Summary
Das Nasenepithel ist die primäre Barrierestelle, auf die alle respiratorischen Krankheitserreger treffen. In dieser Arbeit skizzieren wir Methoden zur Verwendung von primären nasalen Epithelzellen, die als Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen (ALI) gezüchtet wurden, um menschliche Coronavirus-Wirt-Interaktionen in einem physiologisch relevanten System zu charakterisieren.
Abstract
Drei hochpathogene humane Coronaviren (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) und SARS-CoV-2 (2019) - sind aufgetaucht und haben in den letzten 20 Jahren erhebliche Krisen im Bereich der öffentlichen Gesundheit verursacht. Vier weitere HCoVs verursachen jedes Jahr einen signifikanten Anteil an Erkältungsfällen (HCoV-NL63, -229E, -OC43 und -HKU1), was die Bedeutung der Untersuchung dieser Viren in physiologisch relevanten Systemen unterstreicht. HCoVs dringen in die Atemwege ein und infizieren sich im Nasenepithel, dem primären Ort, an dem alle respiratorischen Krankheitserreger auftreten. Wir verwenden ein primäres nasales Epithelkultursystem, bei dem von Patienten stammende Nasenproben an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) gezüchtet werden, um Wirt-Pathogen-Interaktionen an diesem wichtigen Sentinel-Ort zu untersuchen. Diese Kulturen rekapitulieren viele Merkmale der In-vivo-Atemwege , einschließlich der vorhandenen Zelltypen, der Ziliarfunktion und der Schleimproduktion. Wir beschreiben Methoden zur Charakterisierung der viralen Replikation, des Wirtszelltropismus, der virusinduzierten Zytotoxizität und der Induktion des angeborenen Immunsystems in nasalen ALI-Kulturen nach HCoV-Infektion, wobei wir aktuelle Arbeiten zum Vergleich von letalen und saisonalen HCoVs als Beispiel verwenden1. Ein besseres Verständnis der Wirt-Pathogen-Interaktionen in der Nase hat das Potenzial, neue Angriffspunkte für antivirale Therapeutika gegen HCoVs und andere Atemwegsviren zu liefern, die wahrscheinlich in Zukunft auftauchen werden.
Introduction
Bisher wurden sieben humane Coronaviren (HCoVs) identifiziert, die eine Reihe von Atemwegserkrankungen verursachen2. Die häufigen oder saisonalen HCoVs (HCoV-NL63, -229E, -OC43 und -HKU1) sind typischerweise mit der Pathologie der oberen Atemwege assoziiert und verursachen jährlich schätzungsweise 10 % bis 30 % der Erkältungsfälle. Obwohl dies der typische klinische Phänotyp ist, der mit den häufigen HCoVs assoziiert ist, können diese Viren in Risikopopulationen, einschließlich Kindern, älteren Erwachsenen und immungeschwächten Personen, signifikantere Erkrankungen der unteren Atemwege verursachen 3,4. In den letzten 20 Jahren sind drei pathogene HCoVs aufgetaucht und haben erhebliche Notlagen im Bereich der öffentlichen Gesundheit verursacht, darunter das schwere akute respiratorische Syndrom (SARS)-CoV, das Atemwegssyndrom des Nahen Ostens (MERS)-CoV und SARS-CoV-2. Tödliche HCoVs sind mit schwereren Atemwegserkrankungen assoziiert, was durch die Sterblichkeitsrate von >34 % im Zusammenhang mit MERS-CoV-Fällen (894 Todesfälle bei über 2.500 Fällen seit dem Auftreten im Jahr 2012) deutlich wird5,6. Es ist wichtig zu beachten, dass die tödlichen HCoVs auch eine Reihe von Atemwegserkrankungen verursachen, von asymptomatischen Infektionen bis hin zu tödlichen Lungenentzündungen, wie bei der anhaltenden COVID-19-Pandemiezu sehen ist 7.
HCoVs gelangen wie andere respiratorische Erreger in die Atemwege und etablieren eine produktive Infektion im Nasenepithel8. Es wird angenommen, dass die Ausbreitung in die unteren Atemwege mit der Aspiration von der Mund-/Nasenhöhle in die Lunge verbunden ist, wo HCoVs eine bedeutendere Pathologie der unteren Atemwege verursachen 9,10,11. Somit dient die Nase als Ausgangspforte für den Viruseintritt und ist mit ihrer robusten mukoziliären Clearance-Maschinerie und einzigartigen angeborenen Immunmechanismen, die darauf abzielen, eine weitere Ausbreitung des Virus in die unteren Atemwege zu verhindern, die primäre Barriere für Infektionen12,13. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Nasenepithelzellen überdurchschnittlich hohe basale Konzentrationen von antiviralen Interferonen und Interferon-stimulierten Genen exprimieren, was darauf hindeutet, dass Nasenzellen auf frühe Reaktionen auf Atemwegsviren vorbereitet sein könnten14,15,16.
Wir haben zuvor von Patienten stammende primäre Nasenepithelzellen, die an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) gezüchtet wurden, verwendet, um HCoV-Wirt-Interaktionen in der Nase zu modellieren, wo HCoV-Infektionen beginnen. Nasale ALI-Kulturen sind sowohl für pathogene (SARS-CoV-2 und MERS-CoV) als auch für gängige HCoVs (HCoV-NL63 und HCoV-229E) permissiv und bieten verschiedene Vorteile gegenüber herkömmlichen Atemwegsepithelzelllinien wie A549 (eine Lungenadenokarzinom-Zelllinie)16,17. Nach der Differenzierung enthalten nasale ALI-Kulturen eine heterogene zelluläre Population und weisen viele der Funktionen auf, die vom in vivo Nasenepithel erwartet werden, wie z. B. die mukoziliäre Clearance-Maschinerie18. Nasenzellen bieten auch Vorteile gegenüber Kultursystemen der unteren Atemwege (z. B. humane Bronchialepithelzellen, HBECs), da die Gewinnung von Nasenepithelzellen durch zytologisches Zähneputzen im Vergleich zur Verwendung von Techniken wie der Bronchoskopie zur Erzielung von HBECs deutlich weniger invasiv ist 19,20,21.
In dieser Arbeit werden Methoden zur Nutzung dieses nasalen ALI-Kultursystems zur Charakterisierung von HCoV-Wirt-Interaktionen im Nasenepithel beschrieben. Wir haben diese Methoden in kürzlich veröffentlichten Arbeiten angewendet, um SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 und HCoV-229E 1,16,17 zu vergleichen. Obwohl diese Methoden und repräsentativen Ergebnisse die Untersuchung von HCoVs in diesem nasalen Zellmodell hervorheben, ist das System in hohem Maße anpassungsfähig an andere HCoVs sowie andere respiratorische Krankheitserreger. Darüber hinaus können diese Methoden breiter auf andere ALI-Kultursysteme angewendet werden, um die virale Replikation und den zellulären Tropismus sowie die Zytotoxizität und die Induktion des angeborenen Immunsystems nach einer Infektion zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die Verwendung von Nasenproben wurde vom University of Pennsylvania Institutional Review Board (Protokoll # 800614) und dem Philadelphia VA Institutional Review Board (Protokoll # 00781) genehmigt.
1. Infektion von nasalen ALI-Kulturen
ANMERKUNG: Die Gewinnung klinischer Proben sowie das Wachstum und die Differenzierung von nasalen ALI-Kulturen liegen außerhalb des Rahmens dieser Arbeit. Spezifische Methoden zur Kultivierung primärer nasaler Epithelzellen finden sich in kürzlich veröffentlichten Arbeiten, in denen diese Kulturen verwendet werden 18,22,23. Die folgenden Protokolle können auf Wunsch zusätzlich auf kommerziell erhältliche nasale epitheliale ALI-Kulturen angewendet werden. Die unten aufgeführten Protokolle und Volumina gelten für 24-Well-Plattentranswell-Einsätze (6,5 mm Durchmesser, 0,33cm2 Membranoberfläche). Wenn Sie ALI-Kulturen verwenden, die auf größeren Transwells (d. h. 12-Well-Platten, 12 mm Durchmesser, 1,12cm2 Oberfläche) gezüchtet wurden, passen Sie die Volumina proportional an, um die Transwell-Größe widerzuspiegeln.
- Tag vor der Infektion:
- ALI-Kulturen 3x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) apikal waschen (~200 μl erwärmtes PBS zugeben, 5 min in einen 37 °C warmen Inkubator geben, PBS absaugen und wiederholen).
- Basalmedium (500 μl) ersetzen.
- Lassen Sie die Kulturen bei der Temperatur, bei der Infektionen durchgeführt werden, über Nacht ausbalancieren (d. h. bei einer Infektion bei 33 °C sollten die Kulturen nach dem Waschen von PBS in einen 33 °C-Inkubator gegeben werden).
HINWEIS: HCoV, die mit einer Erkältung in Verbindung gebracht werden, wie HCoV-229E und HCoV-NL63, replizieren sich bei 33 °C effizienter. Darüber hinaus beträgt die Temperatur des in vivo Nasenepithels 33 °C (dies unterscheidet sich von der Temperatur der Lunge, die 37 °C beträgt).
- Verdünnen Sie das Virus nach Bedarf in serumfreiem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), um die gewünschte Infektionsvielfalt (MOI) in einem Gesamtinokulumvolumen von 50 μl zu erreichen.
HINWEIS: Infektionen wurden in der Regel bei MOI = 5 (hohes MOI) durchgeführt; Infektionen mit MOI = 0,5 (niedriges MOI) wurden jedoch auch für SARS-CoV-2 und Erkältungs-assoziierte HCoVs verwendet, und diese führen zu vergleichbaren Virushöchsttitern, jedoch mit variabler Kinetik (beide MOI sind akzeptabel). - Intrakulum apikal zugeben und die Kulturen für 1 Stunde zurück in den Inkubator geben.
- Platten während der Infektion alle 15 Minuten vorsichtig rocken (Platte fest in beiden Händen halten, nach vorne und hinten und von einer Seite zur anderen wippen, um eine gleichmäßige Adsorption des Virusinokulums zu gewährleisten).
- Nach 1 Stunde Inkubation wird das Virusinokulum abgesaugt und jede infizierte Kultur 3x mit PBS gewaschen, um sicherzustellen, dass das virale Inokulum entfernt wird (für jedes Waschen 200 μl PBS hinzufügen, 5 Minuten inkubieren und mit einer Pipette aspizieren oder entfernen).
- Falls gewünscht, entnehmen Sie die dritte PBS-Wäsche, um eine ausreichende Entfernung des eingebrachten Virus zu bestätigen.
- Ersetzen Sie das Basalmedium bei infizierten ALIs während der Infektion alle 72 Stunden durch frisches Medium.
2. Entnahme der apikalen Oberflächenflüssigkeit (ASL) und Titration des ausgeschiedenen Virus
- Zu vorbestimmten Zeitpunkten nach der Infektion werden 200 μl PBS in die apikale Kammer jedes infizierten Transwells gegeben.
HINWEIS: Relevante Zeitpunkte variieren je nach HCoV und reichen von 24 Stunden bis 192 Stunden nach der Infektion (siehe Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" für virale Replikationsdaten für verschiedene HCoVs). - Pipettieren Sie PBS 5x nach oben und unten, um eine maximale Sammlung des apikal ausgeschiedenen Virus zu gewährleisten, und sammeln Sie das gesamte Volumen in einem Mikrozentrifugenröhrchen (dies ist die ASL-Probe).
HINWEIS: ASL enthält neben Schleim und anderen Produkten, die apikal aus ALI-Kulturen abgesondert werden, auch ausgeschiedene Viruspartikel. - Quantifizierung infektiöser Viren bei ASL mittels Standard-Virusplaque-Assay (serielle Verdünnung virushaltiger Proben, um die Konzentration von Viruspartikeln zu quantifizieren).
HINWEIS: Die Zelltypen und die Inkubationszeit, die für den Plaque-Assay verwendet werden, hängen vom verwendeten Virus ab: SARS-CoV-2 (VeroE6-Zellen); MERS-CoV (VeroCCL81-Zellen); HCoV-NL63 (LLC-MK2-Zellen); HCoV-229E (Huh7-Zellen). Einzelheiten zur Durchführung von viralen Plaque-Assays gehen über den Rahmen dieses Manuskripts hinaus, wurden aber bereits in einer Veröffentlichung des Journal of Visualized Experiments (JoVE)24 beschrieben. - Falls gewünscht, sammeln Sie das Basalmedium zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion, um die Abwesenheit von basal freigesetztem Virus zu bestätigen. HCoVs werden in der Regel apikal aus nasalen Epithelzellen freigesetzt, bestätigen dies jedoch durch einen Plaque-Assay mit unverdünntem Basalmedium.
- ASL-Proben bei −80 °C lagern, wenn am Tag der Entnahme keine Quantifizierung mittels Plaque-Assay erfolgt.
3. Quantifizierung des intrazellulären Virus
- Nach der Entnahme der ASL-Probe wird jedes Transwell in eine saubere 24-Well-Platte gelegt, die mit 500 μl DMEM vorgeladen ist, die basal 2 % fötales Kälberserum (FBS) enthält.
HINWEIS: DMEM mit 2 % FBS wird verwendet, um das Virus während der nachfolgenden Gefrier-Auftau-Zyklen zu stabilisieren. - Waschen Sie jedes Transwell 3x apikal mit PBS, um sicherzustellen, dass das apikal ausgeschiedene Virus vollständig entfernt wird.
- Nach dem Absaugen, um die letzte PBS-Wäsche zu entfernen, geben Sie 100 μl DMEM mit 2 % FBS in das apikale Kompartiment.
- Bringen Sie die Platte mit Transwells mit apikalen und basalen Medien in einen Gefrierschrank von −80 °C und führen Sie drei aufeinanderfolgende Gefrier-Auftau-Zyklen durch, um die Zellen zu lysieren.
- Nach dem letzten Gefrier-Auftau-Zyklus apikale (100 μl) und basale (500 μl) Medien in ein sauberes Röhrchen geben.
- Bei 500 × g 10 min bei 4 °C zentrifugieren, um Zelltrümmer zu pelletieren.
- Sammle den Überstand ein. Dies ist die intrazelluläre Virusprobe für die Titration mittels Standard-Plaque-Assay.
HINWEIS: Während des Entnahmeprozesses erfolgt eine dreifache Verdünnung im Vergleich zur ASL-Entnahme. ASL-Proben werden in 200 μl PBS gesammelt, während intrazelluläre Virusproben in einem Gesamtvolumen von 600 μl gesammelt werden.
4. Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER)
HINWEIS: Für die TEER-Messung sollte PBS mit Kalzium und Magnesium (PBS + Ca 2+/Mg2+) ergänzt werden. Es wird ein Epithelvolt/Ohmmeter verwendet, das auf die Ablesung in Ohm eingestellt ist (siehe Materialtabelle).
- Reinigen, balancieren und leeren Sie das EVOM-Instrument gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie ein "leeres" Transwell ohne zugesetzte Nasenzellen zum Ausblenden. Zeichnen Sie die TEER-Messung des Blindwerts auf.
HINWEIS: Wenn mehrere Viren verwendet werden, muss das EVOM-Gerät zwischen den Bedingungen streng gereinigt werden, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden (Waschen mit 70 % Ethanol, gefolgt von deionisiertem Wasser ist ausreichend). - Legen Sie jedes infizierte Transwell in eine vorbeschriftete, saubere 24-Well-Platte mit 500 μl PBS + Ca 2+/Mg2+ basal, um das restliche Basalmedium aus den Transwells zu waschen.
- 200 μl PBS + Ca 2+/Mg2+ in das apikale Kompartiment jedes Transwells geben.
- 1 ml PBS + Ca 2+/Mg2+ in die Endohm-6 Messkammer geben.
- Bewegen Sie jedes Transwell in die Endohm-6-Messkammer und setzen Sie den Deckel der Kammer wieder auf, so dass die apikale Elektrode in den 200 μl PBS im apikalen Kompartiment ruht. Die Basalelektrode ist in den Boden der Endohm-6-Kammer eingebaut.
- Warten Sie, bis sich der EVOM-Messwert stabilisiert hat, und zeichnen Sie die TEER-Rohmessung auf.
- Entnehmen Sie die ASL-Probe wie oben beschrieben nach der TEER-Messung, wenn eine Titrierung gewünscht ist (sammeln Sie die 200 μl PBS + Ca 2+/Mg2+, die für die TEER-Messung hinzugefügt wurden).
HINWEIS: Die ASL-Probenentnahme kann Mikrorisse in der Epithelbarriere verursachen, die die TEER-Messwerte verfälschen können, daher muss ASL nach der TEER-Messung entnommen werden. Darüber hinaus darf das Basalmedium nicht unmittelbar vor den TEER-Messungen gewechselt werden, da dies auch die TEER-Werte beeinflussen kann. - Um die TEER-Rohwerte in endgültige Messungen in Ohm/cm2 umzurechnen, subtrahieren Sie den leeren TEER-Wert und multiplizieren Sie diesen Wert mit der Oberfläche der Transwell-Membran unter Verwendung von Gleichung (1):
TEER = [TEER-Messwert - leerer TEER-Wert] × (Oberfläche des Transwells) (1) - Bei HCoVs sollte TEER alle 24 Stunden oder 48 Stunden nach der Infektion ausgewertet werden. Die Kinetik von TEER-Veränderungen variiert oft zwischen Viren und erfordert eine Fehlerbehebung zu verschiedenen Zeitpunkten.
- Bei der TEER-Messung sollten immer simulierte infizierte Kulturen einbezogen und zu jedem Zeitpunkt ausgewertet werden (Negativkontrolle).
HINWEIS: Bei Scheinkulturen sollten die TEER-Messungen stabil bleiben oder können nach Abschluss der Differenzierung der Kulturen leicht gegenüber dem Ausgangswert ansteigen. Die Oberfläche der Membranstützen variiert je nach Größe und Hersteller der Transwellen. 24-Well-Transwells haben typischerweise eine Oberfläche von 0,33cm2.
5. Messung der Zytotoxizität während der Infektion mittels Laktatdehydrogenase (LDH)-Assay
HINWEIS: In dieser Arbeit wurde der LDH-Gehalt in ASL-Proben mit einem kommerziell erhältlichen Zytotoxizitätsnachweiskit quantifiziert. Das LDH-Signal im basalen Medium lag oft unter der Nachweisgrenze und war oft weniger reproduzierbar als LDH, das in ASL-Proben aus HCoV-infizierten Kulturen quantifiziert wurde.
- Bereiten Sie zusätzliche Kontrollen vor, die für den LDH-Assay erforderlich sind.
- Hintergrundkontrolle: PBS verwenden (PBS verwenden, das Kalzium und Magnesium enthält, wenn ASL-Proben auf diese Weise entnommen wurden).
- Positivkontrolle (Obergrenze): ALIs apikal mit Triton X-100 behandeln. Sammeln Sie Triton-Kontrollwellen (verwenden Sie dafür in der Regel drei ALI-Kulturen zu jedem Zeitpunkt).
- 200 μl 2%iges Triton X-100 in PBS direkt in das apikale Kompartiment des Transwells geben.
- 10-15 Minuten inkubieren, damit die Zellen vollständig lysieren können.
- Sammeln Sie das gesamte Volumen als Triton-Deckenprobe.
- Negativkontrolle (niedrige Kontrolle/LDH-Freisetzung zu Studienbeginn): ASL wird aus simulierten infizierten ALI-Kulturen gesammelt, die vom gleichen Spender wie infizierte Kulturen stammen.
- Sammeln Sie Negativkontroll-Mock-ASL gemäß dem oben beschriebenen ASL-Erfassungsverfahren.
HINWEIS: Für diese Negativkontrolle können für alle Zeitpunkte die gleichen Transwells verwendet werden, während für die Triton-Kontrolle für jeden Zeitpunkt neue Transwells erforderlich sind.
- Sammeln Sie Negativkontroll-Mock-ASL gemäß dem oben beschriebenen ASL-Erfassungsverfahren.
- Um zusätzlich zu den LDH-Messwerten aus jeder ASL-Probe auch die Quantifizierung des abgestoßenen Virus zu ermöglichen, laden Sie eine optisch klare, schwarze 96-Well-Platte mit flachem Boden wie folgt:
- Verdünnen Sie alle Proben in PBS mit 45 μl Probe und 55 μl PBS (100 μl Gesamtvolumen).
- Behandeln Sie Triton-Positivkontroll- und simulierte Hintergrundkontrollproben auf die gleiche Weise.
HINWEIS: Diese Verdünnung ermöglicht eine dreifache Beladung jeder experimentellen Probe (45 μl x 3) und ein ausreichendes ASL-Restvolumen für die Titrierung mittels Plaque-Assay. - Laden Sie die LDH-Platte in dreifacher Ausfertigung: Triton-Decke, simulierte Hintergrundsteuerung, PBS-Kontrolle und experimentelle Proben.
- Bereiten Sie die Reaktionsmischung nach Herstellerangaben vor (Farbstofflösung + Katalysator).
- Geben Sie 100 μl Reaktionsmischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur 20 Minuten lang lichtgeschützt.
- Nach 20 min wird die Absorption bei 492 nm gemessen.
- Berechnen Sie die prozentuale Zytotoxizität relativ zum Triton-Grenzwert mit Gleichung (2).
Zytotoxizität (%)
(2)
(2)6. Präparation von nasalen ALI-Kulturen für die Immunfluoreszenz-Bildgebung (IF)
- Legen Sie das Transwell in eine frische 24-Well-Platte und waschen Sie es 3x apikal mit PBS (sammeln Sie die erste PBS-Wäsche als ASL, wenn Sie titerieren; führen Sie dann zwei weitere PBS-Wäschen durch, um überschüssige abgestoßene Viren zu entfernen, die die IF-Qualität beeinträchtigen könnten)
- Nach der letzten PBS-Wäsche wird der Transwell apikal und basal mit 4 % PFA bedeckt.
- 30 Minuten lang inkubieren, um 4% PFA einzubinden, dann entfernen und 3x mit PBS waschen.
- Schneiden Sie die Transwell-Stütze, die die Zellen enthält, mit einer geschärften Rasierklinge oder Schere heraus.
- Um die Anzahl der IF-Targets für jedes Transwell zu erhöhen, schneiden Sie jede Membran in zwei Hälften und färben Sie jede Hälfte mit verschiedenen Antikörperkombinationen.
- Permeabilisieren mit 0,2% Triton X-100 in PBS für 10 min.
- Blockieren Sie mit 10 % normalem Eselsserum und 1 % BSA in PBST (PBS + 0,2 % Triton X-100) für 60 Minuten bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Schützen Sie die Proben ab diesem Schritt vor Lichteinwirkung. - In Primärantikörperlösung über Nacht bei 4 °C inkubieren. Verdünnen Sie alle Antikörper im Verhältnis 1:1.000 in Blockierungspuffer.
HINWEIS: Repräsentative Antikörper für die HCoV-Nukleokapsidfärbung sowie Epithelzelltypmarker und Zytoskelettfärbungen sind unten aufgeführt (Herstellerinformationen und Katalognummern finden Sie in der Materialtabelle ).- Verwenden Sie für die HCoV-Antigenfärbung Antikörper, die gegen SARS-CoV-2-Nukleokapsid, MERS-CoV-Nukleokapsid und HCoV-NL63-Nukleokapsid gerichtet sind.
- Um Epithelzelltypen zu identifizieren, verwenden Sie Antikörper, die gegen den Becherzellmarker MUC5AC und den Zilienzellmarker Typ IV β-Tubulin gerichtet sind.
- Verwenden Sie für Zytoskelett-Marker Antikörper, die gegen Phalloidin (bindet F-Aktin) und Epithelzelladhäsionsmarker EpCAM (CD326) gerichtet sind.
- 60 Minuten bei Raumtemperatur in sekundärer Antikörperlösung inkubieren; Verwenden Sie Sekundärantikörperfarbstoffe, die im Verhältnis 1:1.000 in Blocking-Puffer verdünnt sind.
- Nachdem die Färbung abgeschlossen ist, übertragen Sie die Membran mit einem Spatel auf einen Objektträger, richten Sie das Transwell mit der apikalen Seite in Richtung des Objektträgers aus und fügen Sie die Montagelösung hinzu. 15-30 Minuten einwirken lassen, bevor Sie den klaren Nagellack an den Rändern auftragen.
- Aufnahme von Bildern mit einem konfokalen Mikroskop (Z-Achsenschritt: 0,5 μm; sequentielles Scannen)1,16,17.
HINWEIS: Nach der Fixierung der Kulturen in 4% PFA und dem Waschen mit PBS können fixierte Kulturen vor der Färbung und Vorbereitung für die Bildgebung Wochen bis Monate bei 4 °C gelagert werden. Nach der Färbung und Einbettung der Membranen können die Proben langfristig (>2 Jahre) bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden.
7. Sammlung von intrazellulärem Protein für das Western Immunoblotting oder RNA für die RT-qPCR-Analyse
- Sammeln Sie ASL wie oben beschrieben, wenn Sie virale Titer quantifizieren (Protokollabschnitt 2).
- Schieben Sie das Transwell auf eine saubere 24-Well-Platte, da das Schaben der Membran zum Bruch des Einsatzes führen kann.
- Für die Western-Blot-Analyse wird das Gesamtproteinlysat in 125 μl RIPA-Puffer (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 % Desoxycholat, 0,1 % SDS, 1 % NP40) gesammelt, ergänzt mit Protease-Inhibitoren und Phosphatase-Inhibitoren.
- Geben Sie 125 μl RIPA-Puffer in das apikale Kompartiment und inkubieren Sie 5-10 Minuten.
- Kratzen Sie die Membran mit einer P200-Pipettenspitze ab, um alle verbleibenden anhaftenden Zellen zu entfernen, und sammeln Sie das gesamte Volumen (kratzen Sie kräftig über die gesamte Oberfläche der Membran und pipettieren Sie dann mehrmals auf und ab, um die gesamte Probe zu sammeln).
- Proteinlysatproben werden 10 Minuten lang auf Eis inkubiert und dann 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit (20.000 × g) bei 4 °C zentrifugiert.
- Mischen Sie den Überstand mit 4x Laemmli Probenpuffer mit β-Mercaptoethanol (Reduktionsmittel) gemäß den Herstellerprotokollen.
- Kochen Sie Proteinproben 5 Minuten lang bei 95 °C und lassen Sie sie dann mit den traditionellen Western-Blotting-Protokollen 1,16,17 laufen.
- Verwenden Sie für die Entnahme von Gesamt-RNA ein handelsübliches RNA-Extraktionskit Ihrer Wahl.
HINWEIS: Das apikale Kompartiment von 24-Well-Transwell-Inserts hat ein maximales Volumen von ~200 μl; Daher führen wir zwei aufeinanderfolgende Waschungen an jeder Kultur durch, um das empfohlene Gesamtvolumen zu erreichen. Die folgenden Angaben entsprechen der empfohlenen Entnahme von RNA-Proben in einem Gesamtvolumen von 350 μl. - 200 μl Lysepuffer werden in das apikale Kompartiment des infizierten Transwells gegeben.
- Lassen Sie es 5-10 Minuten einwirken, kratzen Sie alle verbleibenden Zellen mit einer Pipettenspitze von der Membran ab und sammeln Sie das gesamte Volumen in einem beschrifteten Mikrozentrifugenröhrchen.
- Geben Sie 150 μl zusätzlichen Lysepuffer in das apikale Kompartiment des Transwell und pipettieren Sie es auf und ab, bevor Sie es in dasselbe Mikrozentrifugenröhrchen sammeln.
- Extrahieren Sie die RNA gemäß dem Protokoll des Herstellers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die repräsentativen Abbildungen sind teilweise aus Daten adaptiert, die im Manuskript Otter et al.1 zu finden sind. Nasale ALI-Kulturen, die von vier oder sechs Spendern stammten, wurden gemäß den oben beschriebenen Protokollen mit einem von vier HCoVs (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 und HCoV-229E) infiziert, und die durchschnittlichen apikal ausgeschiedenen Virustiter für jedes Virus sind in Abbildung 1A dargestellt. Während sich alle vier HCoVs produktiv in nasalen ALI-Kulturen vermehren, replizieren sich SARS-CoV-2 und HCoV-229E am effizientesten. Beachten Sie, dass es sich hierbei um durchschnittliche Virustiter handelt und dass kürzlich Titer für jeden HCoV bei einzelnen Spendern veröffentlicht wurden1. Nach dem Waschen nasaler ALI-Kulturen, wie in Protokollabschnitt 3 beschrieben, werden MERS-CoV-Titer in apikaler Oberflächenflüssigkeit (ASL) mit intrazellulären viralen Titern in Abbildung 1B verglichen. Die intrazellulären und apikal ausgeschiedenen Virustiter von MERS-CoV sind 48 Stunden nach der Infektion (hpi) ungefähr gleich.
Die Immunfluoreszenz-Bildgebung infizierter nasaler ALI-Kulturen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, mit dem zellulärer Tropismus und andere Infektionsparameter wie Synzytienbildung, Zell-Zell-Fusion und Schädigung der Integrität der Epithelbarriere untersucht werden können. Die Co-Färbung infizierter Kulturen mit Antikörpern, die spezifisch für virale Antigene (wie Nukleokapsid oder HCoV-Nichtstrukturproteine) und Markern für Flimmer- oder Becherzellen (Typ IV β-Tubulin bzw. MUC5AC) sind, kann den zellulären Tropismus für ein HCoV in nasalen ALIs bestimmen25,26. Abbildung 2A zeigt repräsentative Bilder von Nasenkulturen, die mit SARS-CoV-2, MERS-CoV und HCoV-NL63 infiziert sind.
SARS-CoV-2 und HCoV-NL63 infizieren in erster Linie Flimmerzellen (belegt durch die Kolokalisation der viralen Nukleokapsidfärbung mit dem Zilienmarker Typ IV β-Tubulin und die fehlende Kolokalisation des viralen Antigens mit dem Becherzellmarker MUC5AC). MERS-CoV infiziert überwiegend nicht-flimmernde Becherzellen in nasalen ALI-Kulturen, da MERS-CoV das gegenteilige Muster zeigt, mit Kolokalisation der viralen Antigenfärbung mit MUC5AC und minimaler Kolokalisation der viralen Nukleokapsidfärbung mit Typ IV β-Tubulin. Marker wie Phalloidin, das an Aktinfilamente bindet, oder EpCAM, Epithelzelladhäsionsmolekül, können verwendet werden, um das epitheliale Zytoskelett sichtbar zu machen und einen Verlust der Integrität der Epithelbarriere zu erkennen27. Abbildung 2B zeigt die Phalloidin-Färbung in nasalen ALI-Kulturen; Panel 1 zeigt eine intakte F-Aktin-Ultrastruktur des Zytoskeletts in einer simuliert infizierten Kultur, und Panel 2 zeigt einen Verlust der Phalloidin-Integrität und deutet auf eine mögliche Schädigung der epithelialen Barrierefunktion in einer HCoV-NL63-infizierten Kultur hin. Epitheliale Marker wie diese können auf HCoV-Infektionen angewendet werden, um die Dynamik der epithelialen Barriere während der Infektion zu charakterisieren.
Nach der Infektion von nasalen ALI-Kulturen mit jedem der vier HCoVs wurde der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) überwacht. Die Baseline-TEER-Messwerte wurden vor der Infektion aufgezeichnet, 0 hpi, und TEER wurde erneut für jeden Transwell mit 96 hpi und 192 hpi ausgewertet. Abbildung 3 zeigt die TEER-Änderungen für jeden der HCoVs. Die Abbildungen 3A und B zeigen die ΔTEER-Werte (Differenzen in der TEER, die für jede Bohrung berechnet werden, indem die TEER der Ausgangslinie bei 0 hpi von der TEER abgezogen wird, die zu einem bestimmten Zeitpunkt gemessen wurde). Für SARS-CoV-2, MERS-CoV und HCoV-NL63 treten größere Veränderungen der TEER spät in der Infektion auf (192 hpi), und Abbildung 3A zeigt, dass SARS-CoV-2- und HCoV-NL63-Infektionen zu negativen ΔTEER-Werten (192 hpi - 0 hpi) führen, während eine MERS-CoV-Infektion dies nicht tut. Zum Vergleich werden simulierte ΔTEER-Werte einbezogen, die zeigen, dass sich die Veränderungen der TEER nach einer MERS-CoV-Infektion nicht signifikant von denen unterscheiden, die während einer Scheininfektion beobachtet werden. Negative ΔTEER-Werte deuten auf eine Abnahme der Integrität der Epithelbarriere und eine beeinträchtigte epitheliale Barrierefunktion hin. Abbildung 3B zeigt ΔTEER-Werte für HCoV-229E (berechnet aus 96 hpi und 192 hpi). HCoV-229E verursacht eine Dysfunktion der Epithelbarriere zu einem früheren Zeitpunkt (96 hpi), aber die Erholung auf Scheinwerte erfolgt zu einem späteren Zeitpunkt (192 hpi). Diese Daten zeigen, wie sich die TEER-Kinetik zwischen Viren unterscheiden kann. Die Abbildungen 3C und D zeigen TEER-Spuren, die TEER-Rohdaten für jeden infizierten Transwell im Zeitverlauf darstellen und so die Visualisierung von TEER-Trends im Verlauf der Infektion ermöglichen. Falls gewünscht, kann eine Behandlung mit dem Zytokin IL-13 als Positivkontrolle in TEER-Experimente einbezogen werden, da dies die Tight Junctions beeinträchtigt, die epitheliale Barrierefunktion beeinträchtigt und somit die Membranpermeabilität in Atemwegsepithelien erhöht; Daher wird erwartet, dass das Zytokin IL-13 zu einer Abnahme von TEER28,29,30 führt.
Ergänzend zu TEER-Messungen in Nasenkulturen kann die Zytotoxizität durch Quantifizierung der Laktatdehydrogenase (LDH) quantifiziert werden, die während der Infektion apikal freigesetzt wird. Abbildung 4 zeigt die durchschnittlichen Zytotoxizitätsdaten bei 96 hpi und 192 hpi aus Kulturen, die von 10 Spendern stammen, die mit jedem der untersuchten HCoVs infiziert waren. SARS-CoV-2, HCoV-NL63 und HCoV-229E verursachen eine signifikante Zytotoxizität in nasalen Kulturen, während dies bei MERS-CoV nicht der Fall ist.
Das Gesamtprotein oder die RNA, die aus infizierten Nasenkulturen gewonnen wurde, kann verwendet werden, um verschiedene HCoV-Wirt-Interaktionen zu untersuchen. Wir behandelten Nasenkulturen mit dem Typ-2-Zytokin IL-13, um eine Becherzellhyperplasie zu induzieren und die Gewebelandschaft eines asthmatischen Atemwegs zu modellieren. Abbildung 5A zeigt qPCR-Daten, die die mRNA-Häufigkeit von zwei wichtigen HCoV-Rezeptoren nach IL-13-Behandlung quantifizieren. DPP4 ist der zelluläre Rezeptor für MERS-CoV, und ACE2 ist der zelluläre Rezeptor für SARS-CoV-2 und HCoV-NL63. Die Behandlung mit IL-13 führt zu einer dramatisch erhöhten DPP4-Expression, aber zu keiner signifikanten Veränderung der ACE2-Expression. Abbildung 5B zeigt Western-Blot-Daten zur Bewertung der Proteinhäufigkeit nach IL-13-Behandlung in nicht infizierten und SARS-CoV-2-infizierten Kulturen. Die Behandlung mit IL-13 führt zu einem signifikant erhöhten MUC5AC (einem Becherzellmarker) und einem verringerten Typ-IV-β-Tubulin (einem Flimmerzellmarker), was die erwartete Becherzellhyperplasie widerspiegelt, die durch diese Zytokinbehandlung verursacht wird. Die Analyse auf Proteinebene zeigt, dass die Behandlung mit IL-13 die DPP4-Expression erhöht, aber die ACE2-Expression verringert. Das Western Blotting für das SARS-CoV-2-Nukleokapsidprotein zeigt, dass die Behandlung mit IL-13 im Vergleich zu scheinbehandelten Kulturen zu einer leichten Abnahme des viralen Antigens führt. Ähnliche Analysen können für jede mRNA oder jedes Protein von Interesse nach Manipulation von nasalen ALI-Kulturen und/oder Infektion mit HCoVs durchgeführt werden.
Abbildung 1: HCoV-Replikation in nasalen ALI-Kulturen. Nasale Kulturen von sechs oder vier Spendern wurden dreifach mit SARS-CoV-2 (6), MERS-CoV (6), HCoV-NL63 (6) oder HCoV-229E (4) bei MOI = 5 infiziert. Die apikale Oberflächenflüssigkeit wurde bei 0 hpi, 48 hpi, 96 hpi und 144 hpi gesammelt und das infektiöse Virus wurde mittels Plaque-Assay quantifiziert. (A) Die gemittelten Virustiter aller mit jedem HCoV infizierten Spender sind dargestellt. (B) Nasale Kulturen, die von einem einzigen Spender stammten, wurden dreifach bei MOI = 5 infiziert, und ASL wurde bei 48 hpi gesammelt. Nach der ASL-Entnahme wurden die Transwells 3x mit PBS gewaschen und dann mittels Gefrier-Auftauen lysiert, um das intrazelluläre Virus zu quantifizieren. Das infektiöse Virus im apikalen Schuppenkompartiment im Vergleich zum intrazellulären Kompartiment wurde mittels Plaque-Assay quantifiziert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. Abkürzungen: ALI = Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche; MOI = Vielzahl der Infektionen; ASL = apikale Oberflächenflüssigkeit; HPI = Stunden nach der Infektion; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Diese Zahl wurde anhand von Daten erstellt, die in Otter et al.1 veröffentlicht wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Immunfluoreszenz-Bildgebung von nasalen ALI-Kulturen zur Charakterisierung des zellulären Tropismus und der epithelialen Integrität. (A) Nasale ALI-Kulturen wurden mit SARS-CoV-2, MERS-CoV oder HCoV-NL63 bei MOI = 5 infiziert und in 4% Paraformaldehyd bei 96 hpi fixiert. Die Kulturen wurden für die Immunfluoreszenz-Bildgebung vorbereitet, wie oben in Protokollabschnitt 6 beschrieben, unter Verwendung von Primärantikörpern gegen jedes Virus-Nukleokapsidprotein (rot dargestellt), Flimmerzellmarker Typ IV β-Tubulin (grün) oder Becherzellmarker MUC5AC (grün). Bemerkenswert ist, dass aufgrund der Unverträglichkeit der Spezies mit dem MUC5AC-Antikörper ein Antikörper gegen das MERS-CoV-Nonstrukturprotein 8 (nsp8) anstelle eines Antikörpers gegen das Nukleokapsidprotein verwendet wurde. Die Kolokalisation zwischen dem viralen Antigen und den einzelnen Epithelzellmarkern wird in den zusammengeführten Bildern für jedes Virus als orange/gelbe Farbe visualisiert. (B) Nasale ALI-Kulturen wurden mit Phalloidin (das Aktinfilamente des Zytoskeletts färbt) gefärbt, um die Integrität des Zytoskeletts sichtbar zu machen, wie in Pink dargestellt. Die Hoesch-Färbung ist blau dargestellt. Tafel 2B.1 zeigt eine scharfe, intakte Phalloidin-Färbung, die auf eine intakte Zytoskelettarchitektur hinweist, während Tafel 2B.2 einen Verlust der epithelialen Integrität und eine Unschärfe der Phalloidin-Färbung zeigt. Maßstabsbalken = (A) 50 μm, (B) 10 μm. Abkürzungen: ALI = Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche; MOI = Vielzahl der Infektionen; HPI = Stunden nach der Infektion. Diese Abbildung wurde anhand von Daten erstellt, die in Otter et al. veröffentlicht wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands in ALI-Kulturen während der Infektion. (A) Nasale ALI-Kulturen, die von 10 Spendern stammten, waren entweder scheininfiziert oder bei MOI = 5 mit SARS-CoV-2, MERS-CoV oder HCoV-NL63 infiziert. ΔTEER wurde für jeden Transwell als TEER bei 192 hpi minus TEER bei 0 hpi (Ausgangs-TEER) berechnet. Jeder Balken zeigt den durchschnittlichen ΔTEER-Wert für jedes Virus unter den Dreifachkulturen jedes Spenders. (B) Nasale ALI-Kulturen, die von 8 Spendern stammten, wurden bei MOI = 5 simuliert oder mit HCoV-229E infiziert. Der ΔTEER aus dem Ausgangswert TEER wurde wie in (A) unter Verwendung von TEER bei 96 hpi oder 192 hpi berechnet. (C,D) TEER-Spurendaten werden für scheininfizierte oder HCoV-infizierte Kulturen dargestellt, die von jedem der vier Spender stammen. Jede Zeile repräsentiert TEER-Daten von einem einzelnen Transwell im Zeitverlauf (dreifache Transwells von jedem Spender wurden untersucht). Die Spendernummern sind farblich gekennzeichnet und werden im Schlüssel rechts neben jedem Diagramm angezeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD in Panel A und Panel B angezeigt. Abkürzungen: ALI = Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche; MOI = Vielzahl der Infektionen; HPI = Stunden nach der Infektion; TEER = transepithelialer elektrischer Widerstand. Diese Zahl wurde anhand von Daten erstellt, die in Otter et al.1 veröffentlicht wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Quantifizierung der Zytotoxizität während der HCoV-Infektion von nasalen ALI-Kulturen. Nasale Kulturen von 10 Spendern, die mit jedem HCoV in dreifacher Ausführung bei MOI = 5 infiziert waren, wurden in ASL-Proben wie oben beschrieben einer LDH-Quantifizierung unterzogen. Die gemittelte Zytotoxizität aller getesteten Spender wird für jeden HCoV bei 96 hpi und 192 hpi gezeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. Abkürzungen: ALI = Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche; MOI = Vielzahl der Infektionen; HPI = Stunden nach der Infektion; TEER = transepithelialer elektrischer Widerstand; ASL = apikale Oberflächenflüssigkeit; LDH = Laktatdehydrogenase. Diese Zahl wurde anhand von Daten erstellt, die in Otter et al.1 veröffentlicht wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: mRNA/Protein-Analyse nach Infektion von Nasenkulturen. Nasale Kulturen, die mit Typ-2-Zytokin IL-13 behandelt oder scheinbehandelt wurden, wurden verwendet, um Veränderungen in der Expression von HCoV-Rezeptoren sowie in Flimmer- und Becherzellmarkern zu bewerten. (A) Die mRNA-Expression von DPP4 und ACE2 wurde mittels RT-qPCR quantifiziert. Die Daten für Kulturen von drei Spendern, die mit IL-13 behandelt wurden, werden als Faltenveränderungen gegenüber scheinbehandelten Kulturen gezeigt, die von denselben Spendern stammten. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt, wobei jeder Punkt die durchschnittliche Induktion der Faltenänderung für einen einzelnen Spender darstellt. (B) Das Gesamtprotein wurde aus nasalen Kulturen gewonnen, die entweder schein- oder IL-13-behandelt und entweder mit Schein- oder SARS-CoV-2-infiziert waren. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE separiert und mit Antikörpern gegen Epithelzellmarker (Typ IV β-Tubulin, MUC5AC), HCoV-Rezeptoren (ACE2, DPP4), SARS-CoV-2-Nukleokapsidprotein und GAPDH immunoblott. Abkürzungen: RT-qPCR = reverse-transkriptions-quantitative Polymerase-Kettenreaktion; SDS-PAGE = Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Diese Zahl wurde anhand von Daten erstellt, die in Otter et al.1 veröffentlicht wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die hier beschriebenen Methoden beschreiben ein primäres Epithelkultursystem, in dem von Patienten stammende Nasenepithelzellen an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gezüchtet und zur Untersuchung von HCoV-Wirt-Interaktionen eingesetzt werden. Nach der Differenzierung rekapitulieren diese nasalen ALI-Kulturen viele Merkmale des in vivo Nasenepithels, einschließlich einer heterogenen Zellpopulation mit Flimmer-, Kelch- und Basalzellen sowie einer intakten mukoziliären Funktion mit robust schlagenden Zilien und Schleimsekretion. Diese heterogene Zellpopulation ist ein wesentlicher Vorteil dieses Kultursystems gegenüber herkömmlichen respiratorischen Epithelzelllinien, da sie die Charakterisierung des Wirtszelltropismus während einer Virusinfektion ermöglicht (wie in Abbildung 2 dargestellt). Traditionellen Epithelzelllinien der Atemwege fehlen auch funktionelle mukoziliäre Clearance-Mechanismen, die neben angeborenen Immunwegen wie der Interferonproduktion eine Schlüsselrolle bei der primären Abwehr von Atemwegsviren spielen.
Zu den kritischen Schritten innerhalb des Protokolls gehören das anfängliche Infektionsverfahren; Zum Beispiel müssen die Kulturen vor der Infektion bei der gewünschten Temperatur äquilibriert werden, und es sollte eine einheitliche Methodik verwendet werden, um jede Infektion zu beginnen. Diese Schritte sind entscheidend, um die Methode zu standardisieren und die Reproduzierbarkeit in nachgelagerten Befunden zu gewährleisten.
Der vielleicht wichtigste Teil dieser Methoden ist die Quantifizierung von apikal freigesetzten Viren, da das Verständnis des einzigartigen Replikationszyklus jedes HCoV dazu beiträgt, die Zeitpunkte zu bestimmen, die für weitere Analysen am besten geeignet sind. Die oben beschriebenen Immunfluoreszenztechniken sind ebenfalls von entscheidender Bedeutung, da die Fähigkeit, Virusinfektionen in einem In-vitro-Nasenepithel mit einer repräsentativen heterogenen Zellpopulation sichtbar zu machen, eine genaue Beurteilung des viralen Tropismus ermöglicht und die Möglichkeit bietet, Virus-Wirt-Interaktionen in einer physiologischen Umgebung weiter abzufragen.
Das Nasenepithel ist die primäre Barrierestelle, auf die alle respiratorischen Viren treffen, und daher ist es wahrscheinlich, dass HCoV-Infektionen mit einer Primärinfektion des Nasenepithels beginnen, mit dem Potenzial, sich über eine oral-lungen-Aspirationsachse auf die unteren Atemwege auszubreiten. Dies spielt wahrscheinlich eine Rolle bei der Entwicklung schwerer Lungenentzündungen und Atemwegserkrankungen während einer pathogenen HCoV-Infektion (MERS-CoV, SARS-CoV-2), während die saisonalen HCoVs dazu neigen, Krankheiten nur in den oberen Atemwegen zu verursachen. Es ist von entscheidender Bedeutung, die HCoV-Wirt-Interaktionen in diesem wichtigen Immunwächter zu verstehen, und dieses nasale ALI-System ermöglicht die Charakterisierung der viralen Replikation, des Wirtszelltropismus sowie der Zytotoxizität und der angeborenen Immuninduktion während der HCoV-Infektion.
Dieses nasale ALI-Kultursystem ist auch sehr anpassungsfähig und kann verwendet werden, um viele klinische Krankheitszustände zu spiegeln. Nasenproben, die von Patienten mit genetischen Lungenerkrankungen wie Mukoviszidose (verursacht durch einen Chloridkanaldefekt) oder primären ziliären Dyskinesien (bei denen die Mechanismen des ziliären Schlagens gestört sind) gewonnen wurden, können verwendet werden, um nasale ALI-Kulturen zu züchten, die für diese Pathologien repräsentativ sind, um zu verstehen, wie diese Patienten unterschiedlich von einer HCoV-Infektion betroffen sein können31,32. Darüber hinaus können verschiedene Zytokinbehandlungen während der Differenzierung von nasalen ALI-Kulturen eingesetzt werden, um Merkmale anderer Krankheitszustände nachzubilden. Zum Beispiel induziert die IL-13-Behandlung während der Differenzierung eine Becherzellhyperplasie und kann als Surrogat für die Untersuchung asthmatischer oder allergischer Atemwege verwendet werden33,34. Daher ist dieses nasale ALI-System ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von HCoV-Wirt- sowie anderen Virus-Wirt-Interaktionen sowohl in gesunden als auch in erkrankten nasalen Atemwegen.
Obwohl dieses System viele Vorteile bietet, ergeben sich auch einige Einschränkungen bei der Verwendung von nasalen ALI-Kulturen. Obwohl Nasenzellen weitaus weniger invasive Techniken für die Gewinnung benötigen als Bronchial- oder Lungenzellen, erfordert die Züchtung und Differenzierung von ALI-Kulturen deutlich mehr Zeit und Ressourcen als die Verwendung herkömmlicher immortalisierter Zelllinien. Darüber hinaus kann die Variabilität von Spender zu Spender in Bezug auf die Permissivität gegenüber Infektionen sowie die Reaktionen des Wirts auf eine HCoV-Infektion die Reproduktion und Interpretation von Daten erschweren (aus diesem Grund werden häufig Experimente mit Kulturen durchgeführt, die von 5-10 Spendern stammen, um diese Probleme zu mildern).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Susan Weiss ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Ocugen. Noam A. Cohen berät GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron und Oyster Point Pharmaceuticals und verfügt über ein US-Patent für "Therapy and Diagnostics for Respiratory Infection" (10.881.698 B2, WO20913112865) sowie eine Lizenzvereinbarung mit GeneOne Life Sciences.
Acknowledgments
Diese Studie hat die folgenden Finanzierungsquellen: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. und N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. und N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. und N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
References
- Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).
- Fehr, A., Perlman, S. Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis. Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).
- Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).
- Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. An overview on the seven pathogenic human coronaviruses. Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282 (2022).
- MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control. , Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update (2022).
- MERS Situation Update. World Health Organization Regional Office for the Eastern Mediterranean. , Available from: http://www.emro.who.int/health-topics/mers-cov/mers-outbreaks.html (2022).
- Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis. Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
- Farzal, Z., et al. Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).
- Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health. Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).
- Hou, Y., et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract. Cell. 182, 429-446 (2020).
- Hariri, B. M., Cohen, N. A. New insights into upper airway innate immunity. American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).
- Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease. European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).
- Hatton, C. F., et al. Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2. Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).
- Sungnak, W., et al. SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).
- Li, Y., et al. SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).
- Comar, C. E., et al. MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).
- Lee, R. J., et al. Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells. Science Signaling. 10 (495), (2017).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD. PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).
- Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma. Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).
- Lee, R. J., et al. Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function. Scientific Reports. 6, 33221 (2016).
- Patel, N. N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).
- Robinot, R., et al. SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance. Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).
- Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).
- Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin. Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).
- Schmidt, H., et al. IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).
- Huang, Z. Q., et al. Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).
- Saatian, B., et al. Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells. Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).
- Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).
- Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions. Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).
- Seibold, M. A. Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium. Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).
- Morrison, C. B., et al. SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).
