Name: 在气液界面上生长的原代鼻上皮细胞的感染，以表征人类冠状病毒与宿主的相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学习利用气液界面培养原代鼻上皮细胞来研究人类冠状病毒与宿主的相互作用。该方法可分析病毒复制动力学、先天免疫诱导及细胞毒性，为呼吸道病毒感染机制研究提供重要模型。

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本研究的资助来源如下：美国国立卫生研究院（NIH）R01AI 169537（S.R.W. 和 N.A.C.），NIH R01AI 140442（S.R.W.），退伍军人事务部杰出研究奖 CX001717（N.A.C.），退伍军人事务部杰出研究奖 BX005432（S.R.W. 和 N.A.C.），&#160;宾夕法尼亚大学冠状病毒及其他新发病原体研究中心（S.R.W.），Laffey-McHugh 基金会（S.R.W. 和 N.A.C.），T32 AI055400（CJO），T32 AI007324（AF）。

使用鼻腔样本已获得宾夕法尼亚大学机构审查委员会（方案编号 # 800614）和费城退伍军人事务机构审查委员会（方案编号 # 00781）的批准。
1. 鼻腔气液界面培养物的感染
注意：临床样本的获取，以及鼻腔气液界面（ALI）培养物的生长与分化不在本文讨论范围之内。有关原代鼻上皮细胞培养的具体方法，可参考近期发表的使用此类培养体系的研究文献18,22,23。如下所述的实验方案也可根据需要应用于市售的鼻上皮细胞ALI培养模型。下述方案及体积适用于24孔板Transwell小室（直径6.5 mm，膜表面积0.33 cm2）。若使用在较大Transwell上生长的ALI培养物（例如12孔板，直径12 mm，表面积1.12 cm2），则应按比例调整试剂体积以适配Transwell尺寸。
<ol>
	<li>感染前一天：
	<ol>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）从顶端冲洗 ALI 培养物 3 次（加入约200 μL 温PBS，置于 37 °C 孵育5分钟，吸除PBS，重复一次。</li>
		<li>更换基础培养基（500 μL).</li>
		<li>让培养物在即将进行过夜感染的温度下平衡（例如，如果在 33 °C，将培养物置于 33 °C 孵育器中孵育（PBS洗涤后）。 
		注意：据报道，与普通感冒相关的HCoVs（如HCoV-229E和HCoV-NL63）在较低温度下复制效率更高 33 °C此外，温度的 体内 鼻上皮组织 33 °C （这不同于肺部的温度，后者为 37 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据需要将病毒在无血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中稀释，以在总体接种体积中达到所需的感染复数（MOI） 50 μL. 
	注意：感染通常在 MOI = 5（高 MOI）条件下进行；然而，MOI = 0.5（低 MOI）也已用于 SARS-CoV-2 和引起普通感冒的 HCoV，这两种条件可产生相当的病毒峰值滴度，但动力学存在差异（两种 MOI 均可接受）。</li>
	<li>从顶端加入接种物，将培养物放回培养箱中孵育1 h。</li>
	<li>每15分钟轻轻摇动培养板一次（用双手牢固握住培养板，前后及左右摇动，以确保病毒接种物均匀吸附）。</li>
	<li>孵育1小时后，吸除病毒接种液，并用PBS洗涤每份感染的培养物3次，以确保彻底去除病毒接种液（每次洗涤时，加入 200 μL PBS，孵育5分钟，然后吸除或用移液器移去。</li>
	<li>如有需要，收集第三次PBS洗涤液，以确认输入病毒已被充分去除。</li>
	<li>每72小时用新鲜培养基更换感染的ALI模型中的基础培养基。</li>
</ol>
2. 采集气道顶膜表面液体（ASL）及脱落病毒的滴定
<ol>
	<li>在感染后的预定时间点，加入 200 μL 向每个感染的transwell的顶端室加入PBS。 
	注意：相关时间点因所研究的HCoV不同而异，通常为感染后24小时至192小时（参见代表性结果部分中各种HCoV的病毒复制数据）。</li>
	<li>用移液器将PBS上下吹打5次，以确保充分收集顶端脱落的病毒，并将全部液体转移至微量离心管中（此为ASL样本）。 
	注意：ASL 除了包含来自 ALI 培养物顶端分泌的黏液和其他分泌物外，还含有脱落的病毒颗粒。</li>
	<li>在气液界面培养物中定量感染性病毒 通过 标准病毒蚀斑实验（对含有病毒的样本进行系列稀释，以定量病毒颗粒的浓度）。 
	注意：用于空斑试验的细胞类型和孵育时间取决于所使用的病毒：SARS-CoV-2（VeroE6细胞）；MERS-CoV（VeroCCL81细胞）；HCoV-NL63（LLC-MK2细胞）；HCoV-229E（Huh7细胞）。有关如何开展病毒空斑试验的具体操作细节不在本文范围之内，但此前已在《视觉化实验杂志》（Journal of Visualized Experiments, JoVE）的出版物中详细描述。24.</li>
	<li>必要时，可在感染后的不同时间点收集基底侧培养基，以确认无基础性病毒释放。人冠状病毒（HCoVs）通常从鼻上皮细胞的顶端释放，但需对此加以验证。 通过 未稀释基础培养基的蚀斑实验</li>
	<li>将 ASL 样本储存在 −80 °C 如果无法在采集当天进行噬斑测定定量。</li>
</ol>
3. 细胞内病毒的定量
<ol>
	<li>收集ASL样本后，将每个transwell转移至预装有 500 μL 含2%胎牛血清（FBS）的DMEM基础培养基 
	注意：使用含 2% FBS 的 DMEM 可在后续冻融循环中稳定病毒。</li>
	<li>用 PBS 从顶端对每个 transwell 洗涤 3 次，以确保完全去除顶端脱落的病毒。</li>
	<li>吸除最后一次 PBS 洗涤液后，加入 100 μL 向顶端室加入含2% FBS的DMEM。</li>
	<li>将含有转染小室（transwell）及顶端和基底侧培养基的培养板转移至 −80 °C 冷冻，完成三个连续的冻融循环以裂解细胞。</li>
	<li>经过最后一次冻融循环后，收集顶侧（100 μL）和基础（500 μL将培养基转移至洁净离心管中。</li>
	<li>500 × g 离心 g 10 分钟 4 °C 以沉淀任何细胞碎片。</li>
	<li>收集上清液。此为用于滴定的细胞内病毒样品。 通过 标准蚀斑实验 
	注意：相对于ASL采集，收集过程中的稀释倍数为三倍；ASL样本采集于 200 μL PBS，而细胞内病毒样本则收集至总体积 600 μL.</li>
</ol>
4. 跨上皮电阻（TEER）测量
注意：测量TEER时，应使用添加了钙和镁的PBS（PBS + Ca2+/Mg2+）。使用设置为以欧姆（ohms）读数的上皮细胞伏特/欧姆计（见材料表）。
<ol>
	<li>根据制造商的说明清洁、平衡并校准EVOM仪器；使用未接种鼻腔细胞的“空”Transwell进行空白校正。记录空白TEER测量值。 
	注意：若使用多种病毒，不同条件之间必须严格清洁EVOM仪器以避免交叉污染（用70%乙醇清洗后，再用去离子水冲洗即可）。</li>
	<li>将每个感染后的Transwell转移至预先标记的洁净24孔板中，每孔加入500 μL含Ca2+/Mg2+的PBS，从Transwell的基底侧洗去残留的培养基。</li>
	<li>向每个Transwell的顶端室加入200 μL含Ca2+/Mg2+的PBS。</li>
	<li>向Endohm-6测量室中加入1 mL含Ca2+/Mg2+的PBS。</li>
	<li>将每个Transwell放入Endohm-6测量室中，并盖上盖子，使顶端电极浸入顶端室的200 μL PBS中；基底电极已集成在Endohm-6测量室的底部。</li>
	<li>等待EVOM读数稳定后，记录原始TEER测量值。</li>
	<li>如需进行滴度测定，在完成TEER测量后按上述方法收集ASL样本（收集于为TEER测量而加入的200 μL含Ca2+/Mg2+的PBS中）。 
	注意：ASL样本的采集可能引起上皮屏障的微小撕裂，从而干扰TEER读数，因此ASL必须在TEER测量之后采集。此外，在TEER测量前不得立即更换基底侧培养基，否则也可能影响TEER数值。</li>
	<li>将原始TEER读数转换为最终单位为Ohms/cm2的测量值时，需减去空白TEER值，并将结果乘以Transwell膜的表面积，计算公式如下（公式1）： 
	TEER = [TEER读数 - 空白TEER值] × (Transwell膜表面积)    (1)</li>
	<li>对于HCoV病毒，应在感染后每24小时或48小时评估一次TEER；不同病毒引起的TEER变化动力学常有差异，需在不同时间点进行优化和排查。</li>
	<li>测量TEER时，应始终包括模拟感染（mock-infected）的培养物，并在每个时间点进行评估（作为阴性对照）。 
	注意：对于模拟感染的培养物，在完成细胞分化后，TEER测量值应保持稳定或较基线略有上升。膜支持物的表面积因Transwell的尺寸和制造商而异；24孔Transwell的典型表面积为0.33 cm2。</li>
</ol>
5. 感染过程中细胞毒性的测定 通过 乳酸脱氢酶（LDH）检测
注意：本研究中，使用市售的细胞毒性检测试剂盒对ASL样本中的LDH含量进行定量。基础培养基中的LDH信号通常低于检测限，且相较于HCoV感染培养物的ASL样本中定量的LDH，其重复性通常较差。
<ol>
	<li>准备乳酸脱氢酶（LDH）检测所需的额外对照。
	<ol>
		<li>背景对照：使用 PBS（如果 ASL 样本是以含钙和镁的 PBS 收集的，则使用含有钙和镁的 PBS）。</li>
		<li>阳性对照（最大值）：在气液界面顶部加入Triton X-100进行处理。收集Triton对照孔（通常在每个时间点使用三个气液界面培养样本）。
		<ol>
			<li>添加 200 μL 将2% Triton X-100的PBS溶液直接加入transwell的顶室。</li>
			<li>孵育10-15分钟，使细胞完全裂解。</li>
			<li>收集全部体积作为Triton顶面样品。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>阴性对照（低对照/基础LDH释放）：收集与感染培养物来自同一供体的模拟感染ALI培养物的ASL。
		<ol>
			<li>按照上述ASL收集步骤收集阴性对照模拟ASL。 
			注意：同一款Transwell可用于所有时间点的该阴性对照，而Triton对照则需要为每个时间点使用新的Transwell。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为了在测定每份ASL样本的LDH读数的同时对脱落病毒进行定量，按如下方式加载光学透明平底黑色96孔板：
	<ol>
		<li>用 PBS 稀释所有样品，使用 45 μL 样品和 55 μL PBS（100 μL 总体积）。</li>
		<li>以相同方式处理Triton阳性对照和模拟背景对照样本。 
		注意：此稀释度可满足每个实验样本的三重加样需求（45 μL x 3）以及足量的残留ASL体积用于滴定 通过 噬斑测定</li>
		<li>将LDH板设为三复孔：Triton最大释放对照、模拟背景对照、PBS对照及实验样品。</li>
		<li>按照制造商的说明配制反应混合液（染料溶液 + 催化剂）。
		<ol>
			<li>添加 100 μL 向每孔加入反应混合液，避光于室温孵育20分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>20分钟后，在492 nm处测定吸光度。</li>
		<li>使用公式（基于Triton的上限值）计算相对细胞毒性的百分比2). 
		细胞毒性（%）  <img alt="用于实验分析的百分比计算公式，涉及Triton对照和模拟处理值" src="/files/ftp_upload/64868/64868eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">    (2)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 用于免疫荧光（IF）成像的鼻部气液界面（ALI）培养物的制备
<ol>
	<li>将transwell转移至新的24孔板中，并从顶端用PBS洗涤3次（若需滴定病毒，收集第一次PBS洗涤液作为ASL；随后再进行两次PBS洗涤，以去除可能影响免疫荧光质量的过量脱落病毒）</li>
	<li>最后一次PBS洗涤后，从顶端和基底端加入4%多聚甲醛（PFA）覆盖transwell。</li>
	<li>在4% PFA中固定30分钟，随后去除固定液，并用PBS洗涤3次。</li>
	<li>使用锋利的剃须刀片或剪刀切除含有细胞的transwell支撑膜。</li>
	<li>为增加每个transwell可检测的免疫荧光靶标数量，可将每张膜切成两半，并用不同的抗体组合分别对每一半进行染色。</li>
	<li>用含0.2% Triton X-100的PBS处理10分钟以进行透化。</li>
	<li>在室温下用含10%正常驴血清和1% BSA的PBST（PBS + 0.2% Triton X-100）封闭60分钟。 
	注意：从本步骤开始，需避免样品暴露于光照下。</li>
	<li>在4 °C下用一抗溶液孵育过夜。所有抗体均以1:1,000比例用封闭缓冲液稀释。 
	注意：以下列出了用于HCoV核衣壳染色以及上皮细胞类型标志物和细胞骨架染色的代表性抗体（有关生产厂家信息和目录号，请参见材料表）。
	<ol>
		<li>针对HCoV抗原染色，使用靶向SARS-CoV-2核衣壳蛋白、MERS-CoV核衣壳蛋白和HCoV-NL63核衣壳蛋白的抗体。</li>
		<li>为鉴定上皮细胞类型，使用靶向杯状细胞标志物MUC5AC和纤毛细胞标志物IV型β-微管蛋白的抗体。</li>
		<li>对于细胞骨架标志物，使用靶向鬼笔环肽（结合F-actin）和上皮细胞黏附分子标志物EpCAM（CD326）的抗体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下用二抗溶液孵育60分钟；二抗染料以1:1,000比例用封闭缓冲液稀释。</li>
	<li>染色完成后，用刮勺将膜转移至载玻片上，使transwell的顶端面向载玻片，然后加入封片液。静置15–30分钟后，在边缘涂抹透明指甲油密封。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜采集图像（Z轴步进：0.5 μm；逐帧扫描）1,16,17。 
	​注意：在4% PFA中固定培养物并用PBS洗涤后，固定后的培养物可在染色和成像制备前于4 °C保存数周至数月。膜染色并封片后，样品可在避光条件下于4 °C长期保存（>2年）。</li>
</ol>
7. 用于蛋白质印迹分析的细胞内蛋白收集或用于RT-qPCR分析的RNA收集
<ol>
	<li>若需定量病毒滴度（方案第2节），请按上述方法收集ASL。</li>
	<li>将transwell转移至洁净的24孔板中，因为刮取膜时可能导致插入物破裂。</li>
	<li>进行Western blot分析时，在125 μL RIPA裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 8，150 mM NaCl，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS，1% NP40）中收集总蛋白裂解液，并加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。</li>
	<li>向顶端室加入125 μL RIPA缓冲液，孵育5–10分钟。</li>
	<li>使用P200移液器吸头刮取膜表面，以去除任何残留的贴壁细胞，并收集全部液体（在整个膜表面用力刮擦，然后反复吹打数次以确保完全收集样品）。</li>
	<li>将蛋白裂解样品置于冰上孵育10分钟，随后在4 °C下以最大速度（20,000 × g）离心10分钟。</li>
	<li>根据制造商说明书，将上清液与含β-巯基乙醇（还原剂）的4× Laemmli上样缓冲液混合。</li>
	<li>将蛋白样品在95 °C下煮沸5分钟，然后按照传统的Western blot实验流程进行电泳和转膜1,16,17。</li>
	<li>如需收集总RNA，请选用 commercially available RNA提取试剂盒。 
	注意：24孔transwell插入物的顶端室最大容积约为200 μL；因此，我们对每份培养物进行两次连续洗涤，以达到推荐的总体积。以下步骤对应于在350 μL总体积中推荐的RNA样本收集方法。</li>
	<li>向感染后的transwell顶端室中加入200 μL裂解缓冲液。</li>
	<li>静置5–10分钟，用移液器吸头刮下膜上残留的细胞，并将全部液体转移至已标记的微量离心管中。</li>
	<li>向transwell的顶端室中再加入150 μL裂解缓冲液，吹打数次后收集至同一微量离心管中。</li>
	<li>按照试剂盒制造商提供的说明书提取RNA。</li>
</ol>

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</ol>

Susan Weiss 担任 Ocugen 的科学咨询委员会成员。Noam A. Cohen 为葛兰素史克（GSK）、阿斯利康（AstraZeneca）、诺华（Novartis）、赛诺菲/再生元（Sanofi/Regeneron）和牡蛎点制药公司（Oyster Point Pharmaceuticals）提供咨询，并拥有一项美国专利&#34;呼吸道感染的治疗与诊断&#34;（10,881,698 B2，WO20913112865），以及与 GeneOne 生命科学公司的一项许可协议。

本文详细描述了一种原代上皮细胞培养系统，该系统在气液界面条件下培养源自患者的鼻上皮细胞，并用于研究人冠状病毒（HCoV）与宿主之间的相互作用。分化完成后，这些鼻源性气液界面（ALI）培养物可重现人体鼻黏膜上皮的多种特征 体内 鼻腔上皮，包含纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞在内的异质性细胞群体，以及具有强烈摆动的纤毛和黏液分泌功能的完整黏膜纤毛系统。这种异质性细胞群体相较于传统呼吸道上皮细胞系，是该培养系统的关键优势，可实现对病毒感染过程中宿主细胞趋向性的表征（如图所示） 图2传统的气道上皮细胞系也缺乏功能性黏膜纤毛清除机制，而该机制与干扰素产生等先天免疫通路共同在抵御呼吸道病毒的初级防御中发挥关键作用。
方案中的关键步骤包括初始感染程序；例如，培养物必须在感染前平衡至所需温度，并且应采用一致的方法启动每次感染。这些步骤对于标准化&#160;方法并确保&#160;后续研究结果的可重复性至关重要。
这些方法中最重要的部分可能是对顶端释放病毒的定量，因为了解每...

迄今为止已发现七种人类冠状病毒（HCoVs），可引起多种呼吸系统疾病2。常见或季节性人类冠状病毒（HCoV-NL63、-229E、-OC43 和 -HKU1）通常与上呼吸道疾病相关，每年估计导致10%–30%的普通感冒病例。尽管这是常见HCoVs典型的临床表型，但这些病毒在高风险人群中也可能引起更严重的下呼吸道疾病，包括儿童、老年人以及免疫功能低下者3,4。在过去20年中，已出现三种致病性HCoVs，并引发了重大的公共卫生紧急事件，分别为严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV-2。致死性HCoVs与更严重的呼吸道病理相关，MERS-CoV病例的病死率超过&#62;34%（自2012年首次出现以来，已有2,500多例病例，其中894例死亡），这一数据清晰地说明了其严重性5,6。需要特别指出的是，这些致死性HCoVs同样可引起从无症状感染到致死性肺炎等一系列呼吸道疾病，正在持续的COVID-19大流行便是例证7。
与其他呼吸道病原体类似，人冠状病毒（HCoVs）进入呼吸道后，在鼻腔上皮建立有效的感染8。病毒扩散至下呼吸道通常被认为与口腔/鼻腔分泌物误吸入肺部有关，HCoVs 在肺部可引起更显著的下呼吸道病理改变9,10,11。因此，鼻腔作为病毒入侵的初始门户，凭借其强大的黏液纤毛清除机制以及独特的天然免疫机制，构成了抵御感染的主要屏障，旨在阻止病毒进一步扩散至下呼吸道12,13。例如，已有研究报道，鼻腔上皮细胞的基础抗病毒干扰素及干扰素刺激基因表达水平高于平均水平，表明鼻腔细胞可能已处于对呼吸道病毒作出早期应答的准备状态14,15,16。
我们先前利用患者来源的原代鼻上皮细胞，在气液界面（air-liquid interface, ALI）培养条件下建立模型，以研究鼻腔中人类冠状病毒（HCoV）与宿主之间的相互作用，因为HCoV感染通常始于鼻腔。鼻源性ALI培养体系对多种HCoV均具有易感性，包括致病性冠状病毒（如SARS-CoV-2和MERS-CoV）以及常见的人类冠状病毒（如HCoV-NL63和HCoV-229E），相较于传统的气道上皮细胞系（如A549，一种肺腺癌细胞系），该模型具有多种优势。16,17分化后，鼻腔气液界面培养物包含多种细胞类型，并表现出人体鼻腔上皮预期的多种功能 体内 鼻上皮，例如黏液纤毛清除系统18鼻腔细胞相较于下呼吸道培养系统（如人支气管上皮细胞，HBECs）也具有优势，因为鼻上皮细胞的获取 通过 细胞学刷取技术相较于支气管镜等获取人支气管上皮细胞（HBECs）的方法具有显著更低的侵入性19,20,21.
本文介绍了利用这种鼻腔气液界面（ALI）培养系统来表征人冠状病毒（HCoV）与宿主相互作用的方法。我们已在近期发表的研究中应用这些方法，比较了SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-NL63和HCoV-229E1,16,17。尽管这些方法和代表性结果重点强调了在该鼻腔细胞模型中对HCoVs的研究，但该系统也可高度适用于其他HCoVs以及其他呼吸道病原体。此外，这些方法还可更广泛地应用于其他ALI培养系统，以研究病毒感染后的病毒复制与细胞嗜性，以及细胞毒性与天然免疫应答的诱导。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 二抗（488、594、647）</td><td>Invitrogen</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>BSA（牛血清白蛋白）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete mini EDTA-free 蛋白酶抑制剂</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>细胞毒性检测试剂盒</td><td>Roche</td><td>11644793001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>DPBS（杜尔贝科磷酸盐缓冲液）</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>DPBS + 钙 + 镁</td><td>Gibco</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>Endohm-6G 测量室</td><td>World Precision Instruments</td><td>ENDOHM-6G</td><td></td></tr><tr><td>上皮细胞黏附分子标记物（EpCAM；CD326）</td><td>eBiosciences</td><td>14-9326-82</td><td></td></tr><tr><td>上皮细胞伏特/欧姆（TEER）测量仪（EVOM）</td><td>World Precision Instruments</td><td>300523</td><td></td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>成像用 FV10-ASW 软件</td><td>Olympus</td><td>Version 4.02</td><td></td></tr><tr><td>HCoV-NL63（人冠状病毒 NL63）</td><td>BEI Resources</td><td>NR-470</td><td></td></tr><tr><td>HCoV-NL63 核衣壳抗体</td><td>Sino Biological</td><td>40641-V07E</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 染色剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 样品缓冲液（4x）</td><td>BIO-RAD</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>LLC-MK2 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-7</td><td>用于滴定 HCoV-NL63</td></tr><tr><td>MERS-CoV（人冠状病毒，中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV），EMC/2012）</td><td>BEI Resources&amp;nbsp;</td><td>NR-44260</td><td></td></tr><tr><td>MERS-CoV 核衣壳抗体</td><td>Sino Biological</td><td>40068-MM10</td><td></td></tr><tr><td>MUC5AC 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMAB91539</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview 共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647 染色剂</td><td>Abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop easy pack（磷酸酶抑制剂）&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH34000000</td><td>任何酶标仪或 ELISA 读板仪均可；必须能够读取 492 nm 处的吸光度</td></tr><tr><td>RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris pH 8；150 mM NaCl；0.5% 脱氧胆酸钠；0.1% SDS；1% NP40）</td><td>Thermo Fisher</td><td>89990</td><td>可自行配制或购买</td></tr><tr><td>RNeasy Plus 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2（SARS 相关冠状病毒 2，分离株 USA-WA1/2020）</td><td>BEI Resources</td><td>NR-52281</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 核衣壳抗体</td><td>Genetex</td><td>GTX135357</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>Type IV &amp;beta;-微管蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab11315</td><td></td></tr><tr><td>VeroCCL81 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>用于滴定 MERS-CoV</td></tr><tr><td>VeroE6 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td>用于滴定 SARS-CoV-2</td></tr></tbody></table>

在气液界面培养的原代鼻上皮细胞感染模型中表征人冠状病毒与宿主相互作用

Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

三种高致病性人类冠状病毒（HCoVs）——SARS-CoV（2002年）、MERS-CoV（2012年）和SARS-CoV-2（2019年）——在过去20年中相继出现，并引发了重大的公共卫生危机。此外，还有四种HCoVs每年导致大量普通感冒病例（HCoV-NL63、-229E、-OC43和-HKU1），凸显了在生理相关系统中研究这些病毒的重要性。HCoVs通过呼吸道进入人体，并在鼻黏膜上皮建立感染，后者是所有呼吸道病原体入侵的首要部位。我们采用一种原代鼻上皮细胞培养系统，将来自患者的鼻腔样本在气液界面（ALI）条件下培养，以研究该关键哨兵部位上的宿主-病原体相互作用。这些培养物重现了鼻黏膜上皮的多种特征 体内 气道，包括&#160;存在的细胞类型、纤毛功能以及黏液分泌。我们描述了在人类冠状病毒（HCoV）感染后，利用鼻腔气液界面（ALI）培养模型表征病毒复制、宿主细胞嗜性、病毒诱导的细胞毒性以及天然免疫反应的方法，并以近期对致死性和季节性HCoV的比较研究为例进行说明1对鼻腔内宿主与病原体相互作用的深入理解，有望为针对人冠状病毒及其他未来可能出现的呼吸道病毒的抗病毒治疗提供新的靶点。

代表性图示部分改编自 Otter 等人手稿中提供的数据1。采用上述方案，将来自四至六名供体的鼻腔气液界面（ALI）培养物分别接种四种人冠状病毒之一（SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-NL63 和 HCoV-229E），每种病毒的平均顶端释放病毒滴度如图1A所示。尽管这四种人冠状病毒均能在鼻腔ALI培养物中有效复制，但SARS-CoV-2和HCoV-229E的复制效率最高。需注意，此处展示的是平均病毒滴度，各HCoV在个体供体中的病毒滴度数据已近期发表1。按照第3部分方案清洗鼻腔ALI培养物后，MERS-CoV在顶端表面液体（ASL）中的滴度与细胞内病毒滴度的比较结果如图1B所示。感染后48小时（hpi），MERS-CoV的细胞内病毒滴度与顶端释放的病毒滴度大致相同。
对感染的鼻部气液界面（ALI）培养物进行免疫荧光成像是一种强大的工具，可用于研究细胞嗜性...

鼻腔上皮是所有呼吸道病原体首先接触的主要屏障部位。本文概述了利用气液界面（ALI）培养的原代鼻腔上皮细胞，以在生理相关系统中表征人类冠状病毒与宿主相互作用的方法。

三种高致病性人类冠状病毒（HCoVs）——SARS-CoV（2002年）、MERS-CoV（2012年）和SARS-CoV-2（2019年）——相继出现，并引发了重大的公共卫生问题……

本文所述的实验方案旨在解决一些关键科学问题，例如人冠状病毒感染过程中鼻上皮组织中的病毒复制动力学、宿主细胞嗜性、天然免疫应答的诱导以及细胞毒性效应的产生。该方案能够在类器官微环境中研究人冠状病毒与宿主之间的相互作用，该微环境能够高度模拟体内鼻上皮组织的特征，包括其细胞组成的异质性以及黏液纤毛功能。该技术也可应用于其他气液界面（ALI）培养系统，例如源自下呼吸道的培养模型。此外，该系统还可用于模拟哮喘或囊性纤维化气道等临床疾病状态。在具有基底室和顶室的Transwell培养小室中培养和分化鼻腔气液界面（ALI）培养物。先在浸没条件下扩增解离的人鼻窦鼻腔细胞，随后移除顶室中的培养基，以促使培养物在气液界面条件下进行分化。感染前一天，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗气液界面培养物的顶面。操作时，向每个Transwell的顶室加入200 µL预热的PBS，将培养板置于37°C孵育5分钟。吸除PBS，并重复洗涤两次。然后，每孔加入500微升新鲜培养基以替换基础培养基，并在预定的感染温度下平衡培养过夜。次日，将病毒用无血清DMEM稀释，以在总体积为50微升的接种液中达到所需的感染复数。将病毒接种液加入培养物的顶端，并将培养物放回培养箱中孵育1小时。孵育期间，每隔15分钟，用双手牢固握住培养板，轻轻前后及左右摇动，以确保病毒接种物均匀吸附。孵育结束后，吸除病毒接种物，并按照前述方法用PBS洗涤每孔感染培养物三次，以确保彻底去除残留接种物。如有需要，可收集第三次PBS洗涤液，以确认输入病毒已被充分清除。每 72 小时更换一次感染的 ALI 培养物的基底培养基。在预定的感染后时间点，向每个感染的 transwell 器械的顶腔加入 200 微升 PBS。用移液器将 PBS 上下吹打五次，以确保最大程度收集顶腔脱落的病毒，并将全部液体转移至微量离心管中，以收集顶腔表面液体（ASL 样本）。接下来，对样本进行连续稀释，利用标准的病毒蚀斑实验定量气液界面（ASL）中病毒颗粒的浓度。如屏幕所示，根据待滴定的人类冠状病毒（HCoV）类型选择相应的细胞种类。如有需要，可通过蚀斑实验检测感染后不同时间点收集的未稀释基底培养基，以确认是否存在基础性释放的病毒。为测量鼻腔气液界面（ALI）培养物的经上皮电阻（TEER），请按照制造商说明对EVOM仪器进行清洁、平衡和调零。使用不含鼻腔细胞的空的Transwell进行调零，并记录空白测量值。为清洗残留的基础培养基，将每个感染的Transwell转移至预先标记的洁净24孔板中，每孔预先加入500 µL含钙和镁的PBS。然后，向每个Transwell的顶端室中加入200 µL含有钙和镁的PBS。向Endohm-6测量室中加入1 mL含有钙和镁的PBS。使用镊子将每个Transwell放入Endohm-6测量室中，并通过盖上盖子封闭测量室。确保顶端电极浸没

infection-primary-nasal-epithelial-cells-grown-at-an-air-liquid

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在气液界面上生长的原代鼻上皮细胞的感染，以表征人类冠状病毒与宿主的相互作用

该方法可用于表征扩展的细菌共培养体系与EpiAirways的相互作用，后者是一种在气液界面培养的原代人呼吸道上皮组织，具有生物学相关性 体外...

利用 EpiAirway 模型表征长期宿主-病原体相互作用

我们描述了通过流式细胞术负向筛选快速分离原代小鼠II型肺泡上皮细胞（AECII）的方法。这些AECII具有高存活率和高纯度，适用于多种功能和分子研究，以探讨其在自身免疫性疾病或感染性疾病等呼吸系统疾病中的作用。...

流式细胞术分离小鼠原代II型肺泡上皮细胞用于功能与分子研究

来源：Montefusco-Pereira, C. V. 等. 铜绿假单胞菌...

建立共培养模型在气液界面研究宿主-病原体相互作用

来源：Otter, C. J., 等. 利用气液界面培养的原代鼻上皮细胞感染模型表征人冠状病毒与宿主相互作用。J. Vis. Exp.

病毒在气液界面培养的人鼻上皮细胞中的增殖

本报告中的发现和结论仅代表作者观点，不一定代表美国疾病控制与预防中心的观点。...

建立人呼吸道上皮Calu-3细胞的液体覆盖培养模型以研究宿主细胞对呼吸道病原体的反应 体外

通过人体志愿者浅表刮取活检获得的鼻上皮细胞，在组织培养插件中进行扩增和转移。当细胞达到汇合状态后，于气液界面培养，从而获得纤毛细胞和非纤毛细胞的培养物。分化的鼻上皮细胞培养物为研究呼吸道黏膜提供了可行的实验模型。...

人鼻上皮细胞在气液界面的培养

人呼吸道合胞病毒（HRSV）可导致婴幼儿严重的细支气管炎。严重HRSV疾病发病机制的一部分由宿主免疫反应引起。利用HRSV刺激原代人免疫细胞，可提供一种快速且可重复的模型系统，用于研究炎症通路的活化及感染过程。...

一个 体外 研究人外周血单个核细胞对人呼吸道合胞病毒感染免疫应答的模型

我们描述了一种用于感染气道的三维共培养模型的实验方案，该模型在气液界面处建立，使用CFBE41o-细胞、THP-1巨噬细胞和Pseudomonas...

P. aeruginosa 感染的支气管上皮细胞与巨噬细胞在气液界面的三维共培养模型用于抗感染药物的临床前评价

本方案详细描述了病毒感染的鼻上皮细胞与天然免疫细胞活化之间早期相互作用的研究方法。可根据免疫细胞亚群在病毒感染后的活化状态对其进行区分，并进一步研究其对早期抗病毒反应的影响。...

无接触共培养模型用于研究呼吸道病毒感染期间的固有免疫细胞活化

本文介绍了在气液界面条件下原代人鼻上皮（HNE）细胞的分离、扩增与分化方法，以及一种可成功冻存并复苏扩增后HNE细胞的生物样本库保存方案。该方案可分析分化后的HNE细胞的电生理特性，以及在不同调节剂处理下CFTR相关的氯离子分泌功能的纠正情况。...

原代人鼻上皮细胞：精准医学背景下的生物样本库建设

本文介绍了一种在气液界面培养系统中构建包含诱导性多能干细胞（iPSC）来源的肺上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬细胞的复杂多细胞气道屏障模型的方法。...

利用iPSC衍生的上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和免疫细胞共培养模拟肺部健康与疾病状态下的气道屏障完整性

学习利用气液界面培养原代鼻上皮细胞来研究人类冠状病毒与宿主的相互作用。该方法可分析病毒复制动力学、先天免疫诱导及细胞毒性，为呼吸道病毒感染机制研究提供重要模型。

在气液界面培养的原代鼻上皮细胞感染模型中表征人冠状病毒与宿主相互作用

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