Summary
Her demonstrerer vi bruken av cellebasert elektrisk impedans (CEI) som en veldig enkel og grei metode for å studere Zika-virusinfeksjon og replikasjon i humane celler i sanntid. Videre er CEI-analysen nyttig for evaluering av antivirale forbindelser.
Abstract
Cellebasert elektrisk impedans (CEI) -teknologi måler endringer i impedans forårsaket av et voksende eller manipulert adherent cellemonolag på kulturplatebrønner innebygd med elektroder. Teknologien kan brukes til å overvåke konsekvensene av zikavirus (ZIKV) infeksjon og adherent cellereplikasjon i sanntid, da dette viruset er svært cytopatogent. Det er en enkel analyse som ikke krever bruk av etiketter eller invasive metoder, og har fordelen av å gi sanntidsdata. Kinetikken til ZIKV-infeksjon er svært avhengig av den anvendte cellelinjen, virusstammen og mangfoldet av infeksjoner (MOI), som ikke lett kan studeres med konvensjonelle endepunktanalyser. Videre kan CEI-analysen også brukes til evaluering og karakterisering av antivirale forbindelser, som også kan ha dynamiske hemmende egenskaper i løpet av infeksjonen. Denne metodeartikkelen gir en detaljert forklaring av den praktiske utførelsen av CEI-analysen og dens potensielle anvendelser i ZIKV-forskning og antiviral forskning generelt.
Introduction
Zikavirus (ZIKV) utbrudd er forbundet med alvorlige sykdomskomplikasjoner, som mikrocefali og Guillain-Barré syndrom 1,2,3. Selv om fremtidige epidemier er plausible på grunn av ulike risikofaktorer som spredning av myggvektordistribusjon og økende urbanisering, har hittil ingen vaksine eller antiviralt legemiddel kommet på markedet ennå 3,4. Derfor bør tradisjonelle ZIKV-forskningsmetoder suppleres med nye verktøy for å studere dette viruset og dets potensielle antivirale forbindelser. Antiviral forskning er ofte basert på fenotypiske analyser, hvor endepunktet er tilstedeværelsen av en spesifikk parameter, for eksempel utseendet til en virusindusert cytopatisk effekt (CPE) eller produksjon av et bestemt virusindusert protein ved hjelp av et reportergen 5,6,7. Disse metodene har imidlertid endepunktavlesninger, er arbeidskrevende og kan kreve komplisert analyse. Derfor er impedansbaserte metoder et attraktivt alternativ.
Cellebasert elektrisk impedans (CEI) er definert som motstanden mot strømstrøm fra en elektrode til en annen, forårsaket av et adherent cellelag sådd på elektrodeholdige brønner. Den etablerte CEI-teknologien som brukes i denne metodikken er Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS), opprinnelig utviklet av Giaever og Keese 8,9. Dette brukes i et bredt felt av biologiske forskningsdomener, som kreftmetastase, toksikologi og sårheling10,11,12. Prinsippet er avhengig av et elektrisk felt som genereres ved kontinuerlig feiing av vekselstrøm (AC) spenninger over en rekke frekvenser13. Cellene eksponeres for disse ikke-invasive elektriske feltene, og med forhåndsbestemte intervaller måles impedansendringene forårsaket av cellevekst eller endringer i celleadherens eller morfologi14. Videre fører endret cellelevedyktighet også til impedansendringer, noe som gjør teknologien til et nyttig verktøy for å overvåke infeksjon med cytopatogene virus15,16,17. Siden morfologiske endringer i cellelaget vil bli oppdaget på nanoskalaområdet, tilbyr teknologien et svært følsomt deteksjonsverktøy. CEI-analysen beskrevet i denne artikkelen er en enkel, ikke-invasiv, sanntids, etikettfri metode for å måle impedansendringene i cellelaget over tid.
Selv om CEI ikke har blitt brukt til å evaluere løpet av ZIKV-infeksjon eller dets potensielle antivirale midler, har bruken som et diagnostisk verktøy blitt undersøkt før18. I en nylig studie ble bruken av CEI-analysen for å bestemme den antivirale aktiviteten til flere ZIKV-hemmere i A549-celler validert for første gang19. Denne metodeartikkelen beskriver denne CEI-analysen mer detaljert og utvider den til forskjellige adherente cellelinjer, samt en rekke ZIKV-stammer ved forskjellige infeksjonsmultiplikasjoner (MOI). Herved demonstreres allsidig bruk av denne metoden i flavivirus antiviral forskning. Metoden har den avgjørende fordelen med sanntids celleovervåking, som gjør det mulig å oppdage viktige infeksjonstidspunkter og den dynamiske hemmende aktiviteten av potensielle antivirale forbindelser. Samlet sett tilbyr CEI-teknologien et kraftig og verdifullt verktøy for å utfylle dagens spekter av antivirale metoder.
Protocol
Alle beskrevne trinn utføres under sterile forhold i et laminært strømningsskap i et biosikkerhetsnivå 2-laboratorium. Alle brukte virus ble oppnådd og brukt som godkjent, i henhold til reglene til en belgisk institusjonell gjennomgangsnemnd (Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, protokoll SBB 219 2011/0011) og Biosafety Committee ved KU Leuven.
1. Vedlikehold av cellekultur
MERK: Denne protokollen utføres med et utvalg av cellelinjer, men kan selvfølgelig tilpasses enhver adherent cellelinje, og krever bare optimalisering av cellesåingstetthet.
- Dyrk A549 humant lungeadenokarsinomcellelinje, U87 humant malignt glioblastomcellelinje og HEL 299 humane embryonale lungefibroblastceller i T75 kulturflasker ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktet inkubator.
- Subkultur cellene ved 80% -95% samløp. Alle reagenser bør være ved romtemperatur (RT) før dyrking av cellene.
- Fjern det kondisjonerte kulturmediet fra cellene. Bruk 5 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) til å vaske cellemonolaget én gang.
- Fordel 1 ml 0,25% trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) jevnt over cellemonolaget. Deretter ruges det i opptil 3 minutter ved 37 °C til cellene begynner å løsne.
- Tilsett 9 ml friskt komplett vekstmedium (se Materialfortegnelse for detaljer). Rør forsiktig opp og ned for å resuspendere cellene.
- Overfør ønsket volum cellesuspensjon til en ny T75 kulturkolbe og tilsett et passende volum friskt vekstmedium for å oppnå et totalvolum på 15 ml.
MERK: In vitro-cellelinjene som brukes i denne protokollen er subkulturert i fortynninger på 1:4 til 1:10, avhengig av den spesifikke cellelinjen, for å muliggjøre ideelle vekstbetingelser. Subkulturer utføres hver 3-4 dager, slik at ønsket cellesuspensjonsvolum også kan variere basert på antall inkubasjonsdager.
2. Forberedelse av CEI-plate
- Ta en 96-brønns plate med interdigiterte elektroder (se materialtabell) og fyll alle brønnene med 100 μL vekstkulturmedium.
- Fyll mellomrommene mellom brønnene med DPBS.
MERK: Dette gjøres for å redusere kanteffekten på grunn av fordampning som observeres ved dyrking av celler i 96-brønnsplater. - Inkuber platen i 4 timer ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO2.
3. Såing av celler
- Løsne cellene fra dyrkningskolben, som beskrevet i avsnitt 1, og resuspender dem i friskt vekstmedium i et 50 ml rør.
- Telle antall levedyktige celler ved hjelp av den valgte metoden.
MERK: Når det gjelder A549-celler, når levedyktigheten vanligvis ~ 100%. For å bestemme celletallet bruker vi et automatisert celleanalysesystem basert på farging av appelsin/propidiumjodid (se materialtabell). Andre celletellingsmetoder fungerer like bra. - Resuspender cellene i friskt vekstmedium for å oppnå ønsket celletetthet. I denne studien er den optimale A549-celletettheten 0,15 × 106 (levedyktige) celler / ml.
- Ta 96-brønnplaten med interdigiterte elektroder ut av inkubatoren og fjern mediet med en flerkanalspipett.
- Dispenser 100 μL av cellesuspensjonen (tilsvarende 15 × 103 celler i dette tilfellet) per brønn i 96-brønnplaten.
- La cellene balansere i 15 minutter ved romtemperatur før du plasserer dem i CEI-enheten.
4. Sette opp og kjøre CEI-analysen
- Plasser inkubatoren som huser CEI-enhetens plateholder ved 37 ° C og 5% CO2.
- Plasser platen med 96 brønner i enheten.
- Åpne enhetens programvare, og konfigurer et nytt eksperiment ved å klikke Oppsett i ruten Samle inn data. Vent til den bærbare datamaskinen kobles til ECIS-enheten og konfigurer platen ved å kontrollere brønnens impedanser. Kontroller om alle brønnene er riktig konfigurert, som indikert med grønn farge. Hvis ikke, gjenta trinn 4.2 til alle brønnene er grønne.
- I ruten Brønnkonfigurasjon velger du matrisetypen i henhold til kulturvaren som brukes.
- Velg modusen Flere frekvenser/tider.
MERK: I denne modusen måler enheten impedansendringer ved en rekke frekvenser. - Start målingen ved å klikke Start.
MERK: Sanntidsimpedansen kan overvåkes på programvarens grensesnitt. Velg ønsket frekvens som skal vises. I dette eksemplet velges 16 kHz.
5. Sammensatt forberedelse og inkubasjon
MERK: Som et eksempel på en antiviral forbindelse brukes labyrinthopeptin A1 (se materialfortegnelse). Siden denne protokollen kan generaliseres til alle forbindelser med potensiell antiviral aktivitet, refererer vi til den som 'forbindelsen'.
- Tillat komplett cellekulturmedium uten tilsetning av føtalt bovint serum (FBS) (referert til som "analysebuffer") for å likevekte ved RT.
- Hold forbindelsene på is.
- Forbered en 10x konsentrert fortynning av hver forbindelse i analysemedium i 5 ml polypropylenrør.
- Seriell fortynn forbindelsene i analysemedium i 5 ml polypropylenrør for å oppnå de ønskede 10x konsentrasjoner.
- Stans CEI-enheten midlertidig ved å klikke Pause i ruten Datainnsamlingsoppsett. Vent til gjeldende tidspunkt er fullført og ta ut 96-brønnplaten.
- Bekreft adherens og monolagsdannelse av cellene under et lysmikroskop.
- Fjern 20 μL fra hver brønn med en flerkanalspiper.
- Tilsett 20 μL sammensatt løsning eller kjøretøy i de ønskede brønnene. Forbered et oppsett med de spesifikke betingelsene for riktig pipettering.
- Inkuber platen i 15 minutter ved 37 °C med 5 % CO2.
MERK: En vanlig celleinkubator brukes til dette inkubasjonstrinnet i stedet for en CEI-enhet. Cellekontrollbrønner (CC) er kjøretøybehandlede brønner.
6. Virusforberedelse og infeksjon
- Tine et hetteglass med viruslager. I dette eksemplet brukes ZIKV MR766 og ZIKV PRVABC59.
- Forbered virusfortynninger ved ønsket MOI eller fortynninger i analysemedium i et 15 ml polypropylenrør.
MERK: I dette representative eksemplet brukes MOI 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.005 og 0.00005. - Tilsett 100 μL virusfortynning i de tildelte brønnene på 96-brønnplaten. Tilsett analysemedium til CC-brønnene.
- Dekontaminere de brukte virusbeholderne.
- Sett platen tilbake i CEI-enheten, og fortsett målingene i 6 påfølgende dager ved å klikke på Fortsett eksperiment.
MERK: Viruskontrollbrønner (VC) er kjøretøybehandlede infiserte celler, mens i CC-brønner tilsettes analysemedium i stedet for virusfortynning. Hvis cytotoksisiteten av forbindelsene vurderes, tilsett 100 μL analysebuffer i stedet for virusfortynning.
7. Dataanalyse
- Avslutt eksperimentet ved å klikke på Fullfør , og legg til valgfrie sammendragskommentarer, for eksempel informasjon om de spesifikke eksperimentelle forholdene i vinduet som vises. Klikk OK når datainnsamlingen er fullført.
- Velg ønsket frekvens i Graf-ruten der den største impedansforskjellen mellom CC og VC måles på slutten av eksperimentet.
- For å bestemme den beste frekvensen, kjør et piloteksperiment med uinfiserte og infiserte celler og velg frekvensen som - på det tidspunktet hvor impedansen til de infiserte cellene har falt til grunnlinjenivået - fører til den største observerte impedansforskjellen mellom de uinfiserte og infiserte cellene. Når det gjelder A549-celler infisert med ZIKV, er dette 16 kHz.
- Hvis du vil eksportere alle dataene i regnearkformat, kontrollerer du at alle brønnene er valgt i ruten Brønnkonfigurasjon og klikker på Fil | Eksportere data | Grafdata.
- Normaliser dataene ved å trekke den gjennomsnittlige VC-impedansverdien målt på slutten av eksperimentet fra alle datapunktene og dividere dette med den gjennomsnittlige CC-impedansverdien for det siste tidspunktet målt før infeksjon.
- Plott de normaliserte dataene i tidsfunksjonen for å oppnå CEI-profilgrafer.
- Beregn det normaliserte området under kurven (AUCn) for hver tilstand for å bestemme parametere som 50% hemmende konsentrasjoner (IC50).
- Beregn andre nyttige parametere, for eksempel CIT50, for eksempel å sammenligne smittsomheten til ulike virusstammer.
Representative Results
I denne artikkelen er bruken av CEI-analysen i ZIKV-forskning beskrevet i detalj. Arbeidsflyten til denne analysen er illustrert i figur 1. Vi demonstrerer bekvemmeligheten av sanntidsovervåking av ZIKV-infeksjon i en ønsket celletype, samt evaluering av infeksjonshemming av en antiviral forbindelse. Som et antiviralt eksempel bruker vi det godt beskrevne peptidet labyrinthopeptin A1 (Laby A1); Vi refererer til dette som 'forbindelsen', siden dens spesifikke egenskaper er utenfor omfanget av denne metodeartikkelen og diskuteres andre steder20,21. Det er verdt å merke seg at reproduserbarheten av metoden ikke er diskutert i resultatdelen, siden vi ønsker å fokusere på de individuelle impedansprofilene oppnådd ved hjelp av metodikken. Dette er imidlertid beskrevet tidligere19.
I det første settet med eksperimenter demonstrerer vi viktigheten av optimalisering av celletetthet når vi utfører CEI-infeksjonsanalyser (figur 2). Når for mange celler blir sådd, vil cellemonolaget ha vokst fullt ut og ikke kunne spre seg videre over CEI-elektrodene. Dette fører til en mindre forskjell mellom CC og VC, og dermed en lavere oppløsning, noe som reduserer deteksjonsvinduet for antiviral aktivitet. Dette er godt eksemplifisert i figur 2E. For visse større celletyper, for eksempel U87-celler, kan såceller for tett til og med føre til fullstendig løsrivelse av cellemonolaget når man manipulerer platen, som vist her (figur 2F). Dette observeres også mikroskopisk.
Figur 2 viser også at analysen er svært nyttig for å utføre cellefølsomhetsstudier. Det fremgår av figur 2A,B at infeksjonskinetikken er svært avhengig av celletype. Figur 2C viser at U87-celler bare er utsatt for ZIKV-infeksjon ved høye MOIer.
I det andre settet av eksperimenter er den allsidige bruken av CEI-infeksjonsanalysen fremhevet ved bruk av forskjellige ZIKV-stammer ved forskjellige MOIer og i nærvær av en godt beskrevet antiviral forbindelse (figur 3). Disse eksperimentene er utført med A549-celler, en modell som vanligvis brukes i flavivirusforskning22,23. Denne cellelinjen har også blitt brukt i andre studier som har vist sin egnethet i CEI-analyser24. For det første sammenlignes infeksjonskinetikken til en representativ ZIKV-stamme av den afrikanske avstamningen MR766 med den asiatiske avstamningen PRVABC59. Figur 3A viser at begge stammene har sammenlignbare CEI-mønstre, med PRVABC59 som har litt langsommere CPE-induserende egenskaper. Dette gjenspeiles også av CIT50-verdiene (figur 3B). Denne interessante parameteren ble først introdusert av Fang et al.16 og tar hensyn til kinetikken til CEI-målinger. Det er definert som tiden det tar å redusere impedansen med 50% sammenlignet med cellekontrollen.
Deretter ble cellene infisert med tre forskjellige MOIer av enten ZIKV MR766 eller PRVABC59, i nærvær eller fravær av forskjellige forbindelseskonsentrasjoner, og impedansprofilene ble overvåket. Som det fremgår av figur 3C-H, hemmer eller forsinker visse konsentrasjoner impedansfallet forårsaket av ZIKV-infeksjon. Dette gjenspeiles også når AUC-verdiene beregnes. CEI-analyseresultatene viser også visuelt at den antivirale aktiviteten avhenger av MOI og tidspunktet for potensevaluering. AUCn beregninger kan brukes til å bestemme IC50-verdier, som vist i figur 3I. Endelig viser figur 3H at CIT50-verdier også kan brukes til å bestemme og sammenligne sammensatte potenser. Inaktive forbindelser eller sammensatte konsentrasjoner er karakterisert ved CEI-profiler, AUC og CIT50-verdier som er sammenlignbare med VC.
Figur 1: Skjematisk oversikt over analysens arbeidsflyt. Tidslinjen og forskjellige håndterings- og inkubasjonstrinn i CEI-analysen er avbildet her. Forkortelser: CEI = cellebasert elektrisk impedans; ZIKV = Zika-virus; D = dager. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Normaliserte CEI-profiler av ZIKV-infiserte celler ved forskjellige tettheter. (A,D) A549, (B,E) HEL 299 eller (C,F) U87-celler ble sådd ved (A-C) 15.000-20.000 ("optimal") eller (D-F) 75.000 ("suboptimale") celler per brønn i en 96-brønns CEI-plate. Etter 24 timers impedansovervåking ble cellene infisert med ti ganger MOI-fortynning av ZIKV MR766. Impedansen ble ytterligere overvåket i 5 påfølgende dager. CEI-profiler (gjennomsnittlig ± område av to tekniske replikater) for et representativt eksperiment vises. Forkortelser: CEI = cellebasert elektrisk impedans; MOI = mangfold av infeksjon; ZIKV = Zika-virus; Norm = normalisert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Normaliserte CEI-profiler av A549-celler etter infeksjon med to ZIKV-stammer og hemming av en antiviral forbindelse. (A) Adherente A549-celler ble infisert med forskjellige MOIer av enten ZIKV MR766 eller ZIKV PRVABC59, og impedansen ble overvåket kontinuerlig. Gjennomsnittlig ± SD av tre tekniske replikater av et representativt eksperiment vises. (B) CIT50-verdier ble beregnet basert på CEI-profilen til A og sammenlignet. Gjennomsnittlig ± SD av tre tekniske replikater utført vises. (VG Nett) Adherente A549-celler ble behandlet med forskjellige forbindelseskonsentrasjoner og deretter infisert med en spesifikk MOI av enten ZIKV MR766 (C-E) eller ZIKV PRVABC59 (F-H). Impedansen ble overvåket kontinuerlig. Gjennomsnittlig ± område av to tekniske replikater av et representativt eksperiment vises. (I) For å sammenligne forbindelseshemming mot forskjellige ZIKV-stammer og fortynninger ble AUC n beregnet, og hemmende prosentandeler ble bestemt ved å subtrahere alle tilstander med CC AUC n og dividere med VC AUC n. (J) CIT50-verdiene av eksperimentet vist i C-H ble beregnet for å sammenligne de forskjellige ZIKV-stammene og MOI. Gjennomsnittlig ± rekkevidde av to tekniske replikater vises. Forkortelser: CEI = cellebasert elektrisk impedans; MOI = mangfold av infeksjon; ZIKV = Zika-virus; Norm = normalisert; CIT 50 = tid da impedansen ble redusert med50 % i forhold til ubehandlet kontroll; AUC = areal under kurven; CC = cellekontroll; VC = viruskontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne artikkelen beskriver bruken av CEI-analysen i ZIKV antiviral forskning. Analysen har fordelen av sanntidsovervåking og kan derfor brukes til å evaluere kinetikken til ZIKV-infeksjon og antiviral inhibering med selektive forbindelser. Dataene oppnådd med denne metoden tillater en objektiv og visuell observasjon av virusindusert CPE og styrken av en potensiell antiviral forbindelse.
Siden CEI er en svært følsom metode, må det utvises stor forsiktighet når du utfører denne cellulære analysen. Det er avgjørende at nøyaktig pipettering utføres for å unngå pipetteringsvariasjon så mye som mulig. Videre må andre faktorer som kan påvirke eksperimentelle resultater, for eksempel cellenummer og brukt viruslager, holdes konstant mellom eksperimentrepetisjoner. Dette er faktorer som i stor grad påvirker kinetikken til cellevekst og infeksjon og kan derfor føre til variasjon i beregnede CIT50-verdier og/eller andre parametere.
Når du utfører CEI-analysen i nærvær av (potensielle) antivirale forbindelser, er det viktig å avgjøre om de påvirker impedansen til cellene i fravær av et virus. Teknikken er så følsom at impedansendringer kan måles godt under forbindelsens cytotoksiske konsentrasjoner19.
Selv om bare ZIKV-data er vist i denne artikkelen, kan analysen enkelt brukes på andre cytopatogene (flavi) virus, med bare minimal optimaliseringsinnsats, for eksempel optimal CEI-overvåkingsfrekvensbestemmelse. Tilpasninger av CEI-analysen har blitt brukt med forskjellige humane og dyrevirus, som chikungunya, influensa A og humane og hesteherpesvirus25,26,27,28. Her brukes den også som en enkel metode for kvantifisering av virale titere eller for identifisering av antivirale forbindelser. Disse studiene brukte sanntids celleanalyse, en alternativ CEI-metode.
Bruken av CEI-teknologien er begrenset til adherente celletyper, da analysens prinsipp er avhengig av egenskapene til adherente celler for å spre seg over de elektrodeinnebygde brønnene. Godt overflatebelegg som fibronektin kan brukes til å forbedre cellevedlegg29. Metoden har noen andre ulemper, den første relatert til kostnadene. Bortsett fra investeringen i CEI-overvåkingsenheten og tilhørende hard- og programvare, er forbruksvarene også noe dyre. Videre, siden protokollen krever overvåking av virusinfeksjon i flere dager, kan en 96-brønnplate per uke evalueres. Sammen med de høye kostnadene begrenser dette bruken til innstillinger med lav til middels gjennomstrømming.
På grunn av disse gjennomstrømningsproblemene er teknologien uegnet for antivirale screeninginnstillinger. Det er imidlertid svært tiltalende i innledende eksperimentelle faser, for eksempel når man vurderer cellefølsomhet for studiet av ZIKV-infeksjon i en bestemt sykdomsrelatert setting. Teknologien er også nyttig med transfekterte eller knockout-cellelinjer for enkelt å observere endringer i infeksjonskinetikk, for eksempel i nærvær eller fravær av visse inngangsreseptorer. Dette er interessant når man undersøker involvering av cellulære faktorer i ZIKV-infeksjon. Videre, i senere prekliniske faser, når en bestemt lederkandidat er valgt, kan CEI-analysen brukes til ytterligere grundig karakterisering av en valgt forbindelse. CEI-biosensorer kan også modifiseres ved å immobilisere visse biogjenkjenningselementer, for eksempel virusspesifikke antistoffer, for påvisning av virus18. Til sammen fremhever dette den allsidige bruken av CEI i en virologiinnstilling.
Disclosures
Forfatterne bekrefter at det ikke er noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Clément Heymann og Gorrit Lootsma for korrekturlesing av manuskriptet. Studien ble støttet av interne tilskudd fra laboratoriet for virologi og kjemoterapi (Rega Institute, KU Leuven).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-185 | These cells are cultured in MEM Rega-3 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.075% sodium bicarbonate. |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Live/dead stain |
| Cellstar polypropylene tubes, 15 mL | Greiner bio-one | 1,88,271 | |
| Cellstar polypropylene tubes, 50 mL | Greiner bio-one | 2,27,261 | |
| Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 41965-039 | Cell culture medium for U87 and HEL 299 cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| ECIS cultureware 96W20idf | Applied BioPhysics | 96W20idf PET | Assay plate for CEI device |
| Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array station | Applied BioPhysics | CEI device, including 96 well station, external control module and laptop with control, acquisition and display software. The necessary software is installed before shipment. NOTE: this device is currently out of production and has been replaced by the more advanced ECIS Z-Theta device | |
| Falcon polystyrene tubes, 5 mL | Corning | 352054 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SV30160.03 | Cell culture medium additive for all used cells |
| HEL 299 cells | ATCC | CCL-137 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| HEPES buffer, 1 M | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | Cell culture medium additive for U87 cells |
| Labyrinthopeptin A1 | Kind gift from Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlin, Germany | Antiviral compound used as an example in this protocol. It is dissolved in DMSO. | |
| L-Glutamine, 200 mM | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Luna cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | |
| Luna-FL dual fluoresence cell counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell viability counter |
| Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 19993013 | Cell culture medium for A549 cells |
| Sodium Bicarbonate, 7.5% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25080-060 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Tissue culture flask T75 | TPP | Y9076 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | Dissociation reagent |
| U87 cells | ATCC | HTB-14 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| Virkon Rely+On tablets | Lanxess | 115-0020 | Disinfectant sollution |
| Zika virus (ZIKV) MR766 | ATCC | VR-84 | ZIKV prototype strain, isolated from sentinel Rhesus monkey in Uganda in 1968 |
| ZIKV PRVABC59 | ATCC | VR-1843 | ZIKV strain isolated from patient in Puerto Rico in 2015 |
References
- Cao-Lormeau, V. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika virus associated with microcephaly. The New England. Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
- Pierson, T. C., Diamond, M. S. The emergence of Zika virus and its new clinical syndromes. Nature. 560 (7720), 573-581 (2018).
- Pergolizzi, J., et al. The Zika virus: Lurking behind the COVID-19 pandemic. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 46 (2), 267-276 (2021).
- Bernatchez, J. A., et al. Development and validation of a phenotypic high-content imaging assay for assessing the antiviral activity of small-molecule inhibitors targeting Zika virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), e00725 (2018).
- Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
- Mottin, M., et al. Discovery of new Zika protease and polymerase inhibitors through the open science collaboration Project OpenZika. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (24), 6825-6843 (2022).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (50), e2792 (2011).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Li, X., et al. Hsp70 suppresses mitochondrial reactive oxygen species and preserves pulmonary microvascular barrier integrity following exposure to bacterial toxins. Frontiers in Immunology. 9, 1309 (2018).
- Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors and Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Pennington, M. R., Van de Walle, G. R. Electric cell-substrate impedance sensing to monitor viral growth and study cellular responses to infection with alphaherpesviruses in real time. mSphere. 2 (2), e00039 (2017).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- McCoy, M. H., Wang, E. Use of electric cell-substrate impedance sensing as a tool for quantifying cytopathic effect in influenza a virus infected MDCK cells in real-time. Journal of Virological Methods. 130 (1-2), 157-161 (2005).
- Stukovnik, Z., Bren, U. Recent developments in electrochemical-impedimetric biosensors for virus detection. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 15922 (2022).
- Oeyen, M., Meyen, E., Doijen, J., Schols, D. In-depth characterization of Zika virus inhibitors using cell-based electrical impedance. Microbiology Spectrum. 10 (4), e0049122 (2022).
- Prochnow, H., et al. Labyrinthopeptins exert broad-spectrum antiviral activity through lipid-binding-mediated virolysis. Journal of Virology. 94 (2), e01471 (2020).
- Oeyen, M., et al. Labyrinthopeptin A1 inhibits dengue and Zika virus infection by interfering with the viral phospholipid membrane. Virology. 562, 74-86 (2021).
- Vicenti, I., et al. Comparative analysis of different cell systems for Zika virus (ZIKV) propagation and evaluation of anti-ZIKV compounds in vitro. Virus Research. 244, 64-70 (2018).
- Gobillot, T. A., Humes, D., Sharma, A., Kikawa, C., Overbaugh, J. The robust restriction of Zika virus by type-I interferon in A549 cells varies by viral lineage and is not determined by IFITM3. Viruses. 12 (5), 503 (2020).
- Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137 (2012).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e61133 (2021).
- Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
- Zandi, K. A real-time cell analyzing assay for identification of novel antiviral compounds against chikungunya virus. Methods in Molecular Biology. 1426, 255-262 (2016).
- Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126 (2022).
