Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kvantifisering av globale histon-posttranslasjonelle modifikasjoner ved bruk av intranukleær flowcytometri i isolert musehjernemikroglia

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65080
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Djavad Mowafaghian Centre for Brain Health, University of British Columbia, 2Graduate Program in Neuroscience, Djavad Mowafaghian Centre for Brain Health, University of British Columbia

Summary

Dette arbeidet beskriver en protokoll for kvantifisering av globale histonmodifikasjoner ved bruk av intranukleær flowcytometri i isolert hjernemikroglia. Verket inneholder også mikrogliaisolasjonsprotokollen som ble brukt til datainnsamling.

Abstract

Genekspresjonskontroll skjer delvis ved modifikasjoner i kromatinstrukturen, inkludert tillegg og fjerning av posttranslasjonelle modifikasjoner av histonhaler. Histon posttranslasjonelle modifikasjoner (HPTM) kan enten lette genuttrykk eller undertrykkelse. For eksempel nøytraliserer acetylering av histonhalelysinrester den positive ladningen og reduserer interaksjoner mellom halen og negativt ladet DNA. Reduksjonen i histonhale-DNA-interaksjoner resulterer i økt tilgjengelighet av det underliggende DNA, noe som muliggjør økt transkripsjonsfaktortilgang. Acetyleringsmerket fungerer også som et anerkjennelsessted for bromdomeneholdige transkripsjonsaktivatorer, noe som sammen resulterer i forbedret genuttrykk. Histonmerker kan reguleres dynamisk under celledifferensiering og som respons på forskjellige cellulære miljøer og stimuli. Mens neste generasjons sekvenseringsmetoder har begynt å karakterisere genomiske steder for individuelle histonmodifikasjoner, kan bare en modifikasjon undersøkes samtidig. Gitt at det er hundrevis av forskjellige HPTM-er, har vi utviklet et kvantitativt mål med høy gjennomstrømning av globale HPTM-er som kan brukes til å skjerme histonmodifikasjoner før vi utfører mer omfattende genomsekvenseringsmetoder. Denne protokollen beskriver en flowcytometribasert metode for å oppdage globale HPTM og kan utføres ved hjelp av celler i kultur eller isolerte celler fra in vivo vev. Vi presenterer eksempeldata fra isolert musehjernemikroglia for å demonstrere følsomheten til analysen for å oppdage globale skift i HPTM som respons på en bakterieavledet immunstimulus (lipopolysakkarid). Denne protokollen muliggjør rask og kvantitativ vurdering av HPTM og kan brukes på enhver transkripsjonell eller epigenetisk regulator som kan detekteres av et antistoff.

Introduction

Epigenetikk er studiet av mekanismene som regulerer genuttrykk uten å endre den underliggende DNA-sekvensen. Epigenetisk regulering av genuttrykk er dynamisk i celler og kan muliggjøre raske og koordinerte responser på ulike miljøstimuli. Den dynamiske reguleringen skjer delvis på grunn av endringer i kromatinstrukturen på nukleosomnivået, som består av histonproteiner (H2A, H2B, H3, H4) samlet i en oktamerkjerne tett viklet av DNA1. Samspillet mellom histonproteinene og DNA kan kontrollere tilgjengeligheten av DNA til transkripsjonsmaskineri, som til slutt kan kontrollere genuttrykk og andre aspekter av kromatinbiologi2. Histonproteiner har ustrukturerte haler som har positivt ladede rester som danner elektrostatiske interaksjoner med den negativt ladede DNA-ryggraden. Disse interaksjonene resulterer i tett pakking av DNA og redusert DNA-tilgjengelighet. Kovalente modifikasjoner av histonhalene, kalt histon posttranslasjonelle modifikasjoner (HPTM), kan regulere disse interaksjonene 3,4. Noen av de mest karakteriserte HPTM-ene inkluderer histonhalacetylering og metylering, noe som kan endre affiniteten til elektrostatiske interaksjoner mellom histonhaler og DNA, noe som resulterer i differensiell tilgjengelighet til det underliggende DNA og rekruttering av transkripsjonsfaktorer som gjenkjenner disse HPTM-ene på bestemte steder. HPTM er regulert av tre viktige klasser av enzymer som kalles lesere - som gjenkjenner, forfattere - som innskudd og viskelær - som fjerner HPTM. Dermed kan rekruttering eller oppløsning av leser-, forfatter- eller viskelærenzymer til slutt endre landskapet til HPTM og styre strukturen og funksjonen til kromatin, noe som gjør regulering og avlesning avgjørende for å forstå cellulær biologi og funksjon 3,4.

Cellene i sentralnervesystemet (CNS) er epigenetisk fleksible når de endrer transkriptomet for å tilpasse seg miljøstimuli. Akkumulerende bevis tyder på at endringer i epigenomet, som DNA-metylering, ikke-kodende RNA og HPTM, spiller en viktig rolle i minnedannelse og synaptisk funksjon5. Å forstyrre HPTM-dynamikken gjennom manipulering av relevante lesere, forfattere eller viskelær kan blokkere eller forbedre assosiativ læring og langsiktig potensiering 6,7,8. Mikroglia, den bosatte immuncellen til CNS, regulerer raskt transkriptomet som respons på immunstimulering gjennom dynamiske endringer i epigenomet 9,10,11. Denne høye tilpasningen til deres lokale hjernemiljø gjør dem vanskelige å undersøke i en isolert kontekst, da studier har vist at epigenomet og transkriptomet til mikroglia blir endret etter bare noen få timer i kulturmedier etter fjerning fra hjernemiljøet11. I tillegg, da mikroglia bare utgjør 10% av hjernens celler, mangler tiltak som undersøker endringer på hele vevsnivå sensitivitet og spesifisitet12,13. Som et resultat må mikroglia raskt isoleres for å undersøke epigenetiske endringer som HPTM-nivåer, ex vivo.

Metodene som vanligvis brukes til å undersøke HPTM, inkluderer kromatin-immunutfellingssekvensering (ChIP-seq) og spaltning under mål og tagmentasjonssekvensering (CUT&Tag-seq)4. Selv om disse teknikkene er svært spesifikke for en individuell HPTM og kan informere tilstedeværelsen av HPTM innenfor en bestemt genomisk kontekst, kan de bare undersøke en av de mange mulige HPTM-ene i et enkelt eksperiment 11,14 Derfor, før du fortsetter med slike eksperimenter, som krever en betydelig tid og pengeinvestering, er det svært verdifullt å begrense listen over potensielt interessante HPTM-er for videre undersøkelse ved først å undersøke endringer i globale nivåer av HPTM. De to hovedtilnærmingene for å undersøke globale HPTM-nivåer er immunhistokjemi og western blot-analyse, men begge tilnærmingene er bare semi-kvantitative, lave gjennomstrømning, og krever et stort antall vevsseksjoner eller isolerte celler15,16. Derfor hadde vi som mål å utvikle en svært sensitiv, kvantitativ metode som kunne brukes til å undersøke de globale HPTM-nivåene raskt og på enkeltcellenivå.

Protokollen som presenteres muliggjør deteksjon av globale HPTM-nivåer raskt ved bruk av intranukleær flowcytometri. Tidligere studier på kreftceller har begrunnet viktigheten av å undersøke globale nivåer fra et klinisk perspektiv17,18. Det er også vanlig at studier bruker globale nivåer som screeningmetode før man vurderer genomisk lokalisering av spesifikke HPTM av interesse19,20. For mikroglia er det utfordrende å vurdere globale nivåer etter isolasjon på grunn av det lave celleutbyttet; Pan et al presenterer globale HPTM-nivåer fra isolert mikroglia, hvor mikroglia fra tre dyr ble samlet for å muliggjøre proteinnivådeteksjon av western blot19. Ved hjelp av protokollen vår er vi i stand til å oppdage globale endringer med mye lavere celleinnganger, noe som muliggjør screening av flere merker per dyr og eliminerer behovet for å samle prøver.

Her beskriver vi en protokoll for å oppdage HPTM-nivåer raskt via kvantitativ intranukleær flowcytometri i isolert mikroglia. Mens vi fokuserer spesielt på HPTM-kvantifisering for korthets skyld, kan denne protokollen brukes på samme måte for å kvantifisere globale nivåer av leser-, forfatter- og viskelærenzymer. Protokollen leveres i to deler: for det første isolasjonsmetoden for mikroglia og for det andre den flowcytometribaserte metoden for bestemmelse av HPTM-nivåer. Isolasjonsmetoden gir celler som kan brukes til både RNA-isolasjon og HPTM-nivåvurdering som muliggjør evaluering av genuttrykk og HPTM-nivåer fra samme prøve. I tillegg kan metoden for HPTM-vurdering brukes på andre celletyper som angitt i protokollen.

Protocol

Alle dyrepleieprotokoller ble godkjent av University of British Columbias dyrepleiekomité i samsvar med Canadian Council on Animal Care-retningslinjene.

1. Hjernefordøyelse for mikrogliaisolasjon

Figure 1
Figur 1: Enkelt flytskjema for protokollen. Musene blir først transkardialt perfusert med HBSS, og hjernen dissekeres. Hjernen blir deretter dissosiert gjennom kjemisk fordøyelse og mekanisk forstyrrelse for å resultere i et enkelt cellehomogenat. Den immunberikede fraksjonen samles via diskontinuerlig tetthetsgradient, hvoretter cellene farges for P2RY12. Fargede celler er enten 1) sortert via fluorescerende aktivert cellesortering (FACS) for å føre til RNA-analyse eller nedstrøms proteinanalyse og / eller 2) fast, permeabilisert og farget for intranukleære proteiner. Proteinnivået kvantifiseres av median fluorescensintensitet i interessekanalen bestemt ved flowcytometri. Bokser farget i blått er en del av protokollen trinn 1) Hjernefordøyelse for mikrogliaisolasjon. Bokser farget i rødt er en del av protokollen trinn 2) Intranukleær strømningsfarging for proteinuttrykksanalyse. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Fremstilling av reagenser
    MERK: Hvis du planlegger en ekstraksjon for å samle både RNA og celler for HPTM-analyse, se avsnitt 1.7.1 for modifikasjoner for å inkludere transkripsjons- og translasjonshemmere. Dette er imidlertid ikke nødvendig hvis man bare vurderer proteinsignalet, da cellene stort sett hviler når de holdes på is.
    1. Fluorescensaktivert cellesorteringsbuffer (FACS) (20 ml per prøve): Løs opp bovint serumalbumin (BSA) i 1x Hanks balansert saltløsning (HBSS) for å lage en 2% BSA-løsning. Løs opp EDTA til en endelig konsentrasjon på 1 mM i 2 % BSA-oppløsningen. Filtrer steriliser med et 0,2 μm filter og oppbevar ved 4 °C i opptil 1 uke før bruk.
    2. Fordøyelsesbuffer (1 ml per prøve): Rekonstituer et hetteglass med papain i HBSS til en endelig konsentrasjon på 20 E/ml i 1 mM L-cystein med 0,5 mM EDTA. Aktiveres ved 37 °C i minimum 10 minutter eller til det er klart til å fordøye vev. Like før bruk, tilsett DNase I til den aktiverte papain-løsningen til en endelig konsentrasjon på 200 E / ml. Forbered dette på dagen for eksperimentet og ikke lagre.
    3. Isoton tetthetsgradientløsning (5,5 ml per prøve): Tilsett 10x HBSS til kaldt tetthetsgradientmedium til en endelig konsentrasjon på 1x HBSS, noe som resulterer i en endelig tetthet på 1,117 g / ml. Vortex å blande i minst 30 s før bruk. Legg på is til bruk.
    4. 37 % tetthetsgradientløsning (4 ml per prøve): Tilsett isoton tetthetsgradient til 1x HBSS for å lage en endelig konsentrasjon på 37 % med en endelig tetthet på 1,043 g/ml. Tilsett 20 μL fenolrødt for hver ml med 37 % tetthetsgradient for å lage en rosa løsning for visualisering under lagdeling. Vortex i minst 30 s før bruk. Legg på is til bruk.
    5. 70 % tetthetsgradientløsning (2 ml per prøve): Tilsett isoton tetthetsgradient til 1x HBSS for å lage en endelig konsentrasjon på 70 % med en endelig tetthet på 1,082 g/ml. Tilsett 5 μL trypanblå for hver ml med 70 % tetthetsmedium for å lage en blå løsning for visualisering under lagdeling. Vortex i minst 30 s før bruk. Legg på is til bruk.
  2. Perfusjon og hjernedisseksjon
    MERK: Perfusjonsprotokollen ligner på Posel et al. som inneholder videoskildring av musetorakotomi, transkardial perfusjon og hjernefjerning21. Her bruker vi voksne C57BL/6J hann- og hunnmus (10-15 uker gamle, 20-30 g), men denne protokollen kan brukes til å utføre en torakotomi for enhver mus. Alle dyreprosedyrer må godkjennes av institusjonens etiske komité før forsøk gjennomføres.
    1. Musebedøvelse: Bedøv mus med 4% isofluran i 100% oksygen til forbi planet for kirurgisk anestesi, som kan bekreftes med en tåklemme, eller mangel på refleks ved å klemme musens fot fast. Plasser musen på ryggen og fest de fire potene godt ned i det kirurgiske disseksjonstavlen som er plassert vippet i et plastbrett, slik at nesen er festet i isofluorannesekjeglen. Etter overføring, sørg for at dyret fortsatt er forbi det kirurgiske anestesiplanet før du fortsetter.
    2. Mus thoracotamy: Ta tak og løft bukhuden ved hjelp av tang og gjør et grunt snitt gjennom huden og bukveggen for å eksponere xyphoid uten å skade den synkende aorta eller underliggende organer.
    3. Ta tak i xyphoid med tang og gjør laterale snitt under brystkassen for å avsløre membranen og leveren. Gjør forsiktige grunne kutt gjennom membranen langs lengden av ribbeholderen ved hjelp av fin saks og gjennom brystkassen ved hjelp av vevsaks og fest brystbenet til operasjonsstasjonen nær musens hode for å utsette hjertet og lungene for transkardial perfusjon.
    4. Transkardial perfusjon: Klargjør en peristaltisk perfusjonspumpe og fest en 26,5 G kanyle på den ene enden av slangen. Klargjør slangen for prosedyren ved å sette den ene enden av slangen inn i et hetteglass med kald 1x HBSS og slå på pumpen for å fylle slangen helt med 1x HBSS.
    5. Mens du holder hjertet med stump tang, sett spissen av en 26,5 G nål med den vedlagte perfusjonsslangen inn i hjertets venstre ventrikkel og gjør et lite snitt i høyre atrium. Slå på perfusjonspumpen for å perfusere musen forsiktig med en hastighet på ~ 2-4 ml / min med minst 15-20 ml kald 1x HBSS.
      MERK: En fullstendig perfusjon er ofte indikert når leveren begynner å tømme blod og blir den samme fargen som hjertet.
    6. Hjernefjerning: Halshugg musen ved hjelp av vevsdissekerende saks og gjør et midtlinjesnitt i hodebunnen fra nakke til nese. Skrell huden klaffer til sidene for å avsløre skallen og fjern overflødig vev og bein i den kaudale enden av skallen med dissekerende saks.
    7. Skyv forsiktig det ene saksbladet under skallen inn i foramen magnum med den skarpe siden mot beinet og kutt forsiktig opp midtlinjen mot nesen. Gjør laterale kutt både i bunnen av skallen og nær nesen ved hjelp av dissekere saks. Ved hjelp av fine tang, liv skallen fra midtlinjen til utsiden for å knekke av hodeskallebitene og avsløre hjernen. Løft forsiktig hjernen med en slikkepott og legg på disseksjonsblotpapir.
    8. Hjernedisseksjon: Legg hjernen på et stykke disseksjonsblotpapir fuktet med 1x HBSS på toppen av en lukket petriskål fylt med is. Fjern lillehjernen og kryss hjernehalvdelene ved hjelp av et rent barberblad.
    9. Fjern hjernestammen, striatum og hvit substans fra hver halvkule, mens du holder hippocampus og overliggende cortex intakt. Overfør hemisfærene som inneholder isolert cortex og hippocampusvev til et 15 ml rør med 5 ml kald 1x HBSS og hold på is.
      MERK: Det er viktig å utføre disseksjonene så raskt som mulig slik at vevet forblir kaldt med ikke mer enn 2 minutter mellom halshugging og endelig plassering av dissekert vev i 1x HBSS på is. Hvis man isolerer mikroglia fra flere dyr, kan hjernen lagres på is i 1x HBSS i ~1 time før man fortsetter med å behandle hele kohorten av dyr for fordøyelse etc.
  3. Hjernens fordøyelse og homogenisering
    1. Mekanisk og kjemisk dissosiasjon: Legg hjernevevet fra hver mus og 1 ml fordøyelsesbuffer i individuelle petriskåler på is. Bruk et rent skalpellblad til å hakke hjernen grundig i små biter (<1 mm).
    2. Klipp spissen av en plastoverføringspipette og overfør forsiktig hver av de hakkede hjernene til separate brønner i en 24-brønnsplate på is. Dekk platen med gjennomsiktig fleksibel film og rug på is i 30 minutter.
      NOTAT: Når hakket riktig, ligner hjernevevet godt hakket hvitløk.
    3. Dounce homogenisering: Overfør fordøyd hjerneoppløsning fra hver brønn til individuelle 7 ml glass dounce homogenisatorer på is hver fylt med 5 ml kald FACS buffer. Slå hver hjerne forsiktig med løs pestle (A), omtrent 30-40 ganger, til en enkelt celle suspensjon er oppnådd. Etter doncing med A-stammen, slå forsiktig med den stramme pestle (B) 3-4 ganger for å sikre en enkelt celle suspensjon.
      MERK: Ikke skyv stammen mer enn 3/4 av veien ned for å unngå å knuse vevet i bunnen av homogenisatoren. Den endelige løsningen skal være ugjennomsiktig og melkeaktig.
      MERK: Hvis du fordøyer flere hjerner i et enkelt eksperiment, tid overføringen av hjernens fordøyelse til FACS-buffer slik at hver prøve bare er i fordøyelsesbufferen i 30 minutter. Overfordøyelse kan resultere i spaltning av overflateproteiner, noe som reduserer nedstrøms antistoffbinding og signal.
  4. Innhenting av immunberiket fragment
    1. Etablering av tetthetsgradient: Overfør homogenatet fra hver hjerne til separate 15 ml polypropylenrør og tilsett 2,125 ml isoton tetthetsgradient og topp til 8,5 ml med FACS-buffer for hver for å oppnå en endelig konsentrasjon på 25% tetthetsgradient. Snu forsiktig 15 ml rørene 20x for å blande grundig.
    2. Bruk en smalgradert overføringspipette til å legge 4 ml 37 % tetthetsgradient forsiktig under hvert rør, og vær svært nøye med å etablere rene lag. Bytt overføringspipetter og legg forsiktig under 2 ml med 70 % tetthetsgradient (figur 2A). Overfør til en sentrifuge avkjølt til 4 °C og sentrifugering ved 500 x g i 20 minutter med bremserampen satt til null.
    3. Oppsamling av immunberiket fragment: Bruk pipetter med ren overføring, aspirer myelinet forsiktig fra toppen av volumet i 15 ml røret med en ren overføringspipette og kast. Samle forsiktig det øverste fragmentet av tetthetsgradienten til et rent 15 ml polypropylenrør ved hjelp av en overføringspipette.
    4. Samle forsiktig det immunberikede fragmentet (1,5 ml over og 1,5 ml under der lagene på 70 % og 37 % tetthet møtes) til et nytt 15 ml polypropylenrør (figur 2B). Tilsett 10 ml FACS-buffer til den immunberikede prøven for å fortynne tetthetsgradientmediet og snu røret forsiktig 20x for å blande grundig.
      MERK: Siden celler har en tendens til å feste seg til sidene av røret, må du sørge for å samle alle cellene i prøven under innsamlingstrinnene ved å sirkle pipetten sakte langs sidene av røret mens du samler væsken.
    5. Pellet cellene i den immunberikede prøven ved å sentrifugere 15 ml rørene i en 4 ° C sentrifuge ved 500 x g i 10 minutter med nedoverbakkebremsen satt til null. Umiddelbart etter slutten av spinnet, fjern supernatanten forsiktig, og etterlat ca. 300 mikrol væske i 15 ml røret, og pass på at du ikke forstyrrer pelleten (som kanskje ikke er synlig).
    6. Samle supernatanten i et annet 15 ml rør for å sikre at cellene ble pelletert i spinnet (kast denne fraksjonen når verifisering med celleantallet til den resuspenderte pelleten er gjort). Etter resuspendering av cellepelleten i 300 μL-volumet ved hjelp av en P1000-pipette, teller celler med et hemacytometer for å estimere det totale celleutbyttet.

Figure 2
Figur 2: Innhenting av immunberiket fragment ved diskontinuerlig tetthetsgradient. (A) Hjernehomogenatet er laget til 25% tetthetsmedium, underlag 4 ml med 37% tetthet middels farget rosa via fenolrød og 2 ml av 70% tetthet middels farget blå via trypanblå. (B) Etter sentrifugering har fraksjonene skilt lag. Microglia hviler på grensesnittet til 37% og 70% tetthet mediefragmenter. Myelinfragmentet er på toppen av 15 ml røret og vil bli kastet. Det øverste fragmentet samles som sikkerhetskopi i tilfelle spinnet mislykkes, og ingen celler gjenopprettes. Hvis det skjer, kan gradienten gjentas ved hjelp av denne brøkdelen. Den immunberikede fraksjonen samles nedstrøms. Den nederste fraksjonen som inneholder røde blodlegemer forblir i røret og kasseres. (C) Eksempelfigur som viser hele lag. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Farging av ekstracellulære antistoffer
    1. Blokkering: Overfør celler til en rund bunn 96 brønnplate på is og sentrifuge ved 500 x g med brems for å pelletere cellene. Fjern supernatanten raskt i vasken ved å vippe på platen for å kvitte deg med supernatanten, slik at cellepelleten forblir intakt i bunnen av brønnen.
    2. Resuspender cellene i 50 μL FACS-buffer med anti-mus CD16/32 FC-reseptorblokkerende reagens ved hjelp av en P200-pipette (endelig konsentrasjon 10 μg / ml, fortynningsfaktor 1:50) for å forhindre uspesifikk binding av antistoffer mot monocytter eller andre FcR-bærende celler. Inkuber i 10 min på is.
    3. Antistofffarging: Klargjør passende volum av en 2x masterblanding som inneholder P2RY12- Allophycocyanin (APC; fortynningsfaktor 1:50, konsentrasjon 4 μg/ml for en endelig brønnkonsentrasjon på 1:100, konsentrasjon 2 μg/ml) og fiolett 525 levende død flekk (fortynningsfaktor 1:50 for en endelig brønnkonsentrasjon på 1:100). Tilsett 50 μL av fargemasterblandingen til cellesuspensjonen (oppnådd etter blokkering i seksjon 1.5.1) og inkuber platen i 30 minutter i mørket på is.
      MERK: For denne protokollen presenterer vi farging av cellene med P2RY12. For det første er P2RY12 en homeostatisk markør for mikroglia som kan nedreguleres i visse sykdomssammenhenger. For eksempel har 5XFAD Alzheimers modellmus nedregulerte P2RY12-nivåer som kan gjøre dem vanskelige å identifisere22. Alternative flekker som kan brukes til isolasjon inkluderer Tmem119, Cd11b og CD4523. For det andre kan konjugatfluorokrom-APC justeres for å passe til ønsket antistoffpanel. Å velge et lyst fluorokrom, som APC eller PE, vil imidlertid bidra til å sikre at de positive og negative populasjonene er lett å skille24.
    4. Etter farging, tilsett 200 μL FACS-buffer direkte til hver brønn for å vaske cellene. Spinn ved 500 x g ved 4 °C for å fjerne supernatant ved å flikke. Resuspendere celler i 200 μL FACS-buffer med en P200-pipette, spinn ved 500 x g ved 4 °C og flikkplate for å fjerne buffer fra brønner.
    5. Klargjøring av flytkontroller: Før farging, separer nødvendige volumer av celler fra hver prøve etter blokkering i trinn 1.5.1 for de nødvendige flytkontrollene.
      MERK: Flytkontroller kreves for hvert eksperiment for å etablere portene. Strømningskontrollene kan tas fra et ekstra dyr eller fra en brøkdel av hver av de eksperimentelle brønnene. Når du deler celler, må du tilordne nok celler per kontroll, da det kreves 10 000-30 000 celler per kontroll for å etablere porter med høy sikkerhet.
      1. Det er tre relevante strømningskontroller: ingen flekk, levende død og P2RY12 isotypekontroll. For ingen flekkkontroll, ikke legg til noe antistoff. I P2RY12 isotypekontrollen, behandle celler med levedyktig fargestoff (1:100) og et isotypekontrollantistoff konjugert til APC (1:100).
      2. For å forberede den levende døde kontrollen, alikotceller i en egen brønn og flytt halvparten av cellevolumet inn i et 500 μL rør. Plasser 500 μL røret i -80 ° C fryseren i 5 minutter, og legg deretter i 37 ° C inkubator i 5 minutter for å drepe cellene. Sett alikoten av døde celler tilbake i kontrollbrønnen for levende døde og flekker med et aminbindende levedyktighetsfargestoff på fiolett 525 (fortynningsfaktor 1:100) for å markere døde celler.
        MERK: Protokollen er skrevet for platefarging med en flikkmetode for fjerning av supernatant. Dette krever imidlertid at supernatanten fjernes umiddelbart etter at spinnet er fullført, og flikkingen må gjøres med nok kraft til raskt å fjerne supernatanten uten å forstyrre pelleten. Alternativt kan 1,5 ml RNAse/DNase frie rør brukes til farging, med følgende modifikasjoner: Overfør celler til 1,5 ml mikrosentrifugerør og pellet ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C. Aspirer supernatant med pipetter. Tips: For hastighet kan en 5 ml overføringspipette med en P200-spiss raskt og nøyaktig aspirere supernatanten. Når du aspirerer, sjekk for pelleten. Hvis pellet ikke er synlig, la 50 μL supernatant være og juster beregningene deretter. Når du vasker ut antistoffer, legg til ytterligere FACS for å øke fortynningen av antistoffer (1000 μL i stedet for 200 μL) for å ta hensyn til ufullstendig fjerning av supernatant. Avhengig av cytometeret, bruk 1,5 ml rørene for sortering, og reduser mengden forsyninger som kreves.
  2. FACS-sortering for mikroglia
    1. Forberedelse: Resuspender hver brønn i 200 μL FACS-buffer med en P200-pipette og overfør til merkede strømningssorteringsrør og tilsett FACS-buffer til totalt 500 μL for en konsentrasjon på ca. 5 x 105 hendelser per ml. Oppbevares på is i mørket til analyse. Forbered ettersorteringsrør ved å legge til 100 μL FACS-buffer som en pute for celler i 1,5 ml RNAse-frie rør.
    2. Cytometerinnstillinger: Sorter celler på en flowcytometricellesorterer satt opp med 100 μm dysen. Sorter celler ved hjelp av 18-20 psi.
    3. Gating: På cytometeret, gate for cellestørrelse ved hjelp av side-scatter (SSC) område versus fremover scatter (FSC) høyde ved hjelp av ingen flekkkontroll for å skille rusk, sette SSC-A på en loggakse for å visualisere en cellepopulasjon og gate nøye for å velge for celler (gate S1; Figur 3). For å fjerne eventuelle dubletter, plott FSC-H vs FSC-W og port tett rundt cellepopulasjonen og fjern rusk og dubletter (gate S2). Bruk P2RY12-isotypekontrollen, undersøk cellene i APC-kanalen og sett porten for autofluorescens for å bestemme P2RY12 + -celler. Ved hjelp av ingen flekk og levende døde kontroller, port for cellene som ikke er fluorescerende på fiolett 525 nm som levende celler.
    4. Sortering: Plott fiolett 525 nm vs APC og bestem populasjonen som er P2RY12 + og lever av FMOs (MG). Sorter disse cellene i det merkede ettersorteringsrøret (figur 3). Den endelige sorteringsprosenten er omtrent 50 % av de totale hendelsene, og størstedelen av hendelsens totale tap er rusk fjernet i gate S1 (~70 % av hendelsene er celler; Tabell 1).
  3. RNA-isolering og analyse
    1. Transkripsjon og oversettelseshemmere: Hvis du planlegger RNA-ekstraksjon, for å eliminere risikoen for isolasjonstilknyttede transkriptomiske signaturer, inkluderer hemmere av oversettelse og transkripsjon i buffertrinnene. Forbered inhibitorcocktailen som beskrevet av Marsh et al. inkludert actinomycin D, anisomycin og triptolide25.
      1. Inhibitorpreparat: Rekonstituer inhibitorstamceller og oppbevar som følger: Rekonstituer aktinomycin D i dimetylsulfoksid (DMSO) til 5 mg/ml og oppbevares ved -20 °C. Rekonstituer triptolid i DMSO til 10 mM og oppbevar ved -20 °C, beskyttet mot lys. Rekonstituer anisomycin i DMSO til 10 mg/ml og oppbevart ved 4 °C, beskyttet mot lys. Oppbevar alle hemmerlagrene i høyst 1 måned etter rekonstituering.
      2. Buffermodifikasjoner: Legg til hemmere i fire forskjellige buffere i protokollen som følger: Når du utfører transkardial perfusjon, klargjør HBSS med aktinomycin D (5 μg / ml, 1: 1000 fra lager) og triptolid (10 μM, 1: 1000 fra lager). Etter perfusjon transporteres hjerner til laboratoriet i HBSS som inneholder aktinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 fra lager), triptolid (10 μM, 1:1000 fra lager) og anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 fra lager). Klargjør FACS-buffer med aktinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 fra lager), triptolid (10 μM, 1:1000 fra lager) og anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 fra lager). Tilbered fordøyelsesbuffer med aktinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 fra lager), triptolid (10 μM, 1:1000 fra lager) og anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 fra lager). Forbered vaskebuffer etter sortering, med HBSS som inneholder aktinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 fra lager), triptolid (10 μM, 1:1000 fra lager) og anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 fra lager).
        MERK: Når du legger til hemmere, må du legge dem til umiddelbart før bruk og beskytte eventuelle forberedte buffere mot lys mens de er i bruk. Unngå frysetining av lagerløsninger.
    2. Post-sort vasker: Fordi cellene har blitt sortert i 1,5 ml RNase-frie rør i FACS-buffer, som vil forstyrre RNA-isolasjon, er det nødvendig å vaske cellene. Spinn cellene ved 1000 x g ved 4 °C i 5 minutter og fjern supernatanten, slik at det etterlater ca. 50 μL væske.
    3. Tilsett 200 μL 1x HBSS inneholdende aktinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 fra lager), triptolid (10 μM, 1:1000 fra lager) og anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 fra lager) og bland godt. Gjenta sentrifugeringen og fjern supernatanten med 50 μl væske (vask 1). Tilsett 200 μL ettersorteringsbuffer, bland godt og gjenta sentrifugeringen og fjern supernatanten og etterlat 25 μL væske (vask 2).
    4. RNA-ekstraksjon: For RNA-isolering fra mikroglialceller, bruk et RNA-isolasjonssett med lav inngang for høye og konsistente RNA-utbytter og RIN-score over 9 (se nedenfor og materialfortegnelse for produktanbefalinger). Til cellepelleten, tilsett 350 μL av lysisbufferen fra anbefalt sett + β-merkaptoetanol (1:100) og bland godt.
      MERK: Om nødvendig kan protokollen suspenderes på dette tidspunktet. Prøver kan lagres i lysisbufferen i -80 °C frem til RNA-ekstraksjon. Hvis du ekstraherer RNA etter lagring, tine lysatet på is og fortsett med de settspesifikke instruksjonene for isolasjonen.
    5. Overfør lysat til kolonnebasert makuleringsmaskin (se materialfortegnelse for produktanbefalinger) og sentrifuge ved maks hastighet ved 4 °C i 2 minutter. Elute i minimum 14 μl RNase-fritt vann og bestem konsentrasjonen etter behov. RNA kan brukes til enhver nedstrøms applikasjon etter dette punktet.

Figure 3
Figur 3: Gating strategi for flytsortering. Hendelser er kontrollert for cellestørrelse på SSC-A vs FSC-H (S1). Deretter blir celler inngjerdet for å være singleter på FSC-H vs FSC-W (S2). Singletceller sorteres som levende hvis de er negative på Comp-FL8-A::405-526-52 (fiolett 525 levende død flekk) og som P2RY12+ hvis de er positive på Comp-FL32-A::640-671_30 (P2RY12-APC) ved hjelp av P2RY12-isotypekontrollen. Cellene merkes som MG og sorteres hvis begge lever og P2RY12+. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

INNGJERDET BEFOLKNING Hyppighet av foreldre Frekvens av totalt Greve
S1 68.10% 68.10% 162186
S2>S1 93.59% 63.70% 151707
P2Ry12+ (670+) > S2 > S1 83.05% 52.90% 125986
Live (525-) > S2 > S1 92.78% 59.10% 140752
MG (P2RY12+ Live) >S2>S1 78.96% 50.30% 119794

Tabell 1 Eksempel på avstammingstabell med gatingprosenter og forventede hendelsesnumre.

2. Intranukleær strømningsfarging for proteinuttrykksanalyse

MERK: Andre celletyper kan startes på dette tidspunktet, denne protokollen testes med dyrkede celler, inkludert HEK293-celler, BV2 mikroglia-lignende celler og humane IPSC-avledede mikroglia.

  1. Fiksering og farging av celler
    MERK: For følgende protokoll, bruk et intracellulært fargesett som er optimalisert for kjernefysisk farging. Se Tabell over materialer for produktanbefalinger.
    1. Aliquot ekstracellulært fargede celler fra seksjon 1.5.2 til 96 brønnplate (5 x 104- 1 x 106 celler). Spinn celler i 5 minutter ved 500 x g ved 4 °C og sveip for å fjerne FACS-bufferen.
      MERK: For å få data med høy sikkerhet for mediannivåer, bør minimum 10.000 celler per brønn brukes. Selv om det ikke er anbefalt maksimum, er det best å holde antall celler konsistente gjennom hele eksperimentet for å sikre at det ikke er noen signifikant effekt av forskjellige variasjonskoeffisienter (CV).
    2. Fiksering og permeabilisering: Tilsett 200 μL 1x fikskonsentrat og bland forsiktig med P200-pipette for å resuspendere celler. Inkuber i mørket i 45-60 min. Sentrifugeplate i 5 minutter ved 500 x g ved romtemperatur (RT) og flikk for å kaste supernatant.
      MERK: Om nødvendig kan protokollen suspenderes på dette tidspunktet. Etter at supernatanten er kassert, suspenderes cellene på nytt i langtidslagringsbufferen for immunceller (se materialfortegnelsen for produktanbefalinger). Prøvene kan oppbevares ved 4 °C i 12-18 timer, beskyttet mot lys og dekket av gjennomsiktig film for å beskytte bufferfordampning.
    3. Tilsett 200 μL 1x permeabiliseringsbuffer til hver brønn og pipette med en P200 for å blande. Sentrifugeplate i 5 min ved 500 x g ved RT og flikk for å kaste supernatant. Gjenta permeabiliseringsbuffer vask totalt 3x.
    4. Klargjøring av flytkontroller: Del volumet av celler fra hver prøve for de nødvendige flytkontrollene (10.000-30.000 celler per kontrollbrønn er tilstrekkelig).
      1. For å forberede ingen flekkkontroll, fest ingen flekkceller fra typen eller aliquot ufargede celler i en egen brønn som ikke vil motta noe antistoff.
      2. For å forberede fluorescens minus en (FMO) kontroll, alikotceller for hvert av antistoffene på panelet bortsett fra den i den kanalen.
      3. For de relevante kanalene, inkluder isotypekontrollantistoffet i FMO for gating. For eksempel, i et panel som inneholder P2RY12-APC og H3K27Ac-AlexaFluor568 - bør det være to FMOS: (1) APC-FMO som bare inneholder H3K27Ac-AlexaFluor568 og P2RY12 isotypekontrollantistoff og (2) 568-FMO som bare inneholder P2RY12-APC og isotypekontrollen primær og 568 sekundær.
        MERK: Denne protokollen presenteres for å teste en enkelt HPTM, men paneler kan etableres som inneholder mange HPTM-er konjugert til forskjellige fluoroforer.
    5. Primær antistofffarging: Tilsett 50 μL 1x permeabiliseringsbuffer med riktig konsentrasjon av primærantistoff til hver brønn. Inkuber i 30 min ved RT i mørket. Vask 2x med 200 μL 1x permeabiliseringsbuffer.
      MERK: Konsentrasjonen av antistoffer som brukes for hver HPTM er inkludert i materialfortegnelsen. Konsentrasjonen bestemmes ved å teste forskjellige konsentrasjoner av antistoffene på dyrkede celler behandlet med et stimulerende middel som ville forårsake en dramatisk økning, f.eks. en HDAC-hemmer for acetyleringsmerker og sikre at både ubehandlede og behandlede celler var godt innenfor deteksjonsområdet (over isotypekontrollen og under cytometerets maksimale deteksjonsområde). Den optimale antistoffkonsentrasjonen for HPTM bør ha en gjennomsnittlig median fluorescerende intensitet i fluoroforkanalen mellom 5 x 104 og 1 x 105.
    6. Sekundær antistofffarging: Blokk med 200 μL 1x permeabiliseringsbuffer med 2% normalt eselserum (NDS) i 10 min ved RT. Spinn i 5 min ved 500 x g ved RT og flikk for å fjerne supernatant.
    7. Tilsett 50 μL 1x permeabiliseringsbuffer med 2% NDS og riktig konsentrasjon av sekundært antistoff og inkuber i 30 minutter ved RT i mørket. Tilsett 200 μL 1x permeabiliseringsbuffer til brønner for å fortynne, sentrifuger platen i 5 minutter ved 500 x g ved RT, og flikk for å kaste supernatant. Vask celler 2x med 200 μL 1x permeabiliseringsbuffer.
      MERK: Hvis nødvendig, suspendere protokollen på dette tidspunktet. Resuspender celler i 200 μL langtidslagringsbuffer for immunceller med P200-pipette (se materialfortegnelse for anbefalinger) og oppbevar ved 4 °C i 12-24 timer, beskyttet mot lys.
    8. Forberedelse til flowcytometri: Sentrifugeplate i 5 min ved 500 x g ved RT og flikk for å kaste supernatant. Resuspendere celler i 200 μL FACS-buffer ved hjelp av en P200-pipette for flowcytometri. Forsegling med gjennomsiktig film for transport til cytometeret.
  2. Flowcytometri
    1. For å analysere det foreslåtte antistoffpanelet, sørg for at cytometeret er utstyrt med minst fire lasere, inkludert fiolett (405 nm), blå (488 nm), gul (561 nm) og rød (633 nm). Cytometeret trenger filtre for å oppdage FITC (blå-525 nm), KRO (fiolett-525 nm), PE (gul-585 nm) og APC (rød-660 nm). Legg til flere antistoffer avhengig av valgt cytometer.
    2. Kalibrering og standardisering: Ved starten av hvert eksperiment kjører du regnbuefluorescerende perler og justerer spenningen til fotomultiplikatorrøret (PMT) til dråpetoppene er sammenlignbare med målverdiene som ble kjørt for tidligere eksperimenter. Denne metoden for standardisering muliggjør innkvartering av utstyrsdrift over tid.
    3. Kompensasjon: Etter at PMT-spenningen og gevinsten er satt for forsøket, bruk antistofffangede kompensasjonsperler for å etablere kompensasjonsmatrisen for antistoffpanelet. Denne beregningen vil sikre at fluoroforene ikke bidrar til signalendringene i andre kanaler. Dette blir stadig mer nødvendig når multipleksing av flere antistoffer.
    4. Størrelse gating: I et punktplott, plott SSC-A på logg vs FSC-H på lineær. Gate ut rusk og velg for cellestørrelse ved hjelp av S1-porten. Velg for singletceller i et punktplott av FSC-W vs FSC-H og gate som S2. (Figur 4).
    5. Etablering av fluoroforporter: Bruk relevant FMO for hver fluoroforkanal, etabler portene for å bestemme hva som er et positivt signal i hver kanal ved hjelp av enkeltparameterhistogrammer (figur 4).
    6. Måling av prøvene: Registrer prøvene nøye ved hjelp av den etablerte gating-strategien. Identifiser mikroglia ved hjelp av P2RY12+ signal, bestem uttrykket av proteinet i de respektive kanalene kun for mikroglia.
  3. Dataanalyse av flowcytometri
    1. Etablering av analyseporter: Bruk trinnene ovenfor for cytometeret på brukergrensesnittet til analyseprogramvaren, bruk de samme portene som brukes til opptak for analyse.
    2. Hent MFI-verdier ved hjelp av programvare for flowcytometrianalyse (se materialtabell for anbefalinger): Rekapituler cytometergatingstrategien for strømningsanalyse. Bruk funksjonen legg til statistikk og velg median for populasjonen av interesse (f.eks. 568+) for den kompenserte kanalhøyden. Bruk tabellredigeringsprogrammet til å eksportere median fluorescerende intensitet (MFI) verdier for de respektive kanalene til et regneark for å fortsette med statistisk analyse (tabell 2).
      MERK: Tilleggsfil S1 inneholder eksempeldata fra lipopolysakkarid (LPS) og fosfatbufret saltvann (PBS) injiserte mus og en eksempelanalysefil med gatingstrategi og MFI-verdier.
    3. Analysere MFI-verdier til proteinfoldendring: Etter å ha oppnådd MFI-verdiene, beregne foldendringen av MFI i forhold til kontrollen eller den ubehandlede populasjonen (ligning 1). MFI-foldendringen reflekterer foldendringen i proteinnivået. Ved hjelp av foldeendringsverdiene vurderer du endringen i uttrykk og beregner den statistiske signifikansen ved hjelp av en t-test eller ANOVA.
      Equation 1Ligning 1

Figure 4
Figur 4: Gating strategi for protein MFI vurdering. Hendelser er inngjerdet først for cellestørrelse på SSC-A vs FSC-H (S1). Cellene blir deretter gated for singlets på FSC-H vs FSC-W (S2). Singletceller identifiseres deretter som mikroglia av P2RY12-APC-signal (APC +) med porten etablert basert på fluorescens i en APC-FMO-kontroll som inneholder et isotypekontrollantistoff. Celler blir deretter styrt for H3K27Ac-AlexaFluor568-signal på Comp-FL5-A:: Y610-mCherry. Den fluorescerende intensiteten til 610+ cellene bestemmes som en proxy for proteinuttrykk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

Voksne mus ble transkardialt perfundert og ofret for mikrogliaisolasjon. Mikroglia ble isolert på is og farget med P2RY12-APC og fiolett 525 levende døde antistoffer. Celler som ble bestemt å være positive for P2RY12 og negative for fiolett 525 levende død flekk ble sortert som levende mikroglia. Gjennomsnittlig utbytte av mikroglia fra dissekert musehjerne var 1,28 x 105 ± 0,05 (gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnitt (SEM), N = 100). Det er ingen forskjell i utbyttet av mikroglia fra hunnmus (1,25 x 105 ± 0,09 [gjennomsnitt ± SEM, N=46]) og hannmus (1,32 x 105 ± 0,07 [gjennomsnitt ± SEM, N=54]) mus (t(98)=0,6365, p=0,526). Ved isolering fra spesifikke hjerneområder er gjennomsnittlig utbytte av mikroglia fra musecortices 8,3 x 104 ± 0,08 (gjennomsnitt ± SEM, N = 15) og fra musehippocampus er 4,1 x 104 ± 0,02 (gjennomsnittlig ± SEM, N = 16). Som forventet er det en signifikant forskjell i utbyttet av mikroglia fra hver hjerneregion (F(2, 128)=25.25, P<0.0001). Etter mikrogliaisolasjon ble RNA ekstrahert fra de isolerte cellene ved hjelp av et RNA-isolasjonssett med lav inngang. Konsekvent var RNA-integritetsscore (RIN) over 9,0 (9,62 ± 0,05) og gjennomsnittlig utbytte av RNA per celle var 0,25 ± 0,01 pg (gjennomsnitt ± SEM, N = 32; Tilleggsfil S2).

Voksne mus ble intraperitonealt injisert med 1 mg/kg lipopolysakkarid (LPS) 24 timer før ofring. Musene ble transkardielt perfundert med HBSS, og mikroglia isolert fra hele hjernen i henhold til den beskrevne protokollen (figur 5A). For hver flekk ble 20.000-30.000 celler allokert til hvert panel av antistoffer. De globale nivåene av histon 3-lysin 27-acetylering (H3K27Ac) ble vurdert i isolert mikroglia via flowcytometri. For hann- og hunnmus induserte LPS-behandling økning i H3K27Ac når MFI normaliseres innen kjønn (t(6)=9,676, s<0,0001; Figur 5B). Ved undersøkelse av histogrammene for de fargede cellene forblir populasjonene normalfordelt med tilsvarende variasjon; cellene har imidlertid skiftet til økt fluorescens som resulterer i økningen i MFI (figur 5C). Ved undersøkelse av H3K9Ac i samme behandling er det en tilsvarende økning i H3K9Ac (t(6)=7,299, p=0,0003; Figur 5D,E) er imidlertid foldeendringen av LPS i forhold til PBS for H3K9Ac-signalet mindre enn H3K27Ac-signalet.

Figure 5
Figur 5: Globale endringer i histonacetylering i isolert mikroglia. (A) Mus injiseres intraperitonealt med fosfatbufret saltvann (PBS) eller 1 mg/kg lipopolysakkarid (LPS) 24 timer før ofring. Mikroglia hentes fra den immunberikede fraksjonen og fikseres for flowcytometri og global histon-posttranslasjonell modifikasjonsvurdering. Median fluorescerende intensitet vurderes som en proxy for proteinuttrykk. Laget med BioRender.com. (B) Globale nivåer av H3K27Ac økte som respons på LPS-behandling. Fold endring til PBS normalisert innen eksperiment og sex. Uparet t-test med to haler, t(6)=9,676, s<0,0001. Søylediagram viser gjennomsnittet ± SEM. N = 8 dyr; 2 per tilstand i 2 uavhengige eksperimenter. (C) Eksempel på histogrammer som viser forskyvning av H3K27Ac fluorescerende intensitet. Modal viser histogrammer fra PBS-injiserte versus LPS-injiserte mus. (D) Eksempel på histogrammer som viser forskyvning av H3K9Ac fluorescerende intensitet. Modal viser histogrammer fra PBS-injiserte versus LPS-injiserte mus. (E) Globale nivåer av H3K9Ac økte som respons på LPS-behandling. Fold endring til PBS normalisert innen eksperiment og sex. Uparet t-test med to haler, t(6)=7,299, p=0,0003. Søylediagram viser gjennomsnittet ± SEM. N = 8 dyr; 2 per tilstand i 2 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å bekrefte at den beskrevne metoden var sammenlignbar med andre tidligere brukte metoder for global histonmodifikasjonskvantifisering, hadde vi som mål å bruke immunoblot som et komparativt verktøy. Imidlertid er utbyttet fra den isolerte mikroglia ganske enkelt for lavt til å muliggjøre rimelig vurdering. Derfor brukte vi dyrkede BV2-celler for å sammenligne den intracellulære flowcytometrimetoden med en Western blot (WB). BV2-celler ble dyrket i komplette medier (DMEMF12, 10% FBS, 1x penicillin / streptamycin og 1x L-glutamin) ved 37 ° C, 5% CO2. Cellene ble passert med 0,25 % trypsin-EDTA og belagt med en tetthet på 250 000 celler/brønn og behandlet i reduserte serummedier (DMEM F12, 2 % FBS, 1x penicillin/streptamycin og 1x L-glutamin) og fikk komme seg i 12 timer ved 37 °C, 5 % CO2. Cellene ble behandlet med 25 ng/ml LPS i 24 timer før fiksasjon som beskrevet ovenfor eller lyse med WB-lysisbuffer. Signal av H3K27Ac ble utført av begge metodene med GAPDH brukt som lastekontroll for WB. Analyse av normalisert fluorescerende intensitet sammenlignet med PBS-kontrollen ble bestemt for hver gruppe (figur 6A). Ved undersøkelse av endringen i normalisert H3K27Ac-signal ved WB, var det en 1,527 ganger økning i LPS-behandlet tilstand i forhold til H2O-kontrollen som ble bestemt å være signifikant ved uparet t-test (t = 3,024, df = 5; p = 0,0293). Ved undersøkelse av endringen ved hjelp av flowcytometri var det en 1,482 ganger økning i LPS-behandlet tilstand som ble fastslått å være signifikant (t = 7,843, df = 10; s<0,0001). Ved å bruke en 2-veis ANOVA for å sammenligne metodene, ble det bestemt å være en signifikant effekt av behandlingen (F(1,15)=45,21,p<0,0001), men ikke metoden (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) eller interaksjon (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). I tillegg verifiserer vi her at det ikke er noen endring i histon H3-nivåer av både Western blot og flowcytometri da 2-veis ANOVA ikke viste noen signifikant effekt av LPS-behandlingen (F(1,7)=0,02170,p=0,8870), metoden (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) eller interaksjonen (F(1,7=0,01191, p=0,9162; Figur 6B). Eksempel på blotter og histogramforskyvninger for disse dataene vises også (figur 6C,D).

Figure 6
Figur 6: Metodesammenligning for kvantifisering av global histonmodifikasjonsendring mellom flowcytometri og western blot. (A) BV2-celler behandles med 25 ng / ml lipopolysakkarid (LPS) eller H2O i 24 timer før analyse. Den fluorescerende intensiteten til H3K27Ac er avbildet som foldeendring til kjøretøyets kontroll, fosfatbufret saltvann (PBS), for både flowcytometri og western blot. 2-veis ANOVA viste signifikant effekt av LPS-behandlingen (F(1,15)=45,21, p<0,0001), men ikke metoden (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) eller interaksjon (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Tukeys korreksjon for multippel hypotesetesting ble brukt for restene. * presenterer 0,0332, ** presenterer 0,0021. (B) Den fluorescerende intensiteten for histon H3 er avbildet som foldeendring til PBS for både flowcytometri og western blot. 2-veis ANOVA viste ingen signifikant effekt av LPS-behandlingen (F(1,7)=0,02170, p=0,8870) eller metoden (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) eller interaksjonen (F(1,7=0,01191, p=0,9162). (C) Eksempel blots og (D) flow cytometry skift er skildret. Histogramstørrelsen normaliseres til prosent basert på antall celler som er tilstede ved modusfluorescerende intensitet. Søylediagram viser gjennomsnittlig SEM. n = 2 uavhengige eksperimenter, 2 per tilstand per eksperiment. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Alt sammen viser disse resultatene at denne teknikken kan brukes til å kvantitativt vurdere de globale HPTM-nivåene i isolert mikroglia. I tillegg ble metoden vist å være sammenlignbar med tidligere teknikker, men krever mye lavere celleinnganger. I tillegg, selv om det ikke er vist, med riktig kompensasjon, kan den nåværende teknikken brukes med flere antistoffer på samme panel som vurderer forskjellige HPTM.

Tilleggsfil S1: Eksempel på analysefiler. Denne filen inneholder en wsp-analysefil og 7 fcs-filer, inkludert ingen flekk, P2RY12FMO, 568FMO, to PBS-behandlede dyr og to LPS-behandlede dyr farget med H3K27Ac. Hensikten med denne filen er å demonstrere analysen og gating på et eksperiment som kan skildre hva et vellykket eksperiment så ut. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil S2: Isolasjonsdata. Den inkluderte filen inneholder relevante data post microglia sortering som inneholder microglia og RNA utbytte fra den beskrevne protokollen. Klikk her for å laste ned denne filen.

INNGJERDET BEFOLKNING Hyppighet av foreldre Frekvens av totalt Greve
S1 89.00% 89.00% 25672
S2>S1 88.73% 78.97% 22779
APC+ > S2 > S1 76.61% 60.50% 17452
610+ > APC+ > S2 > S1 99.56% 60.24% 17376

Tabell 2: Eksempeldiagram for avstamming viser prosent- og hendelsesnumre som kreves for nøyaktig proteindeteksjon.

Discussion

Protokollen som presenteres muliggjør kvantitativ vurdering av globale HPTM-nivåer gjennom flowcytometri. Mens denne protokollen presenterer en ny metode, har tidligere studier gjort kvantitativ vurdering av proteiner ved hjelp av en lignende tilnærming26. Tidligere metoder som brukes til å vurdere globale nivåer av HPTM inkluderer immunhistokjemi og western blot 16,17,19,20. Den flowcytometribaserte metoden som presenteres er en lett kvantifiserbar metode, mens western blot og immunhistokjemi er semi-kvantitative og har lavere gjennomstrømning. Western blot er avhengig av cellelyse og krever dermed både proteinnormalisering og et lastkontrollprotein som antas å være uendret av den eksperimentelle tilstanden27. Immunhistokjemi er semikvantitativ og svært lav gjennomstrømning da det er vanskelig å kvantitativt vurdere mengden protein uten å undersøke på enkeltcellenivå16. På samme måte, for den isolerte mikroglia, er det en fordel å bruke flowcytometri-metoden på grunn av det begrensede utbyttet, da western blot krever mye større proteininngang19. Kravene til lavt cellenummer tillater at flere fargepaneler kjøres fra samme dyr.

Imidlertid, som med enhver annen metode, er det begrensninger for denne teknikken, inkludert antistoffkostnad og tilgjengelighet, da ikke alle antistoffer fungerer bra i en flowcytometri-innstilling. I tillegg, sammenlignet med immunoblot, er konsentrasjonen av antistoff som kreves mye høyere. Mens multipleksing gjør det mulig for flere antistoffer som skal brukes på samme cellepanel, kan celler ikke strippes av antistoffet etter analyse, og dermed begrense cellebruken til en per antistoffart. Dette er forskjellig fra immunoblot der samme blott kan brukes gjentatte ganger. Avhengig av tilgjengeligheten av antistoffer og antall deteksjonskanaler på et cytometer, vil det imidlertid være mulig å undersøke opptil et dusin merker samtidig.

Den nåværende metoden fanger bare globale nivåer av proteinuttrykk og ikke den spesifikke genomiske plasseringen, og endringer i globale nivåer kan ikke gjenspeile endringer ved individuelle genomiske loci. På samme måte kan mangel på endring i globale nivåer ikke bety at ingen genomiske loci gjennomgår endringer, bare at de globale endringene summen til ingen forskjeller mellom behandlinger. Som sådan er denne teknikken ment å brukes som en skjerm for å identifisere HPTM av interesse for genomisk analyse. I tillegg tillater denne metoden ikke sammenligning på tvers av forskjellige proteinmerker, bortsett fra når den vurderes som en foldeendring til kontroll. Derfor er dette begrenset sammenlignet med en standard kurvebasert metode som ELISA for proteinbestemmelse.

Protokollen som presenteres tilbyr en strategi for å isolere levende hjernemikroglia. Denne protokollen er avhengig av P2RY12-proteinuttrykk for mikrogliaisolering. P2RY12 er imidlertid en homeostatisk markør i mikroglia og kan nedreguleres i sykdomsmodeller, for eksempel 5XFAD22. Derfor, når du bruker et sykdomsmodelldyr, må du velge andre markørproteiner som TMEM119, CD11b eller CD45 for å hjelpe til med isolering av mikroglia23. På samme måte presenterer vi denne protokollen som isolasjon fra hippocampus og/eller cortex. Denne protokollen vil fungere for å isolere mikroglia fra andre hjernegrupper, inkludert hvite materieregioner, men det kan være nødvendig med flere dyr for å skaffe nok mikroglia, avhengig av størrelsen på interesseområdene.

Protokollen som presenteres kan robust isolere levende hjernemikroglia, men det er flere trinn, beskrevet nedenfor, i isolasjonsstadiet som kan redusere celleutbyttet hvis det utføres feil.

Perfusjoner for denne protokollen resulterer i en høyere prosentandel av mikroglia i det immunberikede fragmentet, noe som vil redusere tiden på sortereren. Perfusjon er imidlertid ikke nødvendig, og andre metoder for eutanasi kan brukes ved behov.

Under isolering av mikroglia bør myelin fjernes helt. Flowcytometre er avhengige av at celler kan bevege seg gjennom smale rør i raskt tempo. På grunn av sin viskositet og tendens til å klumpe seg, forårsaker myelin problemer med cytometre, noe som ofte forårsaker tresko som både kan skade utstyret og ødelegge prøven, noe som reduserer utbyttet drastisk. Vær forsiktig med å fjerne alt myelinet under innsamling av immunberikede fragmenter for å unngå problemer nedstrøms.

Platefarging versus rørfarging: I denne protokollen beskrev vi to alternativer for farging av celler i enten 1,5 ml rør eller en 96 brønnplate. Brukstilfellet for hver avhenger av eksperimentet; Imidlertid er generelt rørfarging lavere risiko for å påvirke utbyttet enn platefarging, da flikken risikerer tap av celler hvis det gjøres feil. Platefarging er mye raskere, da aspirering av supernatanten for hvert rør er tidkrevende. Før fiksering (for sortering, etc.), bruk rørfarging for å maksimere utbyttet og redusere risikoen for tap. Men for HPTM-analyse, når celler er løst for intranukleær farging, er pelleten mer stabil, og det er redusert risiko for tap med flicking.

Etablering av diskontinuerlig tetthetsgradient: Ved etablering av lagdelingen er det viktig å sette opp lagene riktig for å oppnå den immunberikede fraksjonen. Hvis lagene forstyrres eller blandes og virker uklare, vil cellene ikke sortere til ønsket plassering, og det vil være vanskelig å oppnå den immunberikede cellefraksjonen. Hvis dette skjer, spinn med tetthetsmediet for å fjerne myelin og samle deretter hele de gjenværende fraksjonene, fortynn med 3 ml FACS-buffer til 1 ml tetthetsmedium og bland godt (dette vil kreve flere rør). Spinn på 500 x g i 10 min med bremsen på 0. Kast supernatanten, og la bare ~300 μL oppløsning. Samle hele prøven og flekken. Dette vil gi redusert sorteringsprosent og høyere tidsbruk på cytometeret, men utbyttet kan likevel være sammenlignbart.

Ved bruk av isolasjonsmetoden er det fordelaktig å kunne samle celler for RNA og for HPTM-evaluering fra samme musehjerne. I denne situasjonen, etter sortering av levende mikroglia, kan celler deles for å tildele en del til RNA-evaluering (minimum inngangsantall celler for å oppnå et anstendig RNA-utbytte er 75.000 celler) og en del for videre flowcytometrianalyse (minimum 10.000 celler per brønn for god bestemmelse av MFI). I dette tilfellet er flowcytometer sortering nødvendig. Men når du bare planlegger å bruke cellene til HPTM-analyse, er sortering ikke nødvendig, og immunfraksjonen kan farges med P2RY12-antistoffet og HPTM-antistoffet. Gating på cytometeret kan da stilles inn for P2RY12 + microglia, som ville bli gjort for strømningssortering, for å analysere bare HPTM-signal i mikroglia. Eliminering av sorteringen gjør at protokollen kan være raskere og mer kostnadseffektiv. I tillegg, hvis evaluering av HPTM fra dyrkede celler, er det tilstrekkelig å starte med fargeprotokollen, og det kreves ingen cellemarkørantistoffer som vist i figur 6. HPTM-evalueringsprotokollen kan brukes til mange celletyper, inkludert dyrkede, primære og IPSC-avledede celler.

Til slutt, mens vi bare har presentert to potensielle bruksområder for mikroglia nedstrøms isolasjon, er det mange andre, inkludert epigenetiske teknikker som ChIP, CUT&Tag og CUT&RUN. Når det gjelder genomiske epigenetiske teknikker, hvor karakterisering av endringer ved spesifikke steder er av interesse, velg spesifikke hemmere for forfattere og viskelær av kromatinmerker11 skreddersydd for forsøkene for å sikre at eventuelle mikrogliale epigenetiske modifikasjoner profilert ikke er tekniske artefakter fra noen trinn i isolasjonsprosedyren som enzymatisk fordøyelse. Ved vurdering av endringer i globale nivåer av epigenetiske merker, for eksempel ved bruk av kvantitativ flowcytometri, forventes eventuelle prosedyreinduserte endringer ikke å være så store at de oppdages på globalt nivå.

Samlet sett gir de diskuterte metodene en ny, enkeltcellemetode for å kvantifisere globale nivåer av histonmodifikasjoner og andre epigenetiske endringer ved flowcytometri. Vi demonstrerte at denne metoden er tilstrekkelig følsom til å oppdage globale endringer i forsterkermarkøren H3K27ac i mikroglia som respons på LPS in vivo. Dette stemmer overens med tidligere ChIP-sekvensering av H3K27ac etter LPS-stimulering som viser dramatisk remodellering av forsterkere som reagerer på LPS28. Anvendelser av denne metoden vil tillate undersøkelse av globale epigenetiske endringer på tvers av forskjellige hjernecelletyper i utvikling og sykdom.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Takk til Yanyang Bai for å hjelpe med immunoblottet i figur 5. Dette arbeidet ble støttet av Canadian Institutes for Health Research [CRC-RS 950-232402 til AC]; Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 til AC]; Scottish Rite Charitable Foundation [21103 til AC] og Brain Canada Foundation [AWD-023132 til AC]; University of British Columbia Aboriginal Graduate Fellowship (6481 til MT); British Columbia Graduate Scholarship (6768 til MT); Canadian Open Neuroscience Platform Student Scholar Award (10901 til JK); University of British Columbia fireårig doktorgradsstipend (6569 til JK). Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5M EDTA Invitrogen AM9260G
15 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile  Falcon 352196
24-well Clear Not Treated Plates Costar 3738
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
96 Well Clear Polystyrene Microplate, clear round bottom, non treated surface Corning 3788
Acetyl Histone 3 K9 (C5B11) Cell Signalling Technology 9649S Dilution: 1:100
Acetyl Histone H4 K8 (2594) Cell Signalling Technology 2594S Dilution: 1:100
Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4) Cell Signalling Technology 8173S Dilution: 1:100
Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516) Invitrogen MA523516 Dilution: 1:100
Actinomycin D New England Biolabs 15021S
Anisomycin New England Biolabs 2222S
Anti-Histone H3 (tri methyl K4)  Abcam ab213224 Dilution: 1:100
Anti-Lactyl-Histone H4 (Lys 12) Rabbit mAb PTM Biolabs PTM-1411RM Dilution: 1:250
Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb PRM Biolabs PTM-1401RM Dilution: 1:250
Apc anti-P2RY12 Antibody, Clone: S16007D BioLegend 848006
BSA Tocris 5217
Cyto-Last Buffer BioLegend 422501
dimethylsulfoxide, sterile Cell Signalling Technology 12611S
DNAse I STEMCELL Technologies 07900
Donkey Anti Mouse AlexaFluor488 Jackson ImmunoResearch 715-546-150 Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488 ABclonal AS035 Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568 Invitrogen A10042 Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421 BioLegend 406410 Dilution: 1:500
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisherbrand 13-711-9AM
Fisherbrand Disposable PES Filter Unit, 250mL  Fisherbrand FB12566502
H3K18ac Polyclonal Antibody Invitrogen 720095 Dilution: 1:100
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14185052
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175103
Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002) Abcam ab6002 Dilution: 1:100
KONTES Dounce Tissue Grinders 125mm 7mL  VWR 885300-0007
Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb PTM BIolabs PTM-1406RM Dilution: 1:250
Lipopolysacharide  Sigma-Aldrich L5418
Normal Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
OneComp eBeads Compensation Beads Invitrogen 01-1111-41
PDS Kit, Papain Vial - Worthington Biochemical Cedarlane LK003178
Percoll Sigma-Aldrich GE17-0891-02
Phenol Red VWR RC57004
QIAshredder Qiagen  79656
Rainbow Fluorescent Particles, 1 peak (3.0-3.4 uM - Mid Range Intensity BioLegend 422905
RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Invitrogen AM12400
Rneasy Plus Micro Kit Qiagen  74034
Round Bottom Polypropylene Tubes with Caps, 5 mL Corning 352063
Triptolide New England Biolabs 97539
True Nuclear Transcription Factor Buffer Set BioLegend 424401
TruStain FcX PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody BioLegend 156604
Trypan Blue VWR 97063-702
Zombie Aqua Fixable Viability Kit BioLegend 423102

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, J. L., Grant, P. A. The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans. Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).
  2. Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  5. Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies. Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).
  6. Keiser, A. A., et al. Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice. Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367 (2021).
  7. McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).
  8. Barrett, R. M., et al. Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory. Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).
  9. Datta, M., et al. Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner. Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).
  10. Belhocine, S., et al. Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation. Glia. 70 (3), 572-589 (2022).
  11. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science (New York, N.Y.). 356 (6344), eaal3222 (2017).
  12. Kettenmann, H., Hanisch, U. -K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of Microglia. Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).
  13. Sullivan, O., Ciernia, A. V. Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011 (2022).
  14. Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Crowe, A., Yue, W. Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol. BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).
  17. Seligson, D. B., et al. Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence. Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).
  18. Liu, B., et al. Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).
  19. Pan, R. Y., et al. Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease. Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).
  20. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  21. Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. Journal of Visualized Experiments. (108), 53658 (2016).
  22. Oblak, A. L., et al. Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726 (2021).
  23. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), e70 (2019).
  24. McKinnon, K. M. Multiparameter Conventional Flow Cytometry. Flow Cytometry Protocols. 1678, 139-150 (2018).
  25. Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nature Neuroscience. 25 (3), 306-316 (2022).
  26. Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry. Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).
  27. Rumbaugh, G., Miller, C. A. Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 670, 263-274 (2011).
  28. Xavier, A. M., et al. Systematic delineation of signaling and epigenomic mechanisms underlying microglia inflammatory activity in acute and chronic brain pathologies. BioRvix. , (2022).

Tags

Kvantifisering Global Histone Post-translasjonelle modifikasjoner Intranukleær flowcytometri Isolert Mouse Brain Microglia Gene Expression Control Chromatin Structure Posttranslational Modifications Histone Tails Acetylering Lysinrester DNA-interaksjoner Transkripsjonsfaktortilgang Bromdomeneholdige transkripsjonsaktivatorer Forbedret genuttrykk Dynamisk regulering Celledifferensiering Cellulære miljøer Stimuli Neste generasjons sekvenseringsmetoder Høy Gjennomstrømning kvantitativ måling
Kvantifisering av globale histon-posttranslasjonelle modifikasjoner ved bruk av intranukleær flowcytometri i isolert musehjernemikroglia
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Towriss, M., Kim, J., Vogel Ciernia, … More

Towriss, M., Kim, J., Vogel Ciernia, A. Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia. J. Vis. Exp. (199), e65080, doi:10.3791/65080 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter