,39 × 10−4; R482P, n = 3, **p = 5,82 × 10−4; I329T, n = 5, ***p = 1,22 × 10−5; E550L, n = 3, *p = 0,0013. Daten abgedruckt mit Genehmigung von Weston et al.18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: UBE3A-Varianten mit einem breiten Spektrum funktionaler Effekte. BAR-Assay-Screening von 152 Ube3a-Varianten mit gutartigen (grauen), Funktionsverlust (blau) und Funktionsgewinn (rot) Mutationen relativ zu WT UBE3A. Die Signifikanz wurde mit einem Ein-Stichproben-t-Test (zweiseitig) mit Benjamini-Hochberg-Mehrfachvergleichskorrektur (FDR = 0,05) bestimmt. Rot, Verstärkung der Funktion; Grau, keine Änderung gegenüber WT UBE3A; Blau, Funktionsverlust. Daten abgedruckt mit Genehmigung von Weston et al.18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: UBE3A-Varianten mit einem breiten Spektrum funktioneller Effekte. (A) BAR-Assay-Ergebnisse von Varianten an Position 588 von UBE3A, die sowohl Loss- als auch Gain-of-Function-Substitutionen zeigen. Q588E, n = 6; Q588P, n = 3; Q588R, n = 4; p < 0,0005, Ein-Stichproben-t-Test (zweiseitig) mit Benjamini-Hochberg-Mehrfachvergleichskorrektur (FDR = 0,05). (B) Wärmediagramm mit normalisierten BAR-Ergebnissen für eine umfassende Mutationsanalyse an Position 588 in UBE3A. Die weiße Schattierung stellt WT UBE3A-Aktivitätsniveaus dar, die blaue Schattierung zeigt Funktionsverlust an und die rote Schattierung zeigt Funktionsgewinn an. Der Maßstabsbalken zeigt die prozentuale Änderung relativ zu WT UBE3A. N = 3 unabhängige Experimente für Q588S, Q588T, Q588N, Q588K, Q588P, Q588M, Q588G, Q588A, Q588F, Q588Y, Q588W, Q588L, Q588V, Q588I, Q588C; n = 8 für Q588E, n = 6 für Q588D, n = 5 für Q588R, n = 4 für Q588H, *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. Ein-Stichproben-t-Test (zweiseitig) mit Benjamini-Hochberg-Mehrfachvergleichskorrektur (FDR = 0,05). Daten abgedruckt mit Genehmigung von Weston et al.18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Name | Reihenfolge | Verwendet für | |
| Grundierung 1 | GATTATATTATGACAATAGAA TTCGCATGTACAGTGAAC |
Ube3a EcoRI sense | |
| Mut. Primer | CCAGACCCAGTACTATGCCAAT CAGAGTAAACTCACCCTCAGTT TCAAAAGAAGATGGATTAAACC |
UBE3A Q588E Mutagenese Antisense | |
| Grundierung 2 | ATTATATTCCCGGGTTACAGCAT GCCAAATCCTTTGG |
Ube3a XmaI Antisense | |
Tabelle 1: Für UBE3A Q588E Mutagenese verwendete Primer.
| PCR der 1. Runde | |
| Reagenz | Reaktionsmenge |
| 5x High-Fidelity-Puffer | 10 μL |
| dNTP (10 mM Lager) | 1 μL |
| Primer 1 (10 mM Lager) | 1 μL |
| Primer 2 (10 mM Lager) | 1 μL |
| WT-Ube3a DNA (150 ng/μL Vorrat) | 1 μL |
| H2O | 35 μL |
| High-Fidelity-DNA-Polymerase | 1 μL |
| Gesamtvolumen | 50 μL |
| 2. Runde PCR | |
| Reagenz | Reaktionsmenge |
| 5x High-Fidelity-Puffer | 10 μL |
| dNTP (10 mM Lager) | 1 μL |
| Primer 3 (10 mM Lager) | 1 μL |
| Gereinigtes PCR-Produkt (Megaprimer) | 30 μL |
| WT-Ube3a DNA (150 ng/μL Vorrat) | 1 μL |
| H2O | 6 μL |
| High-Fidelity-DNA-Polymerase | 1 μL |
| Gesamtvolumen | 50 μL |
Tabelle 2: PCR-Parameter für die Mutagenese.
| PCR der 1. Runde | ||
| Schritt | Temperatur | Zeit |
| Erste Denaturierung | 95 °C | 2 Minuten |
| (1 Zyklus) | ||
| Denaturierung | 95 °C | 30 s |
| Glühen | 50 °C | 20 s |
| Erweiterung | 72 °C | 15 s |
| (30 Zyklen) | ||
| Endgültige Verlängerung | 72 °C | 1 min |
| Halten | 4 °C | Unendlich |
| 2. Runde PCR | ||
| Schritt | Temperatur | Zeit |
| Erste Denaturierung | 95 °C | 2 Minuten |
| (1 Zyklus) | ||
| Denaturierung | 95 °C | 30 s |
| Glühen | 50 °C | 20 s |
| Erweiterung | 72 °C | 35 s |
| (30 Zyklen) | ||
| Endgültige Verlängerung | 72 °C | 1 min |
| Halten | 4 °C | Unendlich |
Tabelle 3: PCR-Programmparameter für Mutagenese.
| Reagenz | Arbeitskonzentration | 1x Transfektion | 3,5-facher Master-Mix |
| pGL3 BAR Plasmid | 100 ng/μL | 0,5 μL | 1,75 μL |
| pTK Renilla-Plasmid | 100 ng/μL | 0,05 μL | 0,175 μL |
| Ube3a-Plasmid | 100 ng/μL | 0,4 μL | 1,4 μL |
| DMEM ergänzt mit Glutamin | 8,65 μL | 30,275 μL | |
| Transfektionsreagenz | 0,4 μL | 1,4 μL |
Tabelle 4: Transfektionsgemische.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll bietet eine effiziente und skalierbare Methode zur Beurteilung der enzymatischen Aktivität von Ube3a-Varianten. Es gibt mehrere technische Details, die bei der Verwendung dieses Assays sorgfältig berücksichtigt werden sollten. Eine Überlegung ist die Wahl der Wnt-Reporterplasmide, die in diesem Assay verwendet werden. Das hier beschriebene Protokoll verwendet speziell den β-Catenin-aktivierten Reporter (BAR)21, einen Reporter, der ein Konkatemer aus 12 T-Zell-Faktor (TCF)-Antwortelementen enthält, die durch speziell entwickelte Linkersequenzen getrennt sind, um die Rekombination und den Verlust von TCF-Bindungsstellen zu minimieren. Es gibt weitere Luciferase-basierte Wnt-Reporterplasmide, die in der Literatur23 beschrieben sind, und obwohl frühere Studien darauf hindeuten, dass einige zur Beurteilung der UBE3A-Aktivität verwendet werden können, wurde das BAR-Plasmid für diesen Zweck am gründlichsten charakterisiert17,18. Zweitens ist die Wahl des Renilla-Luciferase-Plasmids entscheidend. Ein Plasmid, das für Renilla luciferase kodiert, ist während des Transfektionsschritts enthalten, um die Transfektionseffizienz zu normalisieren. Das in diesem Protokoll verwendete Plasmid exprimiert konstitutiv Renilla luciferase unter der Kontrolle eines Thymidinkinase (TK)-Promotors (TK-Renilla). Die Verwendung von Plasmiden, die andere Promotoren enthalten, wie z. B. den weit verbreiteten Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, kann zu variablen Ergebnissen bei der Renilla-Luciferase-Expression führen.
Eine zweite Überlegung ist das Verhalten von Zellen in Abhängigkeit von der Art und Menge des FBS, das für die Zellkultur verwendet wird. Zum Beispiel kann FBS die Wachstumsrate von HEK293T-Zellen variabel beeinflussen. Das aktuelle Protokoll wurde mit Zellen optimiert, die eine typische Verdopplungszeit von 18-24 h aufwiesen, wodurch die Zelldichte zum Zeitpunkt der Transfektion etwa ~ 4 × 104 Zellen pro Vertiefung aufwies. Da die Zelldichte die Transfektionseffizienz beeinflussen kann, sollten die Zellwachstumsraten vom Anwender sorgfältig beurteilt und die Zellzahlen zum Zeitpunkt der Beschichtung entsprechend angepasst werden. Darüber hinaus erfordert die UBE3A-abhängige BAR-Antwort, dass während des Experiments eine gewisse Menge an Wnt-Liganden vorhanden ist. Unter den meisten Standardbedingungen ist genügend Wnt im FBS vorhanden, um diese Reaktion zu steuern. Diese Reaktion kann jedoch auch variieren. Die Titration der für die Transfektion verwendeten Plasmidverhältnisse wird empfohlen, um sicherzustellen, dass die BAR-Reaktion innerhalb des geeigneten linearen Bereichs gemessen wird. Ein alternativer Ansatz besteht darin, die Wnt-Signalisierung unter Verwendung eines rekombinanten Wnt-Liganden oder eines Wnt-ergänzten Wachstumsmediumszu stimulieren 17.
Ein Vorteil des BAR-Assays ist, dass er die Ubiquitin-Ligase-Aktivität aller Ube3a-Isoformen melden kann. Menschen exprimieren drei Isoformen von Ube3a , die sich an ihren extremen N-Termini aufgrund der Verwendung alternativer transkriptioneller Startstellen unterscheiden24. Der BAR-Assay liefert die gleiche Isoformen-unabhängige Ablesung, und daher kann dieser Assay zur Beurteilung aller Ube3a-Varianten verwendet werden. Darüber hinaus liefert die groß angelegte Charakterisierung von Ube3a-Varianten tiefe Struktur-Funktions-Daten, die neue Domänen und Mechanismen aufdecken können, die für die Enzymfunktion entscheidend sind. Eine frühere Studie verwendete Variantendaten, um eine Ubiquitin-bindende Domäne innerhalb von UBE3A zu entdecken, die die Ubiquitin-Kettenverlängerung erleichtert18. Zusätzliche Struktur-Funktions-Studien werden wahrscheinlich neue Einblicke in die biochemischen Mechanismen von UBE3A liefern, die für die therapeutische Entwicklung genutzt werden können.
Es gibt einige Einschränkungen des BAR-Assays, die bei der Bestimmung der Pathogenität einer Variante sorgfältig berücksichtigt werden sollten. Aufgrund der epigenetischen Prägung von Ube3a in Neuronen kann dieser Assay keine mütterlichen und väterlichen Allele unterscheiden, und zusätzliche genetische Beweise müssen neben funktionellen Daten abgewogen werden, um die Pathogenität einer Variante zu bestimmen. Darüber hinaus müssen zusätzliche Variablen jenseits der Ubiquitin-Ligase-Aktivität von UBE3A im Kontext der Erkrankung berücksichtigt werden. Zum Beispiel zeigten frühere Arbeiten, dass nuklear lokalisiertes UBE3A zur Angelman-Syndrom-Pathologie25 beiträgt und dass einige Varianten dieses Lokalisationsmuster des Enzyms26 stören. Daher müssen zusätzliche nachgeschaltete Charakterisierungen durchgeführt werden, um ein vollständiges Verständnis des Beitrags von Ube3a-Varianten zur neurologischen Entwicklungspathologie zu erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; J.J.Y.), einen NARSAD Young Investigator Award der Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), ein Forschungsstipendium der Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.) und Forschungsstipendien der Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), der Whitehall Foundation (J.J.Y.) und des NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
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