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Biochemistry

प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी के लिए क्रिस्टल हिट प्राप्त करने के लिए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/65211
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1National High-Throughput Crystallization Center, Hauptman-Woodward Medical Research Institute, 2Department of Biochemistry, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, The State University of New York

Summary

यह प्रोटोकॉल उच्च-थ्रूपुट क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग का विवरण देता है, जिसमें 1,536 माइक्रोसेप्लेट तैयारी से लेकर 6 सप्ताह की प्रयोगात्मक समय विंडो के अंत तक शामिल है। नमूना सेटअप, प्राप्त इमेजिंग के बारे में विवरण शामिल हैं, और उपयोगकर्ता मैक्रोमोलेक्यूलर क्रिस्टलीकरण स्थितियों को जल्दी और कुशलता से पहचानने के लिए कृत्रिम बुद्धि-सक्षम ग्राफिकल यूजर इंटरफेस का उपयोग करके विश्लेषण कैसे कर सकते हैं।

Abstract

एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी मैक्रोमोलेक्यूलर संरचनाओं को समझने के लिए सबसे अधिक नियोजित तकनीक है, लेकिन विवर्तन के लिए एक व्यवस्थित जाली में प्रोटीन को क्रिस्टलीकृत करने का महत्वपूर्ण कदम चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। बायोमोलेक्यूल्स के क्रिस्टलीकरण को काफी हद तक प्रयोगात्मक रूप से परिभाषित किया गया है, और यह प्रक्रिया संसाधन-सीमित संस्थानों में शोधकर्ताओं के लिए श्रम-गहन और निषेधात्मक हो सकती है। राष्ट्रीय उच्च-थ्रूपुट क्रिस्टलीकरण (एचटीएक्स) केंद्र में, क्रिस्टल विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकों को लागू किया गया है, जिसमें एक स्वचालित उच्च-थ्रूपुट 1,536-अच्छी तरह से माइक्रोबैच-अंडर-ऑयल प्लेट सेटअप शामिल है जो क्रिस्टलीकरण मापदंडों की एक विस्तृत चौड़ाई का नमूना लेने के लिए डिज़ाइन किया गया है। क्रिस्टल विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के साथ-साथ मूल्यवान क्रिस्टल हिट को सटीक रूप से अलग करने के लिए 6 सप्ताह के दौरान अत्याधुनिक इमेजिंग तौर-तरीकों का उपयोग करके प्लेटों की निगरानी की जाती है। इसके अलावा, क्रिस्टल हिट की पहचान करने के लिए एक प्रशिक्षित कृत्रिम बुद्धिमत्ता स्कोरिंग एल्गोरिदम का कार्यान्वयन, प्रयोगात्मक छवियों को देखने के लिए एक ओपन-सोर्स, उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफेस के साथ मिलकर, क्रिस्टल विकास छवियों का विश्लेषण करने की प्रक्रिया को सुव्यवस्थित करता है। यहां, कॉकटेल और क्रिस्टलीकरण प्लेटों की तैयारी, प्लेटों की इमेजिंग और हिट की पहचान करने के लिए प्रमुख प्रक्रियाओं और इंस्ट्रूमेंटेशन का वर्णन किया गया है जो प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करता है और सफल क्रिस्टलीकरण की संभावना को बढ़ाता है।

Introduction

संरचनात्मक जीव विज्ञान विधियों में जबरदस्त प्रगति के युग में भी, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी मैक्रोमोलेक्यूल्स के उच्च गुणवत्ता वाले संरचनात्मक मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक भरोसेमंद और लोकप्रिय तरीका है। प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) में जमा किए गए सभी त्रि-आयामी संरचनात्मक मॉडलों में से 85% से अधिक क्रिस्टल-आधारित संरचनात्मक विधियों (जनवरी, 2023 तक) से हैं। इसके अलावा, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी प्रोटीन-लिगैंड संरचनाओं को हल करने के लिए अपरिहार्य बनी हुई है, जो दवा की खोज और विकास प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटकहै। प्रोटीन क्रिस्टलीकरण आधी सदी से अधिक समय तक प्रमुख संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीक बने रहने के बावजूद, भौतिक गुणों3 या अनुक्रम 4,5 के आधार पर क्रिस्टलीकरण की संभावना की भविष्यवाणी करने के तरीके अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में हैं।

क्रिस्टलीकरण की स्थिति की भविष्यवाणी और भी अस्पष्ट है; मॉडल प्रोटीन 6,7 के लिए भी संभावित क्रिस्टलीकरण स्थितियों की भविष्यवाणी करने के लिए सीमित प्रगति की गई है। अन्य अध्ययनों ने प्रोटीन होमोलॉजी और पीडीबी 8,9,10 से खनन की गई स्थितियों के आधार पर क्रिस्टलीकरण स्थितियों की पहचान करने का प्रयास किया है। पीडीबी में पाई जाने वाली भविष्यवाणी शक्ति सीमित है, हालांकि, केवल अंतिम, सफल क्रिस्टलीकरण की स्थिति जमा की जाती है, जो आवश्यकता से, क्रिस्टल विकास को ठीक करने के लिए आवश्यक अक्सर व्यापक अनुकूलन प्रयोगों को याद करती है। इसके अलावा, कई पीडीबी प्रविष्टियों में इन विवरणों वाले मेटाडेटा की कमी होती है, जिसमें कॉकटेल सूत्र, क्रिस्टलीकरण प्रारूप, तापमान और11,12 को क्रिस्टलीकृत करने का समय शामिल है। इसलिए, रुचि के कई प्रोटीनों के लिए, क्रिस्टलीकरण स्थितियों को निर्धारित करने का सबसे सुलभ तरीका प्रयोगात्मक रूप से रासायनिक संभावनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में जितना संभव हो उतनी स्थितियों का उपयोग करना है।

क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग को यथासंभव फलदायी और संपूर्ण बनाने के लिए कई दृष्टिकोणों का बहुत प्रभाव से पता लगाया गया है, जिसमें विरल मैट्रिक्स 13, अपूर्ण फैक्टोरियल स्क्रीनिंग 14, एडिटिव्स 15,16, सीडिंग 17 और न्यूक्लिटिंग एजेंट 18 शामिल हैं। हप्टमैन-वुडवर्ड मेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट (एचडब्ल्यूआई) में राष्ट्रीय एचटीएक्स सेंटर ने माइक्रोबैच-अंडर-ऑयल दृष्टिकोण19 का उपयोग करके क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग के लिए एक कुशल पाइपलाइन विकसित की है, जो तुलनात्मक रूप से न्यूनतम नमूना और कॉकटेल वॉल्यूम का उपयोग करके प्रारंभिक क्रिस्टलीकरण स्थितियों की पहचान को कारगर बनाने के लिए स्वचालित तरल हैंडलिंग और इमेजिंग तौर-तरीकों का उपयोग करता है (चित्रा 1). 1,536 अद्वितीय कॉकटेल का सेट प्रोटीन क्रिस्टल विकास के लिए अनुकूल होने के लिए पहले से निर्धारित स्थितियों पर आधारित है और संभावित क्रिस्टलीकरण स्थितियों20,21,22 की एक बड़ी श्रृंखला का नमूना लेने के लिए रासायनिक रूप से विविध होने के लिए डिज़ाइन किया गया है। क्रिस्टलीकरण स्थितियों के व्यापक नमूने से एक या अधिक क्रिस्टलीकरण लीड को देखने की संभावना बढ़ जाती है।

स्क्रीनिंग के लिए कितनी शर्तों की आवश्यकता है, इसके कुछ औपचारिक विश्लेषण साहित्य में दिखाई दिए हैं। एक अध्ययन ने विभिन्न स्क्रीन के नमूना लेआउट पर ध्यान केंद्रित किया और पाया कि घटकों के यादृच्छिक नमूने (एक अपूर्ण फैक्टोरियल के समान) ने सबसे गहन और कुशल नमूना करण विधि23 का प्रतिनिधित्व किया। स्क्रीनिंग के एक अन्य अध्ययन में कहा गया है कि ऐसे कई उदाहरण हैं जब 1,536 स्क्रीन ने केवल एक क्रिस्टल हिट24 का उत्पादन किया है, और हाल के एक अध्ययन में इस बात पर प्रकाश डाला गया है कि अधिकांश वाणिज्यिक स्क्रीन क्रिस्टलीकरण स्थान को कम आंकते हैं जिसे स्क्रीनिंगहिट 25 से जुड़ा माना जाता है। क्रिस्टल, विवर्तन सीमाओं, या क्रिस्टल दोषों के भीतर अंतर्निहित विकार के कारण सभी क्रिस्टलीकरण लीड डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल उत्पन्न नहीं करेंगे; इसलिए, स्थितियों के लिए एक व्यापक जाल डालने से अनुकूलन के लिए वैकल्पिक क्रिस्टल रूप प्रदान करने का अतिरिक्त लाभ होता है।

प्रोटीन क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के प्रारूप का भी स्क्रीन की सफलता पर प्रभाव पड़ता है। वाष्प प्रसार उच्च-थ्रूपुट क्रिस्टलीकरण अनुप्रयोगों के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला सेटअप है और इसका उपयोग अत्याधुनिक क्रिस्टलीकरण केंद्रों में किया जाता है, जिसमें ईएमबीएल हैम्बर्ग और इंस्टीट्यूट पाश्चर उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग सेंटर 26,27,28 शामिल हैं। एचटीएक्स केंद्र माइक्रोबैच-अंडर-ऑयल विधि का उपयोग करता है; जबकि आमतौर पर कम उपयोग किया जाता है, यह एक मजबूत तरीका है जो नमूना और क्रिस्टलीकरण कॉकटेल20,21,22 की खपत को कम करता है। माइक्रोबैच-अंडर-ऑयल विधि का एक लाभ, विशेष रूप से जब उच्च-चिपचिपाहट पैराफिन तेल का उपयोग किया जाता है, तो यह है कि प्रयोग के दौरान बूंद के भीतर केवल मामूली वाष्पीकरण होता है, जिसका अर्थ है कि संतुलन एकाग्रता ड्रॉप मिक्सिंग पर प्राप्त होती है। यदि माइक्रोबैच-अंडर-ऑयल विधि में सकारात्मक क्रिस्टलीकरण परिणाम देखे जाते हैं, तो इन स्थितियों का प्रजनन आमतौर पर वाष्प प्रसार सेटअप की तुलना में अधिक सीधा होता है, जिसमें क्रिस्टलीकरण ड्रॉप और जलाशय के बीच संतुलन के दौरान कुछ अपरिभाषित बिंदु पर क्रिस्टलीकरण होता है। हिट ्स की प्रजनन क्षमता उच्च-थ्रूपुट क्रिस्टलीकरण दृष्टिकोण के लिए वांछनीय है, जो निषेधात्मक रूप से छोटे प्रोटीन क्रिस्टल का उत्पादन करते हैं जिन्हें आमतौर पर एकल-क्रिस्टल एक्स-रे प्रयोगों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है।

घुलनशील प्रोटीन के लिए उच्च-थ्रूपुट क्रिस्टलीकरण स्क्रीन कॉकटेल से बना है जो इन-हाउस, तैयार वाणिज्यिक स्क्रीन और इन-हाउस-संशोधित वाणिज्यिक स्क्रीन22 तैयार की जाती है। कॉकटेल को शुरू में पहले से सफल क्रिस्टलीकरण कॉकटेल20 का उपयोग करके अपूर्ण तथ्यात्मक रणनीति का उपयोग करके विकसित किया गया था। स्क्रीन में अभिकर्मकों जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, उनमें पॉलिमर, क्रिस्टलीकरण लवण, पीईजी और आयन संयोजन और स्क्रीन शामिल हैं जो विरल मैट्रिक्स और अपूर्ण तथ्यात्मक दृष्टिकोण का उपयोग करते हैं। ऐसे अभिकर्मक भी हैं जिन्हें स्क्रीन में शामिल करने से पहले संशोधित किया जाता है: एक योजक स्क्रीन, एक पीएच और बफर स्क्रीन, एक आयनिक तरल योजक स्क्रीन और एक बहुलक स्क्रीन।

ज्ञात क्रिस्टलीकरण स्थितियों और रणनीतियों की शक्ति का लाभ 1,536 क्रिस्टलीकरण कॉकटेल में उठाया गया है, साथ ही माइक्रोबैच-अंडर-ऑयल सिस्टम के लाभों के साथ-साथ एक पाइपलाइन उत्पन्न करने के लिए जो स्वचालित तरल हैंडलिंग, स्वचालित ब्राइटफील्ड इमेजिंग और चिरल क्रिस्टल (सोनिक) के दूसरे क्रम नॉनलाइनर इमेजिंग को नियोजित करता है। तरल हैंडलिंग और इमेजिंग दोनों का स्वचालन कम गीले प्रयोगशाला घंटों और उच्च प्रजनन क्षमता के लाभ प्रदान करता है। स्वचालित क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग की उच्च-थ्रूपुट प्रकृति क्रिस्टल विकास के लिए निगरानी की प्रक्रिया के स्वचालन की आवश्यकता होती है। ये प्रगति सकारात्मक क्रिस्टल हिट की पहचान में सहायता के लिए अत्याधुनिक इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के साथ हासिल की जाती है। प्लेटों के मानक ब्राइटफील्ड इमेजिंग, साथ ही बढ़ी हुई पहचान के लिए मल्टी-फोटॉन विधियों दोनों का उपयोग एसओएनआईसीसी (चित्रा 2) के साथ क्रिस्टल इमेजिंग सिस्टम के माध्यम से किया जाता है। सोनीक बहुत छोटे क्रिस्टल का पता लगाने के लिए दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) 29 माइक्रोस्कोपी और पराबैंगनी दो-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति (यूवी-टीपीईएफ) 30 माइक्रोस्कोपी को जोड़ती है, साथ ही अवक्षेप द्वारा अस्पष्ट होती है। सोनिक इमेजिंग इस बात की सूचना देती है कि कुओं में प्रोटीन (यूवी-टीपीईएफ के माध्यम से) और क्रिस्टल (एसएचजी के माध्यम से) हैं या नहीं। प्रोटीन क्रिस्टल की सकारात्मक पहचान से परे, अत्याधुनिक इमेजिंग विधियों का उपयोग करके अतिरिक्त जानकारी भी प्राप्त की जा सकती है। नमूना जोड़ने से पहले कॉकटेल-केवल इमेजिंग एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है; ये छवियां नमूना जोड़ने से पहले अच्छी तरह से उपस्थिति की पहचान कर सकती हैं, जिसमें नमक क्रिस्टल और मलबे के संदर्भ में शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, एसएचजी और यूवी-टीपीईएफ इमेजिंग नमक क्रिस्टल से प्रोटीन क्रिस्टल को अलग करने में मदद करते हैं और इसका उपयोग प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड कॉम्प्लेक्स सामग्री31 की कल्पना के लिए किया जा सकता है।

इमेजिंग के माध्यम से बार-बार निगरानी से गुजरने वाले उच्च-थ्रूपुट क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के परिणामस्वरूप बहुत बड़ी मात्रा में छवियों को परीक्षा की आवश्यकता होती है। उपयोगकर्ता पर बोझ को कम करने और सकारात्मक क्रिस्टल हिट की पहचान करने की संभावना बढ़ाने के लिए स्वचालित क्रिस्टल स्कोरिंग विधियों को विकसित किया गया है। एचटीएक्स सेंटर ने मैचिन रिकग्निशन ऑफ क्रिस्टलाइजेशन आउटकम (मार्को) स्कोरिंग एल्गोरिदम के विकास में भाग लिया, जो एक प्रशिक्षित गहरी संक्रामक तंत्रिका नेटवर्क आर्किटेक्चर है जिसे अकादमिक, गैर-लाभकारी, सरकार और उद्योग भागीदारों के एक संघ द्वारा ब्राइटफील्ड अच्छी तरहसे छवियों को वर्गीकृत करने के लिए विकसित किया गया है। एल्गोरिथ्म को विभिन्न क्रिस्टलीकरण विधियों और विभिन्न इमेजर्स का उपयोग करके कई संस्थानों से क्रिस्टलीकरण प्रयोगों से लगभग आधा मिलियन ब्राइटफील्ड छवियों पर प्रशिक्षित किया गया था। एल्गोरिथ्म एक संभाव्य स्कोर आउटपुट करता है जो दर्शाता है कि क्या कोई दी गई छवि चार संभावित छवि वर्गों में आती है: "क्रिस्टल", "स्पष्ट", "अवक्षेप", और "अन्य"। मार्को में 94.5% की वर्गीकरण सटीकता की सूचना है। क्रिस्टल डिटेक्शन को सॉफ्टवेयर के साथ आगे बढ़ाया जाता है जो एल्गोरिदम को लागू करता है और एआई-सक्षम स्कोरिंग क्षमताओं32,33 के साथ सक्षम सुलभ और सरल छवि देखने के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) प्रदान करता है। मार्को पोलो जीयूआई को एचटीएक्स सेंटर में इमेजिंग और डेटा प्रबंधन प्रणाली के सेटअप के साथ मूल रूप से काम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, ताकि 1,536-वेल स्क्रीन में हिट की पहचान की जा सके, जिसमें क्रमबद्ध सूचियों के आउटपुट की जांच करने के लिए मानव जुड़ाव हो। इसके अतिरिक्त, GitHub पर उपलब्ध ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर के रूप में, GUI अन्य प्रयोगशाला समूहों की विशिष्ट आवश्यकताओं को प्रतिबिंबित करने के लिए संशोधन के लिए आसानी से उपलब्ध है।

यहां, कॉकटेल और प्रोटीन दोनों को वितरित करने के लिए रोबोटिक तरल हैंडलिंग का उपयोग करके एक उच्च-थ्रूपुट माइक्रोबैच-अंडर-ऑयल प्रयोग स्थापित करने की प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। एचटीएक्स सेंटर में इंस्ट्रूमेंटेशन और संसाधनों की एक अनूठी सरणी है जो अन्य संस्थानों में नहीं पाए जाते हैं, इच्छुक उपयोगकर्ताओं को स्क्रीनिंग सेवाएं और शैक्षिक संसाधन प्रदान करने के लक्ष्य के साथ। रोबोटिक्स-सक्षम उच्च-थ्रूपुट तकनीकों के तरीकों और क्षमताओं का प्रदर्शन समुदाय को उपलब्ध प्रौद्योगिकियों का ज्ञान रखने और अपने स्वयं के संरचना निर्धारण प्रयासों के लिए निर्णय लेने में सक्षम करेगा।

Protocol

1. सोलह 96-अच्छी तरह से गहरे कुएं ब्लॉकों के लिए कॉकटेल की तैयारी या खरीद

  1. 96-वेल डीप वेल (डीडब्ल्यू) ब्लॉकों में वितरित करके इन-हाउस-जेनरेटेड रासायनिक कॉकटेल तैयार करें। नमक, बफर, पॉलिमर और पानी के स्टॉक समाधान को वितरित करने और मिश्रण करने के लिए एक रोबोट तरल हैंडलर का उपयोग करें।
  2. व्यावसायिक रूप से खरीदे गए 96-अच्छी डीडब्ल्यू ब्लॉक स्क्रीन में अतिरिक्त घटकों को जोड़ने के लिए रोबोटिक लिक्विड हैंडलर या मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके इन-हाउस-संशोधित रासायनिक कॉकटेल तैयार करें।
  3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीडब्ल्यू ब्लॉक खरीदें।
  4. स्टोर ने 12-18 महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 96-वेल डीडब्ल्यू ब्लॉक लेबल किए।
    नोट: कॉकटेल चरण 1.1 में तैयार किया गया। और 1.2. 10/16 96-अच्छी तरह से डीडब्ल्यू ब्लॉक भरें, और 5/16 96-अच्छी तरह से डीडब्ल्यू ब्लॉक खरीदे गए के रूप में उपयोग किए जाते हैं। एडिटिव स्क्रीन की वर्षा से बचने के लिए स्क्रीन में एक 96-वेल डीडब्ल्यू ब्लॉक 1,536-वेल प्लेट डिस्पेंसिंग के समय स्थापित किया गया है (अनुभाग 3 देखें)।

2. कॉकटेल को 384-वेल प्लेटों में वितरित करना

  1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 96-वेल डीडब्ल्यू ब्लॉक को पिघलाएं। 384-वेल प्लेटों की तैयारी शुरू करने से पहले कमरे के तापमान (20-23 डिग्री सेल्सियस) पर लाएं।
    नोट: कॉकटेल प्लेटों को तैयार करने के लिए कमरे का तापमान उपयुक्त है। इन प्लेटों को तैयार करने में मुख्य चिंता अवक्षेप से बचना है, जो तरल-हैंडलिंग उपकरणों को रोक सकता है और कॉकटेल सामग्री की सांद्रता में अप्रत्याशित परिवर्तन कर सकता है।
  2. किसी भी लगातार अपारदर्शी अवक्षेप को भंग करने के लिए आवश्यकतानुसार व्युत्क्रम द्वारा ब्लॉकों को अच्छी तरह से मिलाएं। यदि किसी भी कुएं में अवक्षेप होता है, तो ब्लॉक को घुलने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  3. 96-अच्छी तरह से डीडब्ल्यू ब्लॉक से एक 384-वेल प्लेट में कॉकटेल समाधान के 50 μL वितरित करें, जिसमें 96 सिरिंज या पिपेटोर हेड से लैस तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग किया जाता है। चार 96-वेल डीडब्ल्यू ब्लॉक को 384-वेल प्लेट में इस तरह से मुद्रित किया जाता है कि क्वाड्रंट भरे जाते हैं (उदाहरण के लिए, 96-डीडब्ल्यू 1 का ए 1 से 384-प्लेट 1 का ए 1, 96-डीडब्ल्यू 2 का ए 1 से 384-प्लेट 1 का बी 1, आदि)। (चित्र 3)।
  4. 16 96-वेल डीडब्ल्यू ब्लॉकों में से 15 को भंडारण के लिए 384-वेल प्लेटों में वितरित करें।
  5. 1,536-वेल प्लेटों को तैयार करने में उपयोग के लिए 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर 384-वेल प्लेटों को स्टोर करें।

3. तेल और क्रिस्टलीकरण कॉकटेल के साथ 1,536-अच्छी तरह से प्लेटें तैयार करना

  1. धीमी आकांक्षा और वितरण की क्षमता के साथ रोबोट तरल हैंडलिंग सिस्टम का उपयोग करके 1,536-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 5 μL पैराफिन तेल वितरित करें। तेल प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने तक स्टोर करें।
  2. खंड 2 से 384-अच्छी प्लेटों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाएं। घोल को मिलाने के लिए प्लेटों को उलटा करें और अवक्षेप को घोलें। लगातार अवक्षेप को भंग करने के लिए प्लेटों को 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. एडिटिव स्क्रीन घटकों को तैयार करने के लिए, अंतिम 96-वेल डीडब्ल्यू ब्लॉक का उपयोग करें जिसमें 0.1 एम एचईपीईएस पीएच 6.8, 30% पीईजी 3350 शामिल हैं जो या तो तरल हैंडलिंग रोबोट या मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके वाणिज्यिक योजक स्क्रीन के साथ मिश्रण करते हैं।
  4. चरण 3.3 में तैयार किए गए बफर पीईजी 3350 समाधान के 1: 1 मिश्रण और उपयुक्त 384-वेल प्लेट में 50 μL की अंतिम मात्रा में एडिटिव स्क्रीन समाधान तैयार करें।
  5. 1,536-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 200 एनएल कॉकटेल समाधान देने के लिए 384 सिरिंज या पिपेटर हेड से लैस तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करें। 1,536-वेल प्लेट में चार 384-वेल प्लेटों को इस तरह से स्टैम्प करें कि क्वाड्रंट भरे जाएं (उदाहरण के लिए, 1,536-वेल प्लेट के 384-प्लेट 1 से ए 1 के ए 1, 384-प्लेट 1 के ए 2 से 1,536-वेल प्लेट के ए 3 तक, आदि)। (चित्र 3)।
  6. 4 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण करने से पहले 5 मिनट के लिए 150 × ग्राम पर प्लेटों को सेंट्रीफ्यूज करें।

4. नमूना सबमिशन

  1. एक नमूना जमा करने के लिए, आगामी स्क्रीनिंग रन के लिए आरक्षण की समय सीमा से पहले एक आरक्षण ईमेल भेजें। स्क्रीनिंग प्रयोगों की संख्या, नाम, पीआई और संस्थान, साथ ही नमूने के लिए किसी भी विशेष हैंडलिंग आवश्यकताओं को शामिल करें। स्क्रीनिंग रन लगभग एक बार मासिक रूप से आयोजित किए जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप सालाना 12 रन होते हैं।
  2. नमूना शिपिंग से पहले एक नमूना सबमिशन फॉर्म भरें।
    1. नए उपयोगकर्ताओं के लिए, एक पासवर्ड चुनें जिसका उपयोग अनुभाग 7 में क्रिस्टलीकरण छवियों को डाउनलोड करने के लिए किया जाएगा।
    2. स्थापित उपयोगकर्ताओं के लिए, मौजूदा पासवर्ड का उपयोग करें या इस चरण पर पासवर्ड परिवर्तित करें।
  3. 1.5 एमएल ट्यूब में नमूना जमा करें। सुनिश्चित करें कि मैक्रोमोलेक्यूल सजातीय है और क्रिस्टलीकरण को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त रूप से केंद्रित है। एक पूर्व-क्रिस्टलीकरण परीक्षण का उपयोग करें, जो आमतौर पर अमोनियम सल्फेट या पीईजी 4,000 से बना होता है, यह देखकर उचित नमूना एकाग्रता की जांच करने के लिए कि क्या परीक्षण किए गए नमूना सांद्रता के परिणामस्वरूप स्पष्ट बूंदें या अवक्षेप34 हैं।
    नोट: शुद्धता और समरूपता की जांच के लिए नमूना प्रस्तुत करने से पहले किए जाने वाले उपयुक्त गुणवत्ता परीक्षणों में एसडीएस-पेज, जेल निस्पंदन और गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) शामिल हैं। क्रिस्टलीकरण मामूली अशुद्धियों की उपस्थिति से भी प्रभावित हो सकता है। वर्तमान में एक 1,536-वेल प्लेट स्थापित करने के लिए 500 μL की नमूना मात्रा की आवश्यकता है। नमूना मात्रा की आवश्यकता को कम करने के लिए परीक्षण चल रहा है।
    1. 50 एमएम से अधिक बफर सांद्रता का उपयोग करने से बचें, साथ ही फॉस्फेट, जो स्क्रीन के भीतर क्रिस्टलीकृत हो सकते हैं।
    2. अत्यधिक घुलनशील एजेंटों से बचें, जिसमें ग्लिसरॉल सांद्रता 10% डब्ल्यू / वी से अधिक है।
  4. एक सील कंटेनर में सूखी बर्फ, गीली बर्फ, या शीतलन पैक का उपयोग करके उचित तापमान को सुरक्षित रूप से बनाए रखने के लिए नमूने को पैकेज करें।
  5. रन के दौरान सोमवार-बुधवार को रात भर नमूना प्राथमिकता शिप करें।
  6. नमूना भेज दिए जाने के बाद ट्रैकिंग नंबर ईमेल करें।

5. तैयार 1,536-वेल प्लेटों में नमूना सेटअप

  1. नमूने अनपैक करें और उपयोगकर्ता द्वारा अनुरोध ति तापमान पर तुरंत इनक्यूबेट करें।
  2. एक बार पिघलने के बाद, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए नमूने को 10,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। सेटअप से पहले नमूने की वर्षा, रंग और स्थिति की पहचान करने के लिए नमूने का नेत्रहीन निरीक्षण करें।
  3. 1,536-वेल प्लेट को 23 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और 5 मिनट के लिए 150 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ब्राइटफील्ड इमेजिंग का उपयोग करके कॉकटेल-केवल प्लेट की छवि बनाएं।
    नोट: नमूना सेटअप से पहले सभी प्लेटों को ब्राइटफील्ड इमेजिंग के साथ चित्रित किया जाता है, जो उन कुओं की पहचान करने में सक्षम बनाता है जिनमें नकारात्मक नियंत्रण के रूप में नमूना जोड़ने से पहले पहले से ही क्रिस्टल या मलबे होते हैं। इसके अलावा, यह उन कुओं की पहचान करने में सक्षम बनाता है जिनमें क्रिस्टलीकरण कॉकटेल वितरित नहीं किया गया है। प्लेट को कमरे के तापमान पर गर्म करने से प्लेट की सतह पर संघनन समाप्त हो जाता है, जिससे स्पष्ट छवियां होती हैं।
  4. तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करके 1,536-वेल प्लेट में प्रत्येक कुएं में 200 एनएल नमूना वितरित करें। 150 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज प्लेट और 4 डिग्री सेल्सियस, 14 डिग्री सेल्सियस या 23 डिग्री सेल्सियस पर सेने वाली प्लेटें।
    नोट: वांछित तेल के तहत प्रोटीन और कॉकटेल वितरित करके माइक्रोबैच अंडर-ऑयल-प्रयोगों को हाथ से स्थापित किया जा सकता है। हालांकि, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रत्येक प्रोटीन और कॉकटेल के कम से कम 1 μL का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

6. क्रिस्टल गठन के लिए 1,536-वेल प्लेटों की निगरानी करें

  1. नमूना 1,536-वेल प्लेटों में जोड़े जाने के बाद, दिन 1 और सप्ताह 1, सप्ताह 2, सप्ताह 3, सप्ताह 4 और सप्ताह 6 में ब्राइटफील्ड इमेजिंग के साथ छवि।
  2. एसएचजी और यूवी-टीपीईएफ के साथ एसओएनआईसीसी इमेजिंग 4 सप्ताह के समय बिंदु पर प्लेटों को 23 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए और प्लेटों को 14 डिग्री सेल्सियस या 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए 6 सप्ताह के समय बिंदु पर करें।
    नोट: सोनिक इमेजिंग के लिए समय उच्च-थ्रूपुट 1,536 माइक्रोसेप्लेट के लिए 4 सप्ताह और 6 सप्ताह के समय बिंदुओं पर निर्धारित है क्योंकि, आमतौर पर, क्रिस्टल उन समय बिंदुओं द्वारा दिखाई देंगे। तेल या वाष्प प्रसार प्रयोगों के तहत 96-वेल माइक्रोबैच में संशोधन के लिए, समय विंडो में पहले एसओएनआईसीसी इमेजिंग करने की सलाह दी जाती है।
  3. आंतरिक LIMS सिस्टम का उपयोग करके उपयोगकर्ता खाते में स्वचालित रूप से स्थानांतरित की गई प्रयोगात्मक छवियों तक पहुंचें। उपयोगकर्ताओं को एक स्वचालित एचटीस्लैब ईमेल डेमन के माध्यम से सूचित करें कि इमेजिंग हुई है।

7. छवि विश्लेषण

  1. प्रत्येक .rar फ़ाइल के लिए HWI FTP साइट से स्क्रीनिंग छवियाँ पुनर्प्राप्त करें।
    नोट: 1,536 स्क्रीन से छवि आउटपुट के परिणामस्वरूप ब्राइटफील्ड छवियां, एसएचजी छवियां और यूवी-टीपीईएफ छवियों वाली कई फाइलें होती हैं। प्रत्येक इमेजिंग साधन या समय बिंदु एक अलग .rar फ़ाइल है। प्रत्येक .rar फ़ाइल, जब अनपैक की जाती है, तो एक विशिष्ट इमेजिंग साधन का उपयोग करके एक विशिष्ट समय बिंदु पर 1,536-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं से एक छवि होती है।
    1. FTP डेटा तक पहुँचने के लिए FileZilla क्लाइंट या अन्य विकल्पों का उपयोग करें।
      नोट: फ़ाइलज़िला क्लाइंट कम्प्यूटेशनल क्रैश को कम करने के लिए बड़ी फ़ाइल स्थानांतरण मात्रा का प्रबंधन करने का अनुशंसित तरीका है।
      1. यदि FileZilla क्लाइंट उपयोगकर्ता कंप्यूटर पर स्थापित करने की आवश्यकता है, तो FileZilla सॉफ़्टवेयर डाउनलोड करें।
      2. यदि FileZilla क्लाइंट पहले से स्थापित है या स्थापना पर है, तो सॉफ़्टवेयर खोलने के लिए FileZilla आइकन पर क्लिक करें।
      3. होस्ट FTP वेबसाइट, उपयोगकर्ता नाम और पासवर्ड दर्ज करके FileZilla से दूरस्थ FTP सर्वर में लॉग इन करें।
      4. इच्छित निर्देशिका के लिए .rar फ़ाइलें डाउनलोड करें।
  2. क्रिस्टलीकरण छवियों को देखने, स्कोर करने और विश्लेषण करने के लिए एआई-सक्षम ओपन-सोर्स जीयूआई का उपयोग करें।
    नोट: जीयूआई का उपयोग अधिकांश विंडोज, मैक और लिनक्स ऑपरेटिंग सिस्टम (ओएस) पर किया जा सकता है, और डाउनलोड के लिए ओएस-विशिष्ट निर्देश गिटहब साइट पर स्थित हैं। मार्को पोलो एक ओपन-सोर्स जीयूआई है जो एचटीएक्स सेंटर में लागू उच्च-थ्रूपुट 1,536 क्रिस्टलीकरण स्क्रीन से मेटाडेटा को शामिल करता है। यह किसी के लिए भी अन्य प्रयोगशाला समूहों की विशिष्ट आवश्यकताओं को प्रतिबिंबित करने के लिए संशोधन के लिए GitHub से डाउनलोड करने के लिए उपलब्ध है।
    1. फ़ाइल डाउनलोड होने के बाद GUI में .rar फ़ाइल खोलें ( पूरक चित्र S1 देखें)।
      1. आयात पर क्लिक करें, ड्रॉपडाउन मेनू से छवियों का चयन करें, और फिर रार पुरालेख/निर्देशिका से चुनें।
      2. पॉपअप विंडो में फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़ करें पर क्लिक करें, और उसके बाद छवियों वाले फ़ोल्डर पर नेविगेट करें।
      3. इच्छित फ़ाइल का चयन करें, और खोलें पर क्लिक करके जीयूआई में आयात करें। चयनित पथ विंडो में फ़ाइल के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें. GUI में डाउनलोड करने के लिए एक या अधिक फ़ाइलों का चयन करें, और आयात रन पर क्लिक करें।
    2. नमूना नाम के बाईं ओर > प्रतीक पर क्लिक करके जीयूआई में स्लाइड शो व्यूअर की विंडो में पहले कुएं के लिए छवि देखें और फिर उस पर डबल-क्लिक करके उपयुक्त पठन का चयन करें (रीड छवि-ब्राइटफील्ड, यूवी-टीपीईएफ, या एसएचजी की तारीख और प्रकार द्वारा सूचीबद्ध हैं)।
    3. पूरी विंडो का आकार बदलकर छवि को बड़ा करें। छवि विवरण बॉक्स में छवि के बारे में जानकारी शामिल होती है, जिसमें स्कोरिंग जानकारी (पढ़ने के स्कोर होने तक खाली) शामिल होती है। कॉकटेल विवरण बॉक्स में कॉकटेल घटकों के बारे में मेटाडेटा होता है।
    4. नेविगेशन पैनल में अगला बटन पर क्लिक करके या कीबोर्ड पर दाईं तीर कुंजी दबाकर अगले कुएं पर जाएं। बाई वेल नंबर विंडो में वेल नंबर दर्ज करके एक विशिष्ट कुएं पर नेविगेट करें।
    5. सभी दिनांक दिखाएँ बॉक्स की जाँच करके सभी पठन (जीयूआई में आयात किए गए) देखें.
    6. सभी स्पेक्ट्रा दिखाएँ बॉक्स की जाँच करके सभी स्पेक्ट्रा (जीयूआई में आयात किए गए) देखें। प्रत्येक स्पेक्ट्रम छवि को व्यक्तिगत रूप से देखने के लिए स्वैप स्पेक्ट्रम बटन पर क्लिक करें।
  3. विंडो के बाईं ओर सूची से एक विशिष्ट रन को उजागर करके मार्को एल्गोरिदम का उपयोग करके क्रिस्टल छवियों को स्कोर करें। इसके बाद, चयनित रन वर्गीकृत करें बटन पर क्लिक करें। सभी 1,536 कुओं के लिए इमेजिंग रीड स्कोर किए जाने के बाद छवि विवरण विंडो में मार्को स्कोरिंग जानकारी देखें।
    नोट: कंप्यूटर की गति और उपलब्ध स्मृति के आधार पर वर्गीकरण में आमतौर पर 2-5 मिनट लगेंगे। एल्गोरिथ्म स्कोर उत्पन्न करता है जो सामग्री को "क्रिस्टल", "स्पष्ट", "अवक्षेप", या "अन्य" वर्गों में वर्गीकृत करता है। प्रत्येक कुएं के वर्गीकरण से जुड़े संख्यात्मक मान उस वर्ग की अच्छी तरह से युक्त वस्तुओं की संभावना को दर्शाते हैं।
    1. छवि फ़िल्टरिंग पैनल में वांछित बॉक्स (ओं) पर टिक करके और सबमिट फ़िल्टर बटन पर क्लिक करके स्कोर की गई छवियों का एक उप-समूह देखें। उदाहरण के लिए, क्रिस्टल और मार्को बॉक्स पर टिक करके और सबमिट फ़िल्टर पर क्लिक करके केवल मार्को द्वारा क्रिस्टल के रूप में वर्गीकृत छवियों को देखें।
  4. "मानव स्कोर" सेट उत्पन्न करने के लिए क्रिस्टल छवियों को मैन्युअल रूप से स्कोर करें। उपयुक्त बटन पर क्लिक करके एक स्कोर असाइन करें ("क्रिस्टल", "स्पष्ट", "अवक्षेप", या "अन्य" बटन विंडो के निचले भाग में वर्गीकरण पैनल में स्थित हैं)। वैकल्पिक रूप से, स्कोर (1 = "क्रिस्टल", 2 = "स्पष्ट", 3 = "अवक्षेप", 4 = "अन्य") असाइन करने के लिए कीबोर्ड पर नंबर पैड का उपयोग करें। पसंदीदा पर टिक करके मानव-स्कोर की गई छवि को "पसंदीदा" के रूप में नामित करें ? संदूक।
    नोट: क्रिस्टल और मानव बक्से पर टिक करके और सबमिट फिल्टर पर क्लिक करके केवल मानव द्वारा क्रिस्टल के रूप में वर्गीकृत छवियों को देखें। फ़िल्टरिंग पैनल में पसंदीदा बॉक्स पर क्लिक करने से लौटाई गई छवियों को और कम कर दिया जाता है, केवल मानव-स्कोर किए गए क्रिस्टल छवियों को वापस किया जाता है जो पसंदीदा भी हैं।
  5. एक समय में एकाधिक कुओं को देखने के लिए प्लेट व्यूअर टैब का उपयोग करें. नियंत्रण कक्ष में दूसरे प्लेट व्यूअर टैब पर, चित्र प्रति प्लेट अनुभाग में ड्रॉपडाउन मेनू से 16, 64, या 96 छवियों का चयन करें। छवि फ़िल्टरिंग टैब का उपयोग उन छवियों को ग्रे-आउट करने के लिए करें जो रुचि के नहीं हैं। छवियों को फ़िल्टर करने के लिए फ़िल्टर लागू करें बॉक्स का चयन करें।
    नोट: उदाहरण के लिए, "मानव" और "क्रिस्टल" बक्से का चयन करें, और केवल वे कुएं जो मानव द्वारा क्रिस्टल के रूप में स्कोर किए गए थे, आसानी से दिखाई देंगे।
    1. 16/64/96 छवियों के अगले सेट को देखने के लिए अगला बटन पर क्लिक करके, प्लेट व्यूअर टैब में नेविगेट करें। डिफ़ॉल्ट रूप से, क्रिस्टल के रूप में स्कोर की गई छवियां लाल होती हैं, जो स्पष्ट रूप से स्कोर की जाती हैं वे नीले रंग की होती हैं, जो अवक्षेप के रूप में स्कोर की जाती हैं वे हरे रंग की होती हैं, और अन्य के रूप में स्कोर की गई छवियां नारंगी होती हैं। ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करके रंग परिवर्तित करें.
    2. लेबल टैब पर विभिन्न बक्से टिक करके कुओं पर प्रदर्शित की जाने वाली जानकारी का चयन करें।
    3. वर्तमान दृश्य की छवि फ़ाइल सहेजने के लिए दृश्य सहेजें पर क्लिक करें.
    4. मल्टीपल-वेल छवि के लिए ब्राइटफील्ड, एसएचजी और यूवी-टीपीईएफ छवियों के बीच टॉगल करने के लिए स्वैप स्पेक्ट्रम पर क्लिक करें।
  6. निर्यात पर क्लिक करें, और अन्य प्रोग्रामों में उपयोग के लिए स्कोर की गई फ़ाइलों को निर्यात करने के लिए ड्रॉपडाउन मेनू से उपयुक्त फ़ाइल प्रकार का चयन करें।
    नोट: CSV (अल्पविराम-पृथक मान) फ़ाइलें स्प्रेडशीट प्रोग्रामजैसे Microsoft Excel या Google पत्रक के साथ संगत हैं। JSON (JavaScript ऑब्जेक्ट नोटेशन) फ़ाइलों को अधिकांश पाठ संपादकों के साथ खोला जा सकता है। PPTX (PowerPoint प्रस्तुति) का उपयोग पोलो से छवियों को प्रदर्शित करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें ब्राइटफील्ड, यूवी-टीपीईएफ और एसएचजी छवियों की तुलना शामिल है। फ़ाइलें मार्को पोलो GUI में पुन: खोले जाने के लिए .xtal स्वरूप में सहेजी जाती हैं.
    1. पृष्ठ के शीर्ष पर फ़ाइल पर क्लिक करके और फिर रन सहेजें या इस रूप में सहेजें का चयन करके .xtal स्वरूप फ़ाइल सहेजें. फ़ाइल नाम और निर्देशिका स्थान प्रदान करें.
    2. आयात पर क्लिक करके और छवियों का चयन करके और फिर सहेजे गए रन से फ़ाइलें खोलें. उपयुक्त फ़ाइल स्थान के लिए ब्राउज़ करें, फ़ाइल नाम पर क्लिक करें, और तब खोलें पर क्लिक करें.

Representative Results

1,536-वेल क्रिस्टल स्क्रीनिंग प्रयोग के परिणामों में दिन 0 (नकारात्मक नियंत्रण), दिन 1, सप्ताह 1, सप्ताह 2, सप्ताह 3, सप्ताह 4 और सप्ताह 6 (चित्रा 4) में एकत्र किए गए सात पूर्ण ब्राइटफील्ड छवि सेट शामिल हैं। सोनिक छवियों को 23 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट की गई प्लेटों के लिए 4 सप्ताह के समय बिंदु पर और 4 डिग्री सेल्सियस या 14 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट की गई प्लेटों के लिए 6 सप्ताह के समय बिंदु पर एकत्र किया जाता है। छवियों को अपलोड किया जाएगा क्योंकि वे एकत्र किए जाते हैं। क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग प्रयोग 6 सप्ताह के बाद समाप्त होता है।

1,536-वेल प्लेट सेटअप सभी स्क्रीनिंग प्रयोगों को एक ही प्लेट के भीतर आयोजित करने की अनुमति देता है, इस प्रकार नमूना खपत को सीमित करता है और इमेजिंग तौर-तरीकों के बीच इमेजिंग और सीधी तुलना की सुविधा प्रदान करता है। एकल कॉकटेल स्थिति के लिए क्रिस्टल विकास के समय पाठ्यक्रम के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 4 में दिखाए गए हैं। प्रयोग के दौरान स्वचालित प्लेट इमेजिंग ब्राइटफील्ड इमेजिंग द्वारा तेजी से और धीरे-धीरे बढ़ते क्रिस्टल दोनों की पहचान की अनुमति देती है। यूवी-टीपीईएफ और एसएचजी इमेजिंग ब्राइटफील्ड इमेजिंग द्वारा देखे गए हिट के क्रॉस-सत्यापन की अनुमति देते हैं और इंगित करते हैं कि देखे गए क्रिस्टल क्रमशः प्रोटीनयुक्त और क्रिस्टलीय हैं (चित्रा 5 ए, बी)। इसके अलावा, सोनिक इमेजिंग उन क्रिस्टल की पहचान करने में सक्षम बनाता है जो अवक्षेप या फिल्मों (चित्रा 5 सी) या माइक्रोक्रिस्टल द्वारा नेत्रहीन रूप से अस्पष्ट होते हैं जिन्हें अन्यथा अवक्षेप (चित्रा 5 डी) के रूप में गलत माना जा सकता है। कुछ क्रिस्टल के लिए, एसएचजी सिग्नल की कमी अयोग्य नहीं है, क्योंकि कुछ बिंदु समूह एसएचजी सिग्नल35,36 का उत्पादन नहीं करते हैं, जैसा कि चित्रा 5 सी में टेट्रागोनल थाउमेटिन क्रिस्टल द्वारा उदाहरण दिया गया है। इसके विपरीत, ट्रिप्टोफैन अवशेषों की कमी वाले प्रोटीन के लिए यूवी-टीपीईएफ सिग्नल की कमी का अनुमान लगाया जाना चाहिए। यूवी-टीपीईएफ और एसएचजी संकेतों का अवलोकन गैर-प्रोटीन नमक क्रिस्टल की पहचान की सुविधा भी प्रदान करता है, जो ब्राइटफील्ड में दिखाई देगा और एक मजबूत सकारात्मक एसएचजी संकेत प्रदर्शित करेगा लेकिन यूवी-टीपीईएफ सिग्नल (चित्रा 5 ई) की कमी होगी।

प्लेट सेटअप के लिए छवि विश्लेषण मार्को पोलो जीयूआई के साथ सुव्यवस्थित है, जो एचडब्ल्यूआई सर्वर से एफ़टीपी डेटा ट्रांसफर को भी बंडल करता है (फाइलज़िला के साथ फ़ाइलों को स्थानांतरित करने के विकल्प के रूप में)। मार्को पोलो जीयूआई आसानी से नौगम्य प्लेट और छवि देखने की अनुमति देता है और मार्को एल्गोरिदम का उपयोग करके कम्प्यूटेशनल छवि स्कोरिंग करता है ताकि छवि परिणामों को एचटीएक्स सेंटर से तेजी से डाउनलोड, देखा और विश्लेषण किया जा सके। मार्को स्कोरिंग एल्गोरिथ्म, जैसा कि मार्को पोलो जीयूआई में लागू किया गया है, 5 मिनट से भी कम समय में पूरे 1,536-वेल प्लेट से छवियों को स्कोर करने में सक्षम है। मार्को एल्गोरिथ्म द्वारा क्रिस्टलीय के रूप में ध्वजांकित छवियों को बाद में प्रदर्शन के लिए पोलो जीयूआई द्वारा क्रमबद्ध किया जा सकता है। चूंकि मार्को एल्गोरिथ्म को क्रिस्टल पहचान और झूठे नकारात्मक को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया था ताकि किसी भी सकारात्मक हिट को याद न किया जा सके, स्कोरिंग के परिणामस्वरूप झूठे सकारात्मक झंडे हो सकते हैं। फिर भी, क्रिस्टल युक्त कुओं पर ध्यान केंद्रित करके जांच की जाने वाली छवियों के सेट को सीमित करने के लिए मार्को की क्षमता के परिणामस्वरूप उपयोगकर्ताओं के लिए डेटा प्रोसेसिंग बोझ में पर्याप्त कमी आती है। उपयोगकर्ता के अनुकूल मार्को पोलो देखने वाले मंच में एल्गोरिदम का सुविधाजनक कार्यान्वयन, मार्को स्कोर के आधार पर छवियों को सॉर्ट करने की क्षमता के साथ, डेटासेट का जल्दी से विश्लेषण करने और क्रिस्टल हिट को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए उपयोगकर्ता की क्षमता में काफी सुधार करता है।

Figure 1
चित्रा 1: एचटीएक्स सेंटर में किए गए उच्च-थ्रूपुट 1,536-अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग प्रयोग का योजनाबद्ध। (1) इस चरण में, प्रत्येक कुएं में पैराफिन तेल के 5 μL और कॉकटेल के 200 nL जोड़े जाते हैं (प्रोटोकॉल चरण 3.1 और चरण 3.5)। केवल तेल और कॉकटेल युक्त एक कुएं का कार्टून चित्रण और दाईं ओर एक प्रतिनिधि छवि दिखाई गई है। (2) नमूने एचटीएक्स केंद्र (प्रोटोकॉल चरण 5.1) पर पहुंचते हैं। 3) इस चरण में, प्रत्येक कुएं में 200 एनएल नमूना जोड़ा जाता है (प्रोटोकॉल चरण 5.4)। (4) ब्राइटफील्ड इमेजिंग, 5) के साथ-साथ यूवी-टीपीईएफ और एसएचजी तौर-तरीकों (प्रोटोकॉल चरण 6) का उपयोग करके समय के साथ सभी 1,536 कुओं की निगरानी की जाती है। 6) एआई-सक्षम ओपन-सोर्स जीयूआई का उपयोग क्रिस्टलीकरण छवियों (प्रोटोकॉल चरण 7) को देखने, स्कोर करने और विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। संक्षेप: एचटीएक्स = उच्च-थ्रूपुट क्रिस्टलीकरण; यूवी-टीपीईएफ = यूवी-टू-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति; एसएचजी = दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी; एआई = कृत्रिम बुद्धि; जीयूआई = ग्राफिकल यूजर इंटरफेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्क्रीनिंग प्रयोगों से युक्त एकल 1,536-वेल प्लेटें, ब्राइटफील्ड, यूवी-टीपीईएफ और एसएचजी इमेजिंग का उपयोग करके चित्रित की गई हैं। 1,536-वेल प्लेटों को स्केल (शीर्ष) के लिए एक अमेरिकी पैसे के साथ दिखाया गया है। प्रत्येक स्क्रीनिंग प्रयोग को सेटअप से पहले एक बार और ब्राइटफील्ड इमेजिंग (सात कुल ब्राइटफील्ड छवि सेट, बाएं) के साथ नमूना जोड़ने के बाद छह बार चित्रित किया जाता है। प्लेटें 4 सप्ताह या 6 सप्ताह में यूवी-टीपीईएफ (केंद्र) और एसएचजी (दाएं) इमेजिंग से गुजरती हैं। संक्षेप: यूवी-टीपीईएफ = यूवी-दो-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति; एसएचजी = दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: योजनाबद्ध दिखा रहा है कि 1,536-अच्छी प्लेटें कैसे उत्पन्न होती हैं। सोलह 96-वेल डीडब्ल्यू ब्लॉक का उपयोग चार 384-वेल प्लेटों को बाहर निकालने के लिए किया जाता है, जिसमें प्रत्येक 384-वेल प्लेट का प्रत्येक क्वाड्रंट क्रिस्टलीकरण कॉकटेल देकर भरा जाता है। चार 96-अच्छी तरह से डीडब्ल्यू ब्लॉक एक 384-वेल प्लेट (मध्य) को भरते हैं। एकल 1,536-वेल प्लेट (दाएं) पर मुहर लगाने के लिए चार 384-वेल प्लेटों का उपयोग किया जाता है। संक्षिप्त नाम: डीडब्ल्यू = गहरा कुआं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: 1,536-वेल स्क्रीनिंग प्रयोग में एक एकल कुएं का प्रतिनिधि समय पाठ्यक्रम। प्लेटों को नमूना सेटअप (दिन 0) से पहले चित्रित किया जाता है, साथ ही दिन 1, सप्ताह 1, सप्ताह 2, सप्ताह 3, सप्ताह 4 और सप्ताह 6 पर ब्राइटफील्ड इमेजिंग के साथ। 23 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट की गई प्लेटों को सप्ताह 4 में एसओएनआईसीसी के साथ चित्रित किया जाता है। स्केल बार = 80 μm (ब्राइटफील्ड), 200 μm (SHG, UV-TPEF)। संक्षेप: सोनिक= चिरल क्रिस्टल का दूसरा क्रम नॉनलाइनियर इमेजिंग; यूवी-टीपीईएफ = यूवी-टू-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति; एसएचजी = दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एचटी 1,536 क्रिस्टल स्क्रीनिंग प्रयोगों के लिए प्रतिनिधि इमेजिंग परिणाम। ब्राइटफील्ड, यूवी-टीपीईएफ, और एसएचजी इमेजिंग परिणाम पांच उदाहरण कुओं के लिए दिखाए गए हैं। (ए, बी) ब्राइटफील्ड, यूवी-टीपीईएफ और एसएचजी इमेजिंग द्वारा देखे गए प्रोटीन क्रिस्टल सभी तीन इमेजिंग तौर-तरीकों में स्पष्ट रूप से स्पष्ट हैं। (सी) ब्राइटफील्ड इमेजिंग में फिल्म द्वारा अस्पष्ट एक प्रोटीन क्रिस्टल यूवी-टीपीईएफ इमेजिंग द्वारा दिखाई देता है; बिंदु समूह असंगति के कारण एसएचजी इमेजिंग द्वारा क्रिस्टल नहीं देखा जाता है। (डी) यूवी-टीपीईएफ और एसएचजी इमेजिंग द्वारा सत्यापित माइक्रोक्रिस्टल का उदाहरण जिसे अन्यथा अवक्षेप माना जा सकता है। (ई) नमक क्रिस्टल का उदाहरण जो ब्राइटफील्ड और एसएचजी इमेजिंग द्वारा क्रिस्टलीय दिखाई देते हैं लेकिन यूवी-टीपीईएफ सिग्नल प्रदर्शित नहीं करते हैं। स्केल बार = 200 μm। अच्छी तरह से व्यास = 0.9 मिमी। संक्षेप: यूवी-टीपीईएफ = यूवी-दो-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति; एसएचजी = दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: मार्को पोलो में छवि फ़ाइलों को खोलना। आयात पर नेविगेट करके मार्को पोलो जीयूआई के भीतर छवि फ़ाइलों को खोला जा सकता है शीर्ष पर चित्र टैब (ए)। ध्यान दें कि फ़ाइलों को सीधे मार्को पोलो (ए) में एफटीपी टूल के माध्यम से भी स्थानांतरित किया जा सकता है या प्रोटोकॉल चरण 7.2 में वर्णित फ़ाइलज़िला के माध्यम से स्थानांतरित किया जा सकता है। पहले से डाउनलोड की जा चुकी फ़ाइलों को आयात करने के लिए, छवियों का चयन करें | Rar पुरालेख/निर्देशिका से. प्रकट होने वाली पॉपअप विंडो में, फ़ोल्डर (b) के लिए ब्राउज़ करें का चयन करें, और उस फ़ाइल निर्देशिका पर नेविगेट करें जहाँ प्लेट छवि फ़ाइलें सहेजी जाती हैं. एक बार जब फ़ाइलें चयनित पथ विंडो (सी) में होती हैं, तो एक फ़ाइल को हाइलाइट करें, और आयात रन (डी) पर क्लिक करें। मार्को पोलो जीयूआई छवियों के साथ आयात करने के लिए सही कॉकटेल फ़ाइल मेटाडेटा की पहचान करेगा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

विधि प्रोटीन क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च-थ्रूपुट पाइपलाइन का वर्णन करती है जिसके लिए माइक्रोबैच-अंडर-ऑयल प्रारूप में 1,536 व्यक्तिगत क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के लिए कम से कम 500 μL नमूने की आवश्यकता होती है। पाइपलाइन प्रयोगात्मक सेटअप के साथ-साथ कम्प्यूटेशनल छवि विश्लेषण संसाधन मार्को पोलो की तेजी से और पुन: सहायता करने के लिए तरल-हैंडलिंग रोबोटिक्स पर निर्भर करती है, जिसे क्रिस्टल हिट की पहचान करने और अलग करने के लिए मार्को एल्गोरिदम का उपयोग करके 1,536-वेल प्लेट छवियों का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया गया है।

व्यक्तिगत स्क्रीनिंग ड्रॉप्स की छोटी मात्रा (नमूना: कॉकटेल के 1: 1 अनुपात के साथ कुल 400 एनएल) का मतलब है कि सकारात्मक क्रिस्टलीकरण स्थितियों की पहचान करने के लिए बेहद छोटे नमूना वॉल्यूम की आवश्यकता होती है। ये छोटे ड्रॉप आकार आवश्यक रूप से छोटे क्रिस्टल का उत्पादन करते हैं जिन्हें पारंपरिक लूपिंग द्वारा मछली नहीं पकड़ा जा सकता है। 1,536 प्लेटों से कटाई के तरीकेविकसित किए गए हैं; इसके अतिरिक्त, क्रिस्टल के साथ प्लेटों का उपयोग सीधे सिंक्रोट्रॉन स्रोतों पर सीटू डेटा संग्रह 38 के लिए किया गया है। यदि इन क्रिस्टल की कटाई के लिए एक मजबूत विधि विकसित की गई थी, तो सिंक्रोट्रॉन प्रौद्योगिकी और सूक्ष्म-केंद्रित बीम में प्रगति उपयोगी डेटासेट प्राप्त करने में सक्षम होगी। इसके अतिरिक्त, प्राप्त क्रिस्टल को संभावित रूप से अनुकूलन प्रयासों के लिए बीज के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

सोनिक्स इमेजिंग अवक्षेप के नीचे छिपे छोटे प्रोटीन क्रिस्टल और प्रोटीन क्रिस्टल दोनों की पहचान करने में स्पष्ट रूप से फायदेमंद है। इन फायदों के बावजूद, सभी नमूना प्रकार एसएचजी और यूवी-टीपीईएफ इमेजिंग के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। उदाहरण के लिए, कुछ या बिना सुगंधित ट्रिप्टोफैन अवशेषों वाले प्रोटीन एक अस्पष्ट यूवी-टीपीईएफ संकेत दिखाएंगे। इसके अलावा, विशिष्ट अंतरिक्ष समूहों में क्रिस्टल, जिसमें सेंट्रोसिमेट्रिक समूह या बिंदु समूह 432 शामिल हैं, एसएचजी इमेजिंग द्वारा अज्ञात होंगे। फ्लोरोफोर के साथ नमूने कभी-कभी एसएचजी सिग्नल के साथ हस्तक्षेप करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप सिग्नल को रद्द कर दिया जाता है या तीव्रता में वृद्धि होती है, जिसका अर्थ है कि धातु युक्त प्रोटीन और फ्लोरोसेंट मोइटीज युक्त प्रोटीन के लिए एसएचजी संकेतों की सावधानीपूर्वक व्याख्या की आवश्यकता होती है। हालांकि, कई मामलों में, एसएचजी या यूवी-टीपीईएफ सिग्नल की अनुपस्थिति को तर्कसंगत बनाना संभव है, और इन संकेतों की कमी को प्रोटीन क्रिस्टल की उपस्थिति से इनकार नहीं करना चाहिए।

माइक्रोबैच-अंडर-ऑयल प्रारूप उच्च-थ्रूपुट क्रिस्टलोग्राफी के लिए उपयोग की जाने वाली अधिक सामान्य वाष्प प्रसार विधि का विकल्प प्रदान करता है। महत्वपूर्ण रूप से, क्रिस्टलीकरण प्रारूप हिट पहचान39 को प्रभावित करता है, जो उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रयासों के लिए विभिन्न क्रिस्टलीकरण प्रारूपों के उपयोग के लिए एक तर्क प्रदान करता है। स्वचालित इमेजिंग और सोनिक-सक्षम तौर-तरीके 6 सप्ताह के प्रयोगात्मक समय पाठ्यक्रम में प्रोटीन क्रिस्टल की तेजी से पहचान में सहायता करते हैं। अंत में, मार्को पोलो जीयूआई उपयोगकर्ताओं को अनुकूलन के लिए आशाजनक हिट कुओं की पहचान करने के लिए 1,536 स्थितियों से छवियों का तेजी से विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है। एचटीएक्स सेंटर में क्षमताएं, रोबोटिक्स-सक्षम उच्च-थ्रूपुट प्रयोगात्मक सेटअप सहित, विश्लेषण के लिए अत्याधुनिक इमेजिंग और कम्प्यूटेशनल टूल के साथ मिलकर, शोधकर्ताओं को क्रिस्टल-आधारित संरचनात्मक कार्य में एक प्राथमिक बाधा को प्रभावी ढंग से संबोधित करने के लिए सशक्त बनाकर संरचनात्मक जीव विज्ञान समुदाय में एक बड़ा योगदान प्रदान करती हैं: क्रिस्टलीकरण स्थितियों का पता लगाना।

Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या हितों का अन्य टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम क्रिस्टल स्क्रीनिंग के लिए अपने कीमती नमूने हमें सौंपने के साथ-साथ महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया और अनुरोध प्रदान करने के लिए अपने उपयोगकर्ताओं के प्रति आभार व्यक्त करना चाहते हैं, जिन्होंने हमें संरचनात्मक जीव विज्ञान समुदाय की बेहतर सेवा के लिए हमारे संसाधनों को परिष्कृत और विकसित करने में मदद की है। हम एथन होलेमैन, डॉ लिसा जे कीफ और डॉ एरिका डुगुइड को भी स्वीकार करना चाहते हैं, जिन्होंने मार्को पोलो जीयूआई के विकास को संचालित किया। हम एचडब्ल्यूआई सहयोगियों को उनके समर्थन और सुझावों के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, विशेष रूप से डॉ डायना सीएफ मोंटेइरो। हम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, R24GM141256 से वित्त पोषण सहायता स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1536 Well Imp@ct LBR LoBase Greiner Bio-One 790 801
Acetic acid Hampton Research HR2-853
AlumaSeal II Sealing Film Hampton Research HR8-069
Ammonium bromide Molecular Dimensions MD2-100-247
Ammonium chloride Hampton Research HR2-691
Ammonium hydroxide Hampton Research HR2-855
Ammonium nitrate Hampton Research HR2-665
Ammonium phosphate dibasic Hampton Research HR2-629
Ammonium phosphate monobasic Hampton Research HR2-555
Ammonium sulfate Hampton Research HR2-541
Ammonium thiocyanate Molecular Dimensions MD2-100-301
Bicine pH 9.0 Hampton Research HR2-723
Bis-tris propane pH 7.0 Hampton Research HR2-993-08
Calcium acetate Hampton Research HR2-567
Calcium chloride dihydrate Hampton Research HR2-557
CAPS pH 10.0 Rigaku Reagents none given
ClearSeal Film Hampton Research HR4-521
Cobalt sulfate heptahydrate Molecular Dimensions MD2-100-42
Crystal Screen HT screen Hampton Research HR2-130
Formulator Formulatrix
Glycerol Hampton Research HR2-623
Gryphon liquid handling robot Art Robbins Instruments
HEPES pH 7.0 Hampton Research HR2-902-03
HEPES pH 7.5 Hampton Research HR2-902-08
HWI HTX Center sample submission form https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/    
Hydrochloric acid Hampton Research HR2-581
Index HT screen Hampton Research HR2-134
Ionic Liquid screen Hampton Research HR2-214
Lithium bromide Molecular Dimensions MD2-100-312
Lithium chloride Hampton Research HR2-631
Lithium sulfate monohydrate Hampton Research HR2-545
Magnesium acetate tetrahydrate Hampton Research HR2-561
Magnesium chloride hexahydrate Hampton Research HR2-559
Magnesium nitrate hexahydrate Hampton Research HR2-657
Magnesium sulfate heptahydrate Hampton Research HR2-821
Manganese chloride tetrahydrate Millipore Sigma 63535-50G
Manganese sulfate monohydrate Molecular Dimensions MD2-100-310
MARCO Polo GUI download https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/
Matrix Platemate 2 x 3 liquid handling robot Thermo Scientific
MES pH 6.0 Hampton Research HR2-943-09
Mosquito liquid handling robot SPTLabtech
Paraffin Oil/White Mineral Oil Saybolt Viscosity 340-365 at 100 °F  Sigma Aldrich PX0045-3
PEG 1000 Hampton Research HR2-523
PEG 2000 Hampton Research HR2-592
PEG 20000 Hampton Research HR2-609
PEG 3350 Hampton Research HR2-527
PEG 400 Hampton Research HR2-603
PEG 4000 Hampton Research HR2-529
PEG 6000 Hampton Research HR2-533
PEG 8000 Hampton Research HR2-535
PEG/Ion HT screen Hampton Research HR2-139
PEGRx HT screen Hampton Research HR2-086
Plate reservations htslab@hwi.buffalo.edu
Potassium acetate Hampton Research HR2-671
Potassium bromide Hampton Research HR2-779
Potassium carbonate Molecular Dimensions MD2-100-311
Potassium chloride Hampton Research HR2-649
Potassium nitrate Hampton Research HR2-663
Potassium phosphate dibasic Hampton Research HR2-635
Potassium phosphate-monobasic Hampton Research HR2-553
Potassium phosphate-tribasic Molecular Dimensions MD2-100-309
Potassium thiocyanate Hampton Research HR2-695
Rock Imager 1000 with SONICC Formulatrix
Rock Imager 54 Formulatrix
Rubidium chloride Millipore Sigma R2252-10G
SaltRx HT screen Hampton Research HR2-136
Silver Bullets screen Hampton Research HR2-096
Slice pH screen Hampton Research HR2-070
Sodium acetate pH 5.0 Hampton Research HR2-933-15
Sodium bromide Hampton Research HR2-699
Sodium chloride Hampton Research HR2-637
Sodium citrate pH 4.2 Hampton Research HR2-935-01
Sodium citrate pH 5.6 Hampton Research HR2-735
Sodium hydroxide Hampton Research HR2-583
Sodium molybdate dihydrate Molecular Dimensions MD2-100-207
Sodium nitrate Hampton Research HR2-661
Sodium phosphate monobasic Hampton Research HR2-551
Sodium thiosulfate pentahydrate Molecular Dimensions MD-100-307
StockOptions Polymer screen Hampton Research HR2-227
Tacsimate pH 7 Hampton Research HR2-755
TAPS pH 9.0 bioWORLD 40121071
Tris pH 8 Hampton Research HR2-900-11
Tris pH 8.5 Hampton Research HR2-725
ViaFLO 384 Integra
ViaFLO 384 384 channel pipettor head (0.5-12.5µL) Integra
ViaFLO 384 96 channel pipettor head (300µL) Integra
Zinc acetate dihydrate Hampton Research HR2-563

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References

  1. PDB data distribution by experimental method and molecular type. RCSB Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/summary (2022).
  2. Maveyraud, L., Mourey, L. Protein X-ray crystallography and drug discovery. Molecules. 25 (5), 1030 (2020).
  3. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  4. Elbasir, A., et al. DeepCrystal: A deep learning framework for sequence-based protein crystallization prediction. Bioinformatics. 35 (13), 2216-2225 (2019).
  5. Zucker, F. H., et al. Prediction of protein crystallization outcome using a hybrid method. Journal of Structural Biology. 171 (1), 64-73 (2010).
  6. George, A., Wilson, W. W. Predicting protein crystallization from a dilute solution property. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (4), 361-365 (1994).
  7. Jia, Y., Liu, X. -Y. From surface self-assembly to crystallization: prediction of protein crystallization conditions. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6949-6955 (2006).
  8. Slabinski, L., et al. XtalPred: A web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
  9. Abrahams, G. J., Newman, J. BLASTing away preconceptions in crystallization trials. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (3), 184-192 (2019).
  10. Rosa, N., et al. Tools to ease the choice and design of protein crystallisation experiments. Crystals. 10 (2), 95 (2020).
  11. Newman, J., et al. On the need for an international effort to capture, share and use crystallization screening data. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (3), 253-258 (2012).
  12. Lynch, M. L., Dudek, M. F., Bowman, S. E. A searchable database of crystallization cocktails in the PDB: analyzing the chemical condition space. Patterns. 1 (4), 100024 (2020).
  13. Jancarik, J., Kim, S. -H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. Journal of Applied Crystallography. 24 (4), 409-411 (1991).
  14. Carter, C. W. Efficient factorial designs and the analysis of macromolecular crystal growth conditions. Methods. 1 (1), 12-24 (1990).
  15. McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: An alternative strategy for crystallizing macromolecules. Journal of Structural Biology. 156 (3), 387-406 (2006).
  16. McPherson, A., Nguyen, C., Cudney, R., Larson, S. The role of small molecule additives and chemical modification in protein crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (5), 1469-1474 (2011).
  17. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  18. Thakur, A. S., et al. Improved success of sparse matrix protein crystallization screening with heterogeneous nucleating agents. PLoS One. 2 (10), 1091 (2007).
  19. Chayen, N. E., Stewart, P. D. S., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil-a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
  20. Luft, J. R., et al. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 142 (1), 170-179 (2003).
  21. Luft, J. R., Snell, E. H., DeTitta, G. T. Lessons from high-throughput protein crystallization screening: 10 years of practical experience. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 465-480 (2011).
  22. Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. 20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. , (2023).
  23. Segelke, B. W. Efficiency analysis of sampling protocols used in protein crystallization screening. Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 553-562 (2001).
  24. Luft, J. R., Newman, J., Snell, E. H. Crystallization screening: the influence of history on current practice. Acta Crystallographica Section F. 70 (7), 835-853 (2014).
  25. Mlynek, G., Kostan, J., Leeb, S., Djinovic-Carugo, K. Tailored suits fit better: Customized protein crystallization screens. Crystal Growth & Design. 20 (2), 984-994 (2019).
  26. Mueller-Dieckmann, J. The open-access high-throughput crystallization facility at EMBL Hamburg. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (12), 1446-1452 (2006).
  27. Weber, P., et al. High-throughput crystallization pipeline at the crystallography core facility of the Institut Pasteur. Molecules. 24 (24), 4451 (2019).
  28. Lin, Y. What's happened over the last five years with high-throughput protein crystallization screening. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (8), 691-695 (2018).
  29. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55 (4), 379-386 (2011).
  30. Madden, J. T., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Two-photon excited UV fluorescence for protein crystal detection. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 839-846 (2011).
  31. Fleming, A. M., et al. Second harmonic generation interrogation of the endonuclease APE1 binding interaction with G-quadruplex DNA. Analytical Chemistry. 94 (43), 15027-15032 (2022).
  32. Bruno, A. E., et al. Classification of crystallization outcomes using deep convolutional neural networks. PLoS One. 13 (6), 0198883 (2018).
  33. Holleman, E. T., Duguid, E., Keefe, L. J., Bowman, S. E. Polo: An open-source graphical user interface for crystallization screening. Journal of Applied Crystallography. 54 (2), 673-679 (2021).
  34. Niesen, F. H., et al. An approach to quality management in structural biology: Biophysical selection of proteins for successful crystallization. Journal of Structural Biology. 162 (3), 451-459 (2008).
  35. Padayatti, P., Palczewska, G., Sun, W., Palczewski, K., Salom, D. Imaging of protein crystals with two-photon microscopy. Biochemistry. 51 (8), 1625-1637 (2012).
  36. Haupert, L. M., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Modeling the SHG activities of diverse protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (11), 1513-1521 (2012).
  37. Luft, J. R., Grant, T. D., Wolfley, J. R., Snell, E. H. A new view on crystal harvesting. Journal of Applied Crystallography. 47 (3), 1158-1161 (2014).
  38. Bruno, A. E., Soares, A. S., Owen, R. L., Snell, E. H. The use of haptic interfaces and web services in crystallography: An application for a 'screen to beam' interface. Journal of Applied Crystallography. 49 (6), 2082-2090 (2016).
  39. Baldock, P., Mills, V., Stewart, P. S. A comparison of microbatch and vapour diffusion for initial screening of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 168 (1-4), 170-174 (1996).

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इस महीने जोव अंक 193 प्रोटीन क्रिस्टलीकरण उच्च-थ्रूपुट क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग रोबोटिक तरल हैंडलिंग क्रिस्टल इमेजिंग एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी संरचनात्मक जीव विज्ञान
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