在气液界面上生长的原代鼻上皮细胞的感染，以表征人类冠状病毒与宿主的相互作用

此处描述的方案解决了关键问题，例如人类冠状病毒感染期间鼻上皮的复制动力学、宿主细胞嗜性、先天免疫诱导和细胞毒性诱导。该协议能够研究人类冠状病毒宿主在类器官微环境中的相互作用，该微环境密切概括了体内鼻上皮的特征，包括其异质细胞群和粘膜纤毛功能。该技术可应用于其他 ALI 培养系统，例如来自下气道的培养系统。

此外，该系统还可用于模拟哮喘或囊性纤维化气道等临床疾病状态。在具有基底腔和顶腔的 transwell 中生长和分化鼻气液界面或 ALI 培养物。在浸没条件下扩增解离的人鼻窦细胞，然后从顶腔中取出培养基，以允许在气液界面中分化培养物。

在感染前一天，用磷酸盐缓冲盐水或 PBS 顶端洗涤 ALI 培养物。为此，将 200 微升加热的 PBS 添加到每个 transwell 的顶端隔室中，并在 37 摄氏度下孵育板 5 分钟。吸出 PBS 并重复洗涤过程两次。

然后，用每孔 500 μL 新鲜培养基替换基础培养基，并在预期的感染温度下平衡培养物过夜。第二天，在无血清 DMEM 中稀释病毒，以达到所需的感染复数，总接种量为 50 微升。将病毒接种物顶端加入培养物中，并将其放回培养箱中 1 小时。

在孵育过程中，每 15 分钟用双手牢牢握住板，轻轻地前后和左右摇动板，以确保病毒接种物的均匀吸附。孵育后，吸出病毒接种物，并如前所述用 PBS 洗涤每个感染的培养物 3 次，确保其完全去除。如果需要，收集第三次 PBS 洗涤液以确认输入病毒的充分去除。

每 72 小时更换一次受感染 ALI 上的基础培养基。在感染后的预定时间点，向每个感染的 transwell 的顶腔中添加 200 微升 PBS。将 PBS 上下移液五次，以确保最大程度地收集根尖脱落的病毒，并将整个体积转移到微量离心管中以收集根尖表面液体或 ASL 样品。

接下来，连续稀释样品以使用标准病毒噬菌斑测定法定量 ASL 中病毒颗粒的浓度。如屏幕上所示，根据要滴定的人类冠状病毒或 HCoV 选择细胞类型。如果需要，通过在感染后不同时间点收集的未稀释基础培养基的噬菌斑测定来确认是否存在基础释放的病毒。

要测量鼻腔 ALI 培养物的 TEER，请按照制造商的说明清洁、平衡和空白 EVOM 仪器。使用没有鼻细胞的空 transwell 进行空白并记录空白测量值。要洗涤残留的基础培养基，将每个感染的 transwell 转移到预先标记的干净 24 孔板中，该板含有 500 微升 PBS，每个孔中含有钙和镁。

然后，将 200 微升含有钙和镁的 PBS 添加到每个 transwell 的根尖隔室中。将 1 毫升含有钙和镁的 PBS 添加到 Endohm-6 测量室中。使用镊子将每个 transwell 放入 Endohm-6 测量室中，然后更换盖子关闭腔室。

确保根尖电极浸没在根尖隔室的 200 微升 PBS 中。基底电极保持在腔室底部。一旦 EVOM 读数稳定下来，记录原始 TEER 测量值。

如果需要滴定，请在 TEER 测量后收集 ASL 样品。使用屏幕上显示的公式将原始 TEER 读数转换为以欧姆/平方厘米为单位的最终测量值。对于人类冠状病毒 （HCoV），请在感染后每隔 24 小时或 48 小时评估一次 TEER。

确保在每个时间点都包含阴性对照。对于培养基或背景对照，使用与用于收集 ASL 样品的成分相同的 PBS。对于阳性对照，用 200 微升 2% Triton X-100 顶端处理对照 ALA 培养物。

孵育 10 至 15 分钟后，按照由 Triton 阳性对照样品、模拟背景对照样品、PBS 对照样品和实验样品组成的板布局，将整个体积收集为 Triton 密封样品。将乳酸脱氢酶或 LDH 板一式三份上样。最后，使用显示的方程计算相对于 Triton 密封值的细胞毒性百分比，用四种 HCoV 感染的鼻腔 ALI 培养物的平均顶端脱落病毒滴度显示，尽管 SARS-CoV-2 和 HCoV-229E 的复制效率最高，但每种病毒都有效地复制。

感染后 48 小时 （HPI） 的 MERS-CoV 细胞内和顶端脱落病毒滴度大致相同。将感染的培养物与病毒抗原特异性抗体和纤毛细胞或杯状细胞标志物的共染色显示，SARS-CoV-2 和 HCoV-NL63 主要感染纤毛细胞，但 MERS-CoV 主要感染非纤毛杯状细胞。SARS-CoV-2 和 HCoV-NL63 感染的 TEER 从基线到给定感染后时间点或 delta-TEER 的差异在 192 HPI 时为阴性，这与 MERS-CoV 感染不同，后者导致 TEER 没有显着变化。

负 delta-TEER 值表示上皮屏障完整性受损。HCoV-229E 在早期的 96 HPI 时间点引起上皮屏障功能障碍，但在感染后期恢复到模拟水平。TEER 追踪描述了每个感染的 transwell 随时间的原始 TEER 数据，从而可以可视化感染过程中的 TEER 趋势。

感染期间顶端释放的 LDH 的定量显示，SARS-CoV-2、HCoV-NL63 和 HCoV-229E 在鼻培养物中引起显着的细胞毒性，而 MERS-CoV 则没有。了解鼻腔培养物中的病毒复制动力学至关重要，因为这些动力学决定了其他下游分析（如细胞毒性和先天免疫诱导）的最佳时间点。如果在感染前和感染后的不同时间对相同的培养物进行序贯进行 TEER 测量，以便监测感染过程中 TEER 的变化，则 TEER 测量信息量最大。

我们目前的研究将 RNA 测序方法应用于所描述的系统，以了解人类冠状病毒感染期间的转录变化，以及 ELISA 技术来测量细胞因子和其他蛋白质的产生。