Summary
Detta protokoll beskriver kristallisationsscreening med hög genomströmning, allt från 1 536 mikroanalysplattberedning till slutet av ett 6 veckors experimentellt tidsfönster. Detaljer ingår om provuppsättningen, den erhållna avbildningen och hur användare kan utföra analyser med hjälp av ett grafiskt användargränssnitt med artificiell intelligens för att snabbt och effektivt identifiera makromolekylära kristallisationsförhållanden.
Abstract
Röntgenkristallografi är den vanligaste tekniken för att urskilja makromolekylära strukturer, men det avgörande steget att kristallisera ett protein till ett ordnat gitter som är mottagligt för diffraktion är fortfarande utmanande. Kristallisationen av biomolekyler är till stor del experimentellt definierad, och denna process kan vara arbetsintensiv och oöverkomlig för forskare vid resursbegränsade institutioner. Vid National High-Throughput Crystallization (HTX) Center har mycket reproducerbara metoder implementerats för att underlätta kristalltillväxt, inklusive en automatiserad 1 536-brunns mikrobatch-under-oljeplatta-installation med hög genomströmning utformad för att prova en bred bredd av kristallisationsparametrar. Plattor övervakas med hjälp av toppmoderna avbildningsmetoder under 6 veckor för att ge insikt i kristalltillväxt, samt för att exakt urskilja värdefulla kristallträffar. Dessutom effektiviserar implementeringen av en utbildad algoritm för artificiell intelligens för att identifiera kristallträffar, i kombination med ett användarvänligt gränssnitt med öppen källkod för visning av experimentella bilder, processen att analysera kristalltillväxtbilder. Här beskrivs nyckelprocedurerna och instrumenteringen för beredning av cocktails och kristallisationsplattor, avbildning av plattorna och identifiering av träffar på ett sätt som säkerställer reproducerbarhet och ökar sannolikheten för framgångsrik kristallisation.
Introduction
Även i en tid av enorma framsteg inom strukturbiologiska metoder fortsätter röntgenkristallografi att vara en pålitlig och populär metod för att generera högkvalitativa strukturella modeller av makromolekyler. Över 85% av alla tredimensionella strukturella modeller som deponeras i Protein Data Bank (PDB) är från kristallbaserade strukturella metoder (från och med januari 2023). 1 Dessutom är röntgenkristallografi fortfarande oumbärlig för att lösa protein-ligandstrukturer, en avgörande komponent i läkemedelsupptäckten och utvecklingsprocessen2. Trots att proteinkristallisation har förblivit den dominerande strukturbiologiska tekniken i över ett halvt sekel, är metoder för att förutsäga kristallisationssannolikheten baserat på fysikaliska egenskaper3 eller sekvens 4,5 fortfarande i sin linda.
Förutsägelsen av kristallisationsförhållanden är ännu mer oklar; Begränsade framsteg har gjorts för att förutsäga sannolika kristallisationsförhållanden även för modellproteiner 6,7. Andra studier har försökt identifiera kristallisationsförhållanden baserade på proteinhomologi och förhållanden som bryts från PDB 8,9,10. Den prediktiva kraften som finns i PDB är dock begränsad, eftersom endast de slutliga, framgångsrika kristallisationsförhållandena deponeras, vilket av nödvändighet missar de ofta omfattande optimeringsexperiment som krävs för att finjustera kristalltillväxten. Vidare saknar många PDB-poster metadata som innehåller dessa detaljer, inklusive cocktailformler, kristallisationsformat, temperatur och tid för att kristallisera11,12. För många proteiner av intresse är därför det mest tillgängliga sättet att bestämma kristallisationsförhållandena experimentellt, med så många förhållanden som möjligt över ett brett spektrum av kemiska möjligheter.
Flera metoder för att göra kristallisationsscreening så fruktbar och grundlig som möjligt har undersökts med stor effekt, inklusive glesa matriser 13, ofullständig faktoriell screening14, tillsatser 15,16, sådd 17 och kärnbildare 18. National HTX Center vid Hauptman-Woodward Medical Research Institute (HWI) har utvecklat en effektiv pipeline för kristallisationsscreening med hjälp av microbatch-under-oil-metoden19, som använder automatiserad vätskehantering och avbildningsmetoder för att effektivisera identifieringen av initiala kristallisationsförhållanden med relativt minimala prov- och cocktailvolymer (figur 1). Uppsättningen av 1 536 unika cocktails är baserade på förhållanden som tidigare fastställts för att bidra till proteinkristalltillväxt och är utformade för att vara kemiskt olika för att prova ett stort antal möjliga kristallisationsförhållanden20,21,22. Den breda provtagningen av kristallisationsförhållanden ökar sannolikheten för att observera en eller flera kristallisationsledningar.
Få formella analyser av hur många villkor som behövs för screening har dykt upp i litteraturen. En studie fokuserade på urvalslayouten för olika skärmar och fann att slumpmässigt urval av komponenter (liknande en ofullständig faktoriell) representerade den mest grundliga och effektiva provtagningsmetoden23. En annan studie av screening noterade att det har förekommit många fall när den mycket grundliga 1,536-skärmen har gett endast en enda kristallträff24, och en mycket ny studie betonade att de flesta kommersiella skärmar undersamplar kristallisationsutrymmet som är känt för att vara associerat med screeningträffar25. Inte alla kristallisationsledningar kommer att ge en diffraktionskvalitetskristall som är lämplig för datainsamling på grund av inneboende störning inom kristallen, diffraktionsbegränsningar eller kristallbrister; Därför har gjutning av ett bredare nät för förhållanden den extra fördelen att tillhandahålla alternativa kristallformer för optimering.
Formatet för proteinkristallisationsexperiment har också en inverkan på skärmens framgång. Ångdiffusion är den vanligaste inställningen för kristallisationsapplikationer med hög genomströmning och används vid toppmoderna kristallisationscentra, inklusive EMBL Hamburg och Institut Pasteur screeningcentra med hög genomströmning26,27,28. HTX-centret använder mikrobatch-under-oil-metoden; Även om det är mindre vanligt är det en robust metod som minimerar konsumtionen av prov- och kristallisationscocktails20,21,22. En fördel med mikrobatch-under-oil-metoden, särskilt vid användning av en paraffinolja med hög viskositet, är att endast liten avdunstning sker inom droppen under experimentet, vilket innebär att jämviktskoncentrationen uppnås vid droppblandning. Om positiva kristallisationsresultat observeras i mikrobatch-under-oil-metoden är reproduktionen av dessa förhållanden typiskt enklare än i ångdiffusionsinställningar, där kristallisation sker vid någon odefinierad punkt under jämvikten mellan kristallisationsfallet och behållaren. Reproducerbarheten av träffar är önskvärd för kristallisationsmetoder med hög genomströmning, som producerar oöverkomligt små proteinkristaller som vanligtvis behöver optimeras för enkristallröntgenexperiment.
Kristallisationsskärmen med hög genomströmning för lösliga proteiner består av cocktails som tillagas internt, färdiga kommersiella skärmar och internt modifierade kommersiella skärmar22. Cocktailsna utvecklades ursprungligen med hjälp av den ofullständiga faktoriella strategin med tidigare framgångsrika kristallisationscocktails20. Reagenserna i skärmen som är kommersiellt tillgängliga inkluderar matriser av polymerer, kristallisationssalter, PEG och jonkombinationer och skärmar som använder gles matris och ofullständiga faktoriella metoder. Det finns också reagens som modifieras innan de ingår i skärmen: en additiv skärm, en pH- och buffertskärm, en jonisk flytande tillsatsskärm och en polymerskärm.
Kraften i kända kristallisationsförhållanden och strategier har utnyttjats i de 1 536 kristalliseringscocktailsna, tillsammans med fördelarna med mikrobatch-under-oljesystemet för att generera en rörledning som använder automatiserad vätskehantering, automatiserad ljusfältsavbildning och andra ordningens icke-linjära avbildning av kirala kristaller (SONICC). Automatiseringen av både vätskehantering och avbildning ger fördelarna med färre våtlaboratorietimmar och högre reproducerbarhet. Den höga genomströmningen av automatiserad kristallisationsscreening kräver automatisering av processen för övervakning av kristalltillväxt. Dessa framsteg uppnås med toppmodern bildteknik för att hjälpa till att identifiera positiva kristallträffar. Både standard ljusfältsavbildning av plattor, liksom multifotonmetoder för förbättrad detektion, används via ett kristallavbildningssystem med SONICC (figur 2). SONICC kombinerar andra harmoniska generationen (SHG)29 mikroskopi och ultraviolett tvåfotonexciterad fluorescens (UV-TPEF)30 mikroskopi för att detektera mycket små kristaller, liksom de som döljs av fällning. SONICC-avbildningen informerar om brunnarna innehåller protein (via UV-TPEF) och kristaller (via SHG). Utöver den positiva identifieringen av proteinkristaller kan ytterligare information också erhållas med hjälp av toppmoderna avbildningsmetoder. Cocktail-only imaging före provtillsats fungerar som en negativ kontroll; Dessa bilder kan identifiera brunnens utseende före provtillsats, inklusive när det gäller saltkristaller och skräp. Dessutom hjälper SHG och UV-TPEF-avbildning att skilja proteinkristaller från saltkristaller och kan användas för att visualisera protein-nukleinsyrakomplexkomplext material31.
Kristallisationsexperiment med hög genomströmning som genomgår upprepad övervakning via avbildning resulterar i en mycket stor mängd bilder som behöver undersökas. Automatiserade kristallpoängeringsmetoder har utvecklats för att minska belastningen på användaren och öka sannolikheten för att identifiera positiva kristallträffar. HTX-centret deltog i utvecklingen av MAchine Recognition of Crystallization Outcomes (MARCO) poängalgoritm, en tränad djup faltningsarkitektur för neurala nätverk som utvecklats av ett konsortium av akademiska, ideella, statliga och industriella partners för att klassificera brightfield-brunnsbilder32. Algoritmen tränades på nästan en halv miljon ljusfältsbilder från kristallisationsexperiment från flera institutioner med olika kristallisationsmetoder och olika bildgivare. Algoritmen matar ut en probabilistisk poäng som indikerar om en given bild faller i fyra möjliga bildklasser: "kristall", "klar", "fällning" och "annan". MARCO har en rapporterad klassificeringsnoggrannhet på 94,5%. Kristalldetektering förbättras ytterligare med programvara som implementerar algoritmen och tillhandahåller ett grafiskt användargränssnitt (GUI) för tillgänglig och enkel bildvisning, aktiverad med AI-aktiverade poängfunktioner32,33. MARCO Polo GUI är utformat för att fungera sömlöst med installationen av bild- och datahanteringssystemet i HTX Center för att identifiera träffar på skärmen med 1 536 brunnar, med mänskligt engagemang för att undersöka utdata från sorterade listor. Dessutom, som programvara med öppen källkod tillgänglig på GitHub, är GUI lätt tillgänglig för modifiering för att återspegla de specifika behoven hos andra laboratoriegrupper.
Här beskrivs processen att inrätta ett mikrobatch-under-oljeexperiment med hög genomströmning med hjälp av robotvätskehantering för att leverera både cocktail och protein. HTX Center har ett unikt utbud av instrument och resurser som inte finns på andra institutioner, med målet att tillhandahålla screeningtjänster och utbildningsresurser till intresserade användare. Att demonstrera metoderna och kapaciteten hos robotaktiverade tekniker med hög genomströmning kommer att göra det möjligt för samhället att ha kunskap om tillgänglig teknik och fatta beslut för sina egna strukturbestämningsinsatser.
Protocol
1. Förberedelse eller köp av cocktails för sexton 96-brunns djupa brunnsblock
- Förbered internt genererade kemiska cocktails genom att dispensera i 96-brunns djupa brunnsblock (DW). Använd en robotvätskehanterare för att dispensera och blanda stamlösningar av salter, buffertar, polymerer och vatten.
- Förbered internt modifierade kemiska cocktails genom att använda en robotvätskehanterare eller flerkanalig pipett för att lägga till ytterligare komponenter till 96-brunns DW-blockskärmar som har köpts kommersiellt.
- Köp kommersiellt tillgängliga DW-block.
- Förvara märkta 96-brunns DW-block vid -20 ° C i 12-18 månader.
OBS: Cocktails tillagade i steg 1.1. och 1.2. fylla 10/16 96-brunns DW-block och 5/16 96-brunns DW-block används som köpt. Ett 96-brunns DW-block i skärmen är inställt vid tidpunkten för dispensering av plattan med 1 536 brunnar för att undvika utfällning av tillsatsskärmen (se avsnitt 3).
2. Fördela cocktails till tallrikar med 384 brunnar
- Tina DW-blocken med 96 brunnar vid 4 °C över natten. Värm upp till rumstemperatur (20-23 °C) innan du påbörjar beredningen av plattorna med 384 brunnar.
OBS: Rumstemperatur är lämplig för beredning av cocktailplattorna. Det viktigaste vid beredningen av dessa plattor är att undvika utfällningar, vilket kan täppa till vätskehanteringsanordningar och leda till oförutsägbara förändringar i koncentrationerna av cocktailingredienserna. - Blanda blocken noggrant genom inversion efter behov för att lösa upp en eventuell ihållande ogenomskinlig fällning. Om några brunnar innehåller fällning, värm blocken till 30 °C för att lösa upp dem.
- Leverera 50 μL cocktaillösning från fyra 96-brunns DW-block till en 384-brunnsplatta med hjälp av en vätskehanteringsrobot utrustad med en 96-spruta eller pipettorhuvud. De fyra 96-brunns DW-blocken stämplas ut i 384-brunnsplattan så att kvadranterna fylls (t.ex. A1 på 96-DW1 till A1 på 384-plattan1, A1 på 96-DW2 till B1 på 384-plattan1 osv.) (Figur 3).
- Leverera 15 av de 16 DW-blocken med 96 brunnar till plattor med 384 brunnar för förvaring.
- Förvara plattorna med 384 brunnar vid −20 °C i upp till 6 månader för användning vid beredning av plattorna med 1 536 brunnar.
3. Förbereda plattorna med 1 536 brunnar med olja och kristalliseringscocktails
- Leverera 5 μl paraffinolja till varje brunn på en platta med 1 536 brunnar med hjälp av ett robotiserat vätskehanteringssystem med kapacitet för långsam aspiration och leverans. Förvara oljeplattorna vid 4 °C i upp till 6 månader.
- Tina plattorna med 384 brunnar från sektion 2 vid 4 °C över natten. Vänd plattorna för att blanda lösningarna och lösa upp fällningen. Inkubera plattorna vid 30 °C för att lösa upp långlivade fällningar.
- För att förbereda de additiva skärmkomponenterna, använd det slutliga 96-brunns DW-blocket innehållande 0,1 M HEPES pH 6,8, 30% PEG3350 för att blanda med den kommersiella tillsatsskärmen genom att använda antingen en vätskehanteringsrobot eller en flerkanalig pipett.
- Bered de additiva skärmlösningarna genom att dispensera en 1:1-blandning av den buffrade PEG3350-lösningen som beretts i steg 3.3 och tillsatsskärmen till en slutlig volym på 50 μl i lämplig platta med 384 brunnar.
- Använd en vätskehanteringsrobot utrustad med en 384 spruta eller pipettorhuvud för att leverera 200 nL cocktaillösning i varje brunn på plattan med 1 536 brunnar. Stämpla ut fyra 384-brunnsplattor i plattan med 1 536 brunnar så att kvadranterna fylls (t.ex. A1 på 384-plattan1 till A1 på plattan med 1 536 brunnar, A2 på plattan med 384 plattor1 till A3 på plattan med 1 536 brunnar osv.) (Figur 3).
- Centrifugera plattorna vid 150 × g i 5 minuter innan de förvaras vid 4 °C i upp till 4 veckor.
4. Inlämning av prov
- Om du vill skicka ett prov skickar du ett reservationsmeddelande före tidsgränsen för den kommande screeningkörningen. Ange antalet screeningexperiment, namn, PI och institution samt eventuella särskilda hanteringskrav för provet. Screeningkörningar genomförs ungefär en gång i månaden, vilket resulterar i 12 körningar årligen.
- Fyll i ett formulär för inlämning av prover innan du skickar provet.
- För nya användare väljer du ett lösenord som ska användas för att ladda ned kristallisationsbilderna i avsnitt 7.
- För etablerade användare använder du ett befintligt lösenord eller ändrar lösenordet i det här steget.
- Skicka provet i ett 1,5 ml rör. Se till att makromolekylen är homogen och tillräckligt koncentrerad för att främja kristallisation. Använd ett förkristallisationstest, vanligtvis sammansatt av ammoniumsulfat eller PEG 4,000, för att undersöka lämplig provkoncentration genom att observera om de testade provkoncentrationerna resulterar i klara droppar eller fäller ut34.
OBS: Lämpliga kvalitetstester som kan utföras före inlämning av provet för att kontrollera renhet och homogenitet inkluderar bland annat SDS-PAGE, gelfiltrering och dynamisk ljusspridning (DLS). Kristallisation kan påverkas av närvaron av även mindre föroreningar. En provvolym på 500 μL krävs för närvarande för att sätta upp en platta med 1 536 brunnar. Testning pågår för att minska kravet på provvolym.- Undvik att använda buffertkoncentrationer större än 50 mM, liksom fosfater, som kan kristallisera i skärmen.
- Undvik alltför stora löslighetsmedel, inklusive glycerolkoncentrationer större än 10% w/v.
- Förpacka provet för att säkert hålla en lämplig temperatur med torris, våtis eller kylförpackningar i en förseglad behållare.
- Fartygsprovprioritet över natten på måndag-onsdag under körningen.
- Skicka spårningsnumret via e-post när provet har skickats.
5. Provuppställning i de förberedda plattorna med 1 536 brunnar
- Packa upp prover och inkubera omedelbart vid den temperatur som användaren har begärt.
- Efter upptining, centrifugera provet vid 10 000 × g i 2 minuter vid rumstemperatur. Observera provet visuellt för att identifiera utfällning, färg och tillstånd för provet före installationen.
- Värm plattan med 1 536 brunnar till 23 °C och centrifugera vid 150 × g i 5 minuter. Föreställ dig cocktailplattan med brightfield-avbildning som en negativ kontroll.
OBS: Alla plattor avbildas med brightfield-avbildning före provinställning, vilket gör det möjligt att identifiera brunnar som redan har kristaller eller skräp i dem före provtillsats som en negativ kontroll. Vidare möjliggör det identifiering av brunnar där kristallisationscocktailen inte har levererats. Uppvärmning av plattan till rumstemperatur eliminerar kondens på plattans yta, vilket leder till tydliga bilder. - Fördela 200 nL prov till varje brunn i plattan med 1 536 brunnar med hjälp av en vätskehanteringsrobot. Centrifugeringsplattor vid 150 × g och inkubera plattor vid 4 °C, 14 °C eller 23 °C.
OBS: Microbatch under-oil-experiment kan ställas in för hand genom att dispensera proteinet och cocktailen under önskad olja. Det rekommenderas dock att använda minst 1 μL av varje protein och cocktail för att uppnå reproducerbara resultat.
6. Övervaka 1 536-brunnsplattor för kristallbildning
- Efter att provet har lagts till plattorna med 1 536 brunnar, bild med ljusfältsavbildning dag 1 och vecka 1, vecka 2, vecka 3, vecka 4 och vecka 6.
- Utför SONICC-avbildning med SHG och UV-TPEF vid 4-veckorstidpunkten för plattor som inkuberas vid 23 °C och vid 6-veckorstidpunkten för plattor som inkuberas vid 14 °C eller 4 °C.
OBS: Tidpunkten för SONICC-avbildningen är planerad till 4 veckors och 6 veckors tidpunkter för 1 536 mikroanalysplatta med hög genomströmning eftersom kristaller vanligtvis kommer att visas vid dessa tidpunkter. För modifiering av en 96-brunns mikrobatch under olje- eller ångdiffusionsexperiment är det lämpligt att utföra SONICC-avbildningen tidigare i tidsfönstret. - Få tillgång till experimentbilderna som automatiskt har överförts till användarkontot med hjälp av ett internt LIMS-system. Meddela användarna via en automatiserad htslab-e-postdemon att bildbehandling har inträffat.
7. Bildanalys
- Hämta skärmbilderna från HWI ftp-platsen för varje .rar fil.
Bildutmatningen från 1 536-skärmen resulterar i ett antal filer som innehåller ljusfältsbilder, SHG-bilder och UV-TPEF-bilder. Varje bildmodalitet eller tidpunkt är en separat .rar fil. Varje .rar fil, när den packas upp, innehåller en bild från varje brunn på plattan med 1 536 brunnar vid en viss tidpunkt med hjälp av en specifik bildmodalitet.- Använd FileZilla-klienten eller andra alternativ för att komma åt ftp-data.
FileZilla-klienten är det rekommenderade sättet att hantera den stora filöverföringsvolymen för att minimera beräkningskrascher.- Om FileZilla Client måste installeras på användardatorn, ladda ner FileZilla-programvaran.
- Om FileZilla Client redan är installerad eller vid installation, klicka på FileZilla-ikonen för att öppna programvaran.
- Logga in på fjärrftp-servern från FileZilla genom att ange värdftp-webbplatsen, användarnamn och lösenord.
- Ladda ner de .rar filerna till önskad katalog.
- Använd FileZilla-klienten eller andra alternativ för att komma åt ftp-data.
- Använd det AI-aktiverade grafiska användargränssnittet med öppen källkod för att visa, poängsätta och analysera kristalliseringsbilderna.
GUI kan användas på de flesta Windows-, Mac- och Linux-operativsystem (OS), och OS-specifika instruktioner för nedladdning finns på GitHub-webbplatsen. MARCO Polo är ett grafiskt användargränssnitt med öppen källkod som innehåller metadata från kristalliseringsskärmen med hög genomströmning på 1 536 som implementerats vid HTX Center. Den är tillgänglig för alla att ladda ner från GitHub för modifiering för att återspegla de specifika behoven hos andra laboratoriegrupper.- Öppna .rar-filen i det grafiska användargränssnittet när filen har laddats ned (se kompletterande bild S1).
- Klicka på Importera, välj Bilder i rullgardinsmenyn och välj sedan Från Rar Arkiv / Katalog.
- Klicka på Bläddra efter mapp i popup-fönstret och navigera sedan till mappen som innehåller bilderna.
- Välj önskade filer och importera till GUI genom att klicka på Öppna. Vänta tills filerna visas i fönstret Valda banor . Välj en eller flera filer att ladda ner till GUI och klicka på Importera körningar.
- Visa bilden för den första brunnen i fönstret i bildspelsvisaren i GUI genom att klicka på > -symbolen till vänster om provnamnet och sedan välja lämplig läsning genom att dubbelklicka på den (läsningar listas efter datum och typ av bildljusfält, UV-TPEF eller SHG).
- Förstora bilden genom att ändra storlek på hela fönstret. Rutan Bildinformation innehåller information om bilden, inklusive poänginformation (tom tills läsningen har poängsatts). Rutan Cocktailinformation innehåller metadata om cocktailkomponenterna.
- Gå till nästa brunn genom att klicka på knappen Nästa i navigeringspanelen eller trycka på högerpilen på tangentbordet. Navigera till en specifik källa genom att ange brunnsnumret i fönstret Efter brunnsnummer .
- Visa alla läsningar (av de som importerats till GUI) genom att markera rutan Visa alla datum .
- Visa alla spektra (av de som importerats till GUI) genom att markera rutan Visa alla spektra . Klicka på knappen Byt spektrum för att visa varje spektrumbild individuellt.
- Öppna .rar-filen i det grafiska användargränssnittet när filen har laddats ned (se kompletterande bild S1).
- Gör kristallbilderna med MARCO-algoritmen genom att först markera en specifik körning från listan till vänster i fönstret. Klicka sedan på knappen Klassificera vald körning . Visa MARCO-poänginformationen i fönstret Bilddetaljer när en bildläsning har gjorts för alla 1 536 brunnar.
OBS: Klassificering tar vanligtvis mellan 2-5 minuter, beroende på datorns hastighet och tillgängligt minne. Algoritmen genererar poäng som klassificerar innehållet i "kristall", "klar", "fällning" eller "andra" klasser. De numeriska värden som är associerade med varje brunns klassificering återspeglar sannolikheten för att brunnen innehåller objekt i den klassen.- Visa en delmängd av de poängsatta bilderna genom att markera önskad ruta (er) i panelen Bildfiltrering och klicka på knappen Skicka filter . Visa till exempel endast de bilder som klassificeras av MARCO som kristaller genom att markera rutorna Kristaller och MARCO och klicka på Skicka filter.
- Poängsätt kristallbilderna manuellt för att generera uppsättningen "human scored". Tilldela en poäng till en brunn genom att klicka på lämplig knapp ("kristall", "klar", "fällning" eller "andra" knappar finns i klassificeringspanelen längst ner i fönstret). Alternativt kan du använda det numeriska tangentbordet på tangentbordet för att tilldela poängen (1 = "kristall", 2 = "klar", 3 = "fällning", 4 = "annat"). Ange en bild med mänskligt värde som en "favorit" genom att markera Favorit? låda.
OBS: Visa endast de bilder som klassificeras av en människa som kristaller genom att markera rutorna Kristaller och Människa och klicka på Skicka filter. Om du klickar på rutan Favoriter i panelen Filtrering begränsas de returnerade bilderna ytterligare och endast de kristallbilder som också är favoriter returneras av människor som också är favoriter. - Använd fliken Plate Viewer för att visa flera brunnar samtidigt. På den andra fliken Plåtvisare på kontrollpanelen väljer du 16, 64 eller 96 bilder i rullgardinsmenyn i avsnittet Bilder per platta. Använd fliken Bildfiltrering för att gråtona bilder som inte är av intresse. Markera rutan Använd filter för att filtrera bilderna.
OBS: Välj till exempel rutorna "människa" och "kristall", och endast de brunnar som skårades som en kristall av en människa kommer att vara lätt synliga.- Navigera på fliken Plate Viewer genom att klicka på knappen Nästa för att visa nästa uppsättning 16/64/96-bilder. Som standard är bilder som poängsätts som kristaller röda, de som poängsätts som klara är blå, de som poängsätts som fällning är gröna och de som poängsätts som andra är orange. Ändra färgerna med hjälp av rullgardinsmenyerna.
- Välj den information som ska visas på brunnarna genom att markera olika rutor på fliken Etiketter .
- Klicka på Spara vy för att spara en bildfil av den aktuella vyn.
- Klicka på Byt spektrum för att växla mellan ljusfält, SHG och UV-TPEF-bilder för bilden med flera brunnar.
- Klicka på Exportera och välj lämplig filtyp i rullgardinsmenyn för att exportera de poängade filerna för användning i andra program.
CSV-filer (kommaseparerade värden) är kompatibla med kalkylprogram som Microsoft Excel eller Google Sheets. JSON-filer (JavaScript Object Notation) kan öppnas med de flesta textredigerare. PPTX (PowerPoint Presentation) kan användas för att visa bilder från Polo, inklusive en jämförelse av ljusfält, UV-TPEF och SHG-bilder. Filer sparas i .xtal-format för att öppnas igen i MARCO Polo GUI.- Spara en XTAL-fil genom att klicka på Arkiv högst upp på sidan och sedan välja antingen Spara körning eller Spara Kör som. Ange ett filnamn och en katalogplats.
- Öppna .xtal-formatfiler genom att klicka på Importera och välja Bilder och sedan Från sparad körning. Bläddra efter lämplig filplats, klicka på filnamnet och klicka sedan på Öppna.
Representative Results
Resultaten av kristallscreeningexperimentet med 1 536 brunnar består av sju kompletta ljusfältsbilduppsättningar som samlats in dag 0 (negativ kontroll), dag 1, vecka 1, vecka 2, vecka 3, vecka 4 och vecka 6 (figur 4). SONICC-bilder samlas in vid 4-veckorstidpunkten för plattor som inkuberas vid 23 °C och vid 6-veckorstidpunkten för plattor som inkuberas vid 4 °C eller 14 °C. Sammantaget, när ett prov har skickats, kan användarna förvänta sig att få sina plattor inställda inom 1 dag efter ankomst. Bilderna laddas upp när de samlas in. Kristallisationsscreeningexperimentet avslutas efter 6 veckor.
Plattinstallationen med 1 536 brunnar gör att alla screeningexperiment kan utföras inom samma platta, vilket begränsar provförbrukningen och underlättar bildbehandling och direkt jämförelse mellan bildmodaliteter. Representativa resultat för kristalltillväxtens tidsförlopp för ett enda cocktailtillstånd visas i figur 4. Automatiserad plattavbildning under hela experimentets gång möjliggör identifiering av både snabbt och långsamt växande kristaller genom ljusfältsavbildning. UV-TPEF- och SHG-avbildningen möjliggör korsvalidering av de träffar som observerats genom ljusfältsavbildning och indikerar att de observerade kristallerna är proteinhaltiga respektive kristallina (figur 5A, B). Dessutom möjliggör SONICC-avbildning identifiering av kristaller som är visuellt dolda av fällning eller filmer (figur 5C) eller mikrokristaller som annars kan misstas för fällning (figur 5D). För vissa kristaller diskvalificeras inte brist på SHG-signal, eftersom vissa punktgrupper inte producerar en SHG-signal35,36, vilket exemplifieras av den tetragonala thaumatinkristallen i figur 5C. Omvänt bör en brist på UV-TPEF-signal för proteiner som saknar tryptofanrester förväntas. Observationen av UV-TPEF- och SHG-signaler underlättar också identifieringen av icke-proteinsaltkristaller, som kommer att visas i ljusfält och uppvisa en stark positiv SHG-signal men kommer att sakna en UV-TPEF-signal (figur 5E).
Bildanalys för plattinställningen är strömlinjeformad med MARCO Polo GUI, som också buntar ftp-dataöverföringen från HWI-servrarna (som ett alternativ till att överföra filer med FileZilla). MARCO Polo GUI möjliggör lättnavigerad platt- och bildvisning och utför beräkningsbildbedömning med MARCO-algoritmen så att bildresultaten snabbt kan laddas ner, visas och analyseras från HTX Center. MARCO-poängalgoritmen, som implementerad i MARCO Polo GUI, kan göra bilder från hela 1 536-brunnsplattan på mindre än 5 minuter. Bilder som flaggats som kristallina av MARCO-algoritmen kan därefter sorteras av Polo GUI för visning. Eftersom MARCO-algoritmen optimerades för kristallidentifiering och minimering av falska negativa för att inte missa några positiva träffar, kan poängsättningen resultera i falska positiva flaggor. Icke desto mindre resulterar Marcos förmåga att begränsa uppsättningen bilder som behöver undersökas genom att fokusera uppmärksamheten på brunnarna med stor sannolikhet att innehålla kristaller i en betydande minskning av databehandlingsbördan för användarna. Den praktiska implementeringen av algoritmen i den användarvänliga MARCO Polo-visningsplattformen, med dess förmåga att sortera bilder baserat på MARCO-poäng, förbättrar användarens förmåga att analysera datasetet snabbt och att exakt bestämma kristallträffar.
Figur 1: Schematisk bild av ett screeningexperiment med 1 536 brunnar med hög genomströmning utfört vid HTX Center. (1) I detta steg tillsätts 5 μL paraffinolja och 200 nL cocktail till varje brunn (protokollsteg 3.1 och steg 3.5). En tecknad illustration av en brunn som endast innehåller olja och cocktail och en representativ bild visas till höger. (2) Prover anländer till HTX Center (protokollsteg 5.1). 3) I detta steg tillsätts 200 nL prov till varje brunn (protokollsteg 5.4). (4) Alla 1 536 brunnar övervakas över tid med hjälp av ljusfältsavbildning, 5) samt UV-TPEF- och SHG-modaliteterna (protokollsteg 6). 6) Det AI-aktiverade grafiska användargränssnittet med öppen källkod används för att visa, poängsätta och analysera kristallisationsbilderna (protokollsteg 7). Förkortningar: HTX = kristallisation med hög genomströmning; UV-TPEF = UV-två-fotonexciterad fluorescens; SHG = andra harmoniska generationen; AI = artificiell intelligens; GUI = grafiskt användargränssnitt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Enstaka 1 536-brunnsplattor innehållande screeningexperiment, avbildade med hjälp av ljusfält, UV-TPEF och SHG-avbildning. Plattorna med 1 536 brunnar visas med ett amerikanskt öre för skala (överst). Varje screeningexperiment avbildas en gång före installationen och sex gånger efter provtillägg med ljusfältsavbildning (sju totala ljusfältsbilduppsättningar, vänster). Plattorna genomgår UV-TPEF (mitten) och SHG (höger) avbildning vid 4 veckor eller 6 veckor. Förkortningar: UV-TPEF = UV-två-fotonexciterad fluorescens; SHG = andra harmoniska generationen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Schematiskt visande hur plattorna med 1 536 brunnar genereras. Sexton DW-block med 96 brunnar används för att stämpla ut fyra 384-brunnsplattor, där varje kvadrant av varje 384-brunnsplatta fylls genom att dispensera kristallisationscocktails. Fyra DW-block med 96 brunnar fyller en platta med 384 brunnar (mitten). Fyra 384-brunnsplattor används för att stämpla ut den enda 1 536-brunnsplattan (höger). Förkortning: DW = djup brunn. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativt tidsförlopp för en enskild brunn i ett screeningexperiment med 1 536 brunnar. Plattorna avbildas före provinstallationen (dag 0), liksom med ljusfältsavbildning dag 1, vecka 1, vecka 2, vecka 3, vecka 4 och vecka 6. Plattorna som inkuberas vid 23 °C avbildas med SONICC vid vecka 4. Skalstänger = 80 μm (ljusfält), 200 μm (SHG, UV-TPEF). Förkortningar: SONICC = andra ordningens icke-linjära avbildning av kirala kristaller; UV-TPEF = UV-två-fotonexciterad fluorescens; SHG = andra harmoniska generationen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Representativa avbildningsresultat för HT 1 536 kristallscreeningexperiment. Brightfield-, UV-TPEF- och SHG-avbildningsresultat visas för fem exempelbrunnar. (A,B) Proteinkristaller observerade med ljusfält, UV-TPEF och SHG-avbildning är tydligt uppenbara i alla tre avbildningsmetoderna. (C) En proteinkristall som döljs av film vid ljusfältsavbildning är synlig genom UV-TPEF-avbildning; kristallen observeras inte vid SHG-avbildning på grund av punktgruppsinkompatibilitet. d) Exempel på mikrokristaller verifierade genom UV-TPEF- och SHG-avbildning som annars kan betraktas som fällning. (E) Exempel på saltkristaller som verkar kristallina genom ljusfält och SHG-avbildning men som inte uppvisar en UV-TPEF-signal. Skalstänger = 200 μm. Brunnsdiameter = 0,9 mm. Förkortningar: UV-TPEF = UV-två-fotonexciterad fluorescens; SHG = andra harmoniska generationen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Öppna bildfiler i MARCO Polo. Bildfiler kan öppnas i MARCO Polo GUI genom att navigera till Import | Fliken Bilder högst upp (a). Observera att filer också kan överföras via verktyget Från FTP direkt i MARCO Polo (a) eller kan överföras via FileZilla enligt beskrivningen i protokollsteg 7.2. Om du vill importera filer som redan har laddats ned väljer du Bilder | Från rar arkiv / katalog. I popup-fönstret som visas väljer du Bläddra efter mapp (b) och navigerar till filkatalogen där plattbildfilerna sparas. När filerna finns i fönstret Valda sökvägar (c) markerar du en fil och klickar på Importera körningar (d). MARCO Polo GUI identifierar rätt metadata för cocktailfilen som ska importeras med bilderna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Metoden beskriver en pipeline med hög kapacitet för proteinkristallisationsscreening som kräver så lite som 500 μL prov för 1 536 individuella kristallisationsexperiment i mikrobatch-under-olja-formatet. Rörledningen förlitar sig på vätskehanteringsrobotik för att snabbt och reproducerbart hjälpa den experimentella installationen, liksom beräkningsbildanalysresursen MARCO Polo, som är anpassad för att analysera plattbilder med 1 536 brunnar med hjälp av MARCO-algoritmen för att identifiera och isolera kristallträffar.
Den lilla volymen av individuella screeningdroppar (400 nL totalt med ett 1: 1-förhållande av prov: cocktail) innebär att extremt små provvolymer krävs för att identifiera positiva kristallisationsförhållanden. Dessa små droppstorlekar producerar nödvändigtvis små kristaller som inte kan fiskas med traditionell slinga. Metoder har utvecklats för att skörda från de 1 536 plattorna37; Dessutom har plattorna med kristaller använts direkt vid synkrotronkällor för in situ-datainsamling 38. Om en robust metod för att skörda dessa kristaller utvecklades skulle framsteg inom synkrotronteknik och mikrofokuserade strålar ytterligare göra det möjligt att erhålla användbara dataset. Dessutom kan de erhållna kristallerna potentiellt användas som frön för optimeringsinsatser.
SONICC imaging är klart fördelaktigt för att identifiera både små proteinkristaller och proteinkristaller dolda under fällning. Trots dessa fördelar är inte alla provtyper mottagliga för SHG- och UV-TPEF-avbildning. Till exempel kommer proteiner med få eller inga aromatiska tryptofanrester att visa en tvetydig UV-TPEF-signal. Dessutom kommer kristaller i specifika rymdgrupper, inklusive centrosymmetriska grupper eller punktgrupp 432, att detekteras av SHG-avbildning. Prover med fluoroforer stör ibland SHG-signalen, vilket resulterar i att signalen avbryts eller ökad intensitet, vilket innebär att noggrann tolkning av SHG-signaler krävs för metallinnehållande proteiner och proteiner som innehåller fluorescerande delar. I många fall är det emellertid möjligt att rationalisera frånvaron av en SHG- eller UV-TPEF-signal, och bristen på dessa signaler bör inte nödvändigtvis utesluta närvaron av en proteinkristall.
Microbatch-under-oil-formatet ger ett alternativ till den vanligare ångdiffusionsmetoden som används för kristallografi med hög genomströmning. Det är viktigt att kristallisationsformatet påverkar träffidentifiering39, vilket ger en motivering för användningen av olika kristallisationsformat för screeninginsatser med hög genomströmning. Automatiserad avbildning och SONICC-aktiverade modaliteter hjälper till att snabbt identifiera proteinkristaller under hela den 6 veckors experimentella tidskursen. Slutligen gör MARCO Polo GUI det möjligt för användare att snabbt analysera bilder från 1 536 förhållanden för att identifiera lovande träffbrunnar för optimering. Kapaciteten vid HTX-centret, inklusive den robotaktiverade experimentella installationen med hög genomströmning, i kombination med de senaste bild- och beräkningsverktygen för analyser, ger ett stort bidrag till strukturbiologisamhället genom att ge forskare möjlighet att effektivt ta itu med en primär flaskhals i kristallbaserat strukturellt arbete: att hitta kristallisationsförhållanden.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill uttrycka vår tacksamhet till våra användare för att de anförtrott sina värdefulla prover till oss för kristallscreening, samt för att ge kritisk feedback och förfrågningar som har hjälpt oss att förfina och utveckla våra resurser för att bättre tjäna strukturbiologigemenskapen. Vi vill också tacka Ethan Holleman, Dr. Lisa J Keefe och Dr. Erica Duguid, som drev utvecklingen av MARCO Polo GUI. Vi vill tacka HWI-kollegorna för deras stöd och förslag, särskilt Dr. Diana CF Monteiro. Vi erkänner finansieringsstöd från National Institutes of Health, R24GM141256.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1536 Well Imp@ct LBR LoBase | Greiner Bio-One | 790 801 | |
| Acetic acid | Hampton Research | HR2-853 | |
| AlumaSeal II Sealing Film | Hampton Research | HR8-069 | |
| Ammonium bromide | Molecular Dimensions | MD2-100-247 | |
| Ammonium chloride | Hampton Research | HR2-691 | |
| Ammonium hydroxide | Hampton Research | HR2-855 | |
| Ammonium nitrate | Hampton Research | HR2-665 | |
| Ammonium phosphate dibasic | Hampton Research | HR2-629 | |
| Ammonium phosphate monobasic | Hampton Research | HR2-555 | |
| Ammonium sulfate | Hampton Research | HR2-541 | |
| Ammonium thiocyanate | Molecular Dimensions | MD2-100-301 | |
| Bicine pH 9.0 | Hampton Research | HR2-723 | |
| Bis-tris propane pH 7.0 | Hampton Research | HR2-993-08 | |
| Calcium acetate | Hampton Research | HR2-567 | |
| Calcium chloride dihydrate | Hampton Research | HR2-557 | |
| CAPS pH 10.0 | Rigaku Reagents | none given | |
| ClearSeal Film | Hampton Research | HR4-521 | |
| Cobalt sulfate heptahydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-42 | |
| Crystal Screen HT screen | Hampton Research | HR2-130 | |
| Formulator | Formulatrix | ||
| Glycerol | Hampton Research | HR2-623 | |
| Gryphon liquid handling robot | Art Robbins Instruments | ||
| HEPES pH 7.0 | Hampton Research | HR2-902-03 | |
| HEPES pH 7.5 | Hampton Research | HR2-902-08 | |
| HWI HTX Center sample submission form | https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/ | ||
| Hydrochloric acid | Hampton Research | HR2-581 | |
| Index HT screen | Hampton Research | HR2-134 | |
| Ionic Liquid screen | Hampton Research | HR2-214 | |
| Lithium bromide | Molecular Dimensions | MD2-100-312 | |
| Lithium chloride | Hampton Research | HR2-631 | |
| Lithium sulfate monohydrate | Hampton Research | HR2-545 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Hampton Research | HR2-561 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Hampton Research | HR2-559 | |
| Magnesium nitrate hexahydrate | Hampton Research | HR2-657 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Hampton Research | HR2-821 | |
| Manganese chloride tetrahydrate | Millipore Sigma | 63535-50G | |
| Manganese sulfate monohydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-310 | |
| MARCO Polo GUI download | https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/ | ||
| Matrix Platemate 2 x 3 liquid handling robot | Thermo Scientific | ||
| MES pH 6.0 | Hampton Research | HR2-943-09 | |
| Mosquito liquid handling robot | SPTLabtech | ||
| Paraffin Oil/White Mineral Oil Saybolt Viscosity 340-365 at 100 °F | Sigma Aldrich | PX0045-3 | |
| PEG 1000 | Hampton Research | HR2-523 | |
| PEG 2000 | Hampton Research | HR2-592 | |
| PEG 20000 | Hampton Research | HR2-609 | |
| PEG 3350 | Hampton Research | HR2-527 | |
| PEG 400 | Hampton Research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton Research | HR2-529 | |
| PEG 6000 | Hampton Research | HR2-533 | |
| PEG 8000 | Hampton Research | HR2-535 | |
| PEG/Ion HT screen | Hampton Research | HR2-139 | |
| PEGRx HT screen | Hampton Research | HR2-086 | |
| Plate reservations | htslab@hwi.buffalo.edu | ||
| Potassium acetate | Hampton Research | HR2-671 | |
| Potassium bromide | Hampton Research | HR2-779 | |
| Potassium carbonate | Molecular Dimensions | MD2-100-311 | |
| Potassium chloride | Hampton Research | HR2-649 | |
| Potassium nitrate | Hampton Research | HR2-663 | |
| Potassium phosphate dibasic | Hampton Research | HR2-635 | |
| Potassium phosphate-monobasic | Hampton Research | HR2-553 | |
| Potassium phosphate-tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-309 | |
| Potassium thiocyanate | Hampton Research | HR2-695 | |
| Rock Imager 1000 with SONICC | Formulatrix | ||
| Rock Imager 54 | Formulatrix | ||
| Rubidium chloride | Millipore Sigma | R2252-10G | |
| SaltRx HT screen | Hampton Research | HR2-136 | |
| Silver Bullets screen | Hampton Research | HR2-096 | |
| Slice pH screen | Hampton Research | HR2-070 | |
| Sodium acetate pH 5.0 | Hampton Research | HR2-933-15 | |
| Sodium bromide | Hampton Research | HR2-699 | |
| Sodium chloride | Hampton Research | HR2-637 | |
| Sodium citrate pH 4.2 | Hampton Research | HR2-935-01 | |
| Sodium citrate pH 5.6 | Hampton Research | HR2-735 | |
| Sodium hydroxide | Hampton Research | HR2-583 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-207 | |
| Sodium nitrate | Hampton Research | HR2-661 | |
| Sodium phosphate monobasic | Hampton Research | HR2-551 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Molecular Dimensions | MD-100-307 | |
| StockOptions Polymer screen | Hampton Research | HR2-227 | |
| Tacsimate pH 7 | Hampton Research | HR2-755 | |
| TAPS pH 9.0 | bioWORLD | 40121071 | |
| Tris pH 8 | Hampton Research | HR2-900-11 | |
| Tris pH 8.5 | Hampton Research | HR2-725 | |
| ViaFLO 384 | Integra | ||
| ViaFLO 384 384 channel pipettor head (0.5-12.5µL) | Integra | ||
| ViaFLO 384 96 channel pipettor head (300µL) | Integra | ||
| Zinc acetate dihydrate | Hampton Research | HR2-563 |
References
- PDB data distribution by experimental method and molecular type. RCSB Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/summary (2022).
- Maveyraud, L., Mourey, L. Protein X-ray crystallography and drug discovery. Molecules. 25 (5), 1030 (2020).
- Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
- Elbasir, A., et al. DeepCrystal: A deep learning framework for sequence-based protein crystallization prediction. Bioinformatics. 35 (13), 2216-2225 (2019).
- Zucker, F. H., et al. Prediction of protein crystallization outcome using a hybrid method. Journal of Structural Biology. 171 (1), 64-73 (2010).
- George, A., Wilson, W. W. Predicting protein crystallization from a dilute solution property. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (4), 361-365 (1994).
- Jia, Y., Liu, X. -Y. From surface self-assembly to crystallization: prediction of protein crystallization conditions. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6949-6955 (2006).
- Slabinski, L., et al. XtalPred: A web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
- Abrahams, G. J., Newman, J. BLASTing away preconceptions in crystallization trials. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (3), 184-192 (2019).
- Rosa, N., et al. Tools to ease the choice and design of protein crystallisation experiments. Crystals. 10 (2), 95 (2020).
- Newman, J., et al. On the need for an international effort to capture, share and use crystallization screening data. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (3), 253-258 (2012).
- Lynch, M. L., Dudek, M. F., Bowman, S. E. A searchable database of crystallization cocktails in the PDB: analyzing the chemical condition space. Patterns. 1 (4), 100024 (2020).
- Jancarik, J., Kim, S. -H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. Journal of Applied Crystallography. 24 (4), 409-411 (1991).
- Carter, C. W. Efficient factorial designs and the analysis of macromolecular crystal growth conditions. Methods. 1 (1), 12-24 (1990).
- McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: An alternative strategy for crystallizing macromolecules. Journal of Structural Biology. 156 (3), 387-406 (2006).
- McPherson, A., Nguyen, C., Cudney, R., Larson, S. The role of small molecule additives and chemical modification in protein crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (5), 1469-1474 (2011).
- Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
- Thakur, A. S., et al. Improved success of sparse matrix protein crystallization screening with heterogeneous nucleating agents. PLoS One. 2 (10), 1091 (2007).
- Chayen, N. E., Stewart, P. D. S., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil-a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
- Luft, J. R., et al. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 142 (1), 170-179 (2003).
- Luft, J. R., Snell, E. H., DeTitta, G. T. Lessons from high-throughput protein crystallization screening: 10 years of practical experience. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 465-480 (2011).
- Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. 20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. , (2023).
- Segelke, B. W. Efficiency analysis of sampling protocols used in protein crystallization screening. Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 553-562 (2001).
- Luft, J. R., Newman, J., Snell, E. H. Crystallization screening: the influence of history on current practice. Acta Crystallographica Section F. 70 (7), 835-853 (2014).
- Mlynek, G., Kostan, J., Leeb, S., Djinovic-Carugo, K. Tailored suits fit better: Customized protein crystallization screens. Crystal Growth & Design. 20 (2), 984-994 (2019).
- Mueller-Dieckmann, J. The open-access high-throughput crystallization facility at EMBL Hamburg. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (12), 1446-1452 (2006).
- Weber, P., et al. High-throughput crystallization pipeline at the crystallography core facility of the Institut Pasteur. Molecules. 24 (24), 4451 (2019).
- Lin, Y. What's happened over the last five years with high-throughput protein crystallization screening. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (8), 691-695 (2018).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55 (4), 379-386 (2011).
- Madden, J. T., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Two-photon excited UV fluorescence for protein crystal detection. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 839-846 (2011).
- Fleming, A. M., et al. Second harmonic generation interrogation of the endonuclease APE1 binding interaction with G-quadruplex DNA. Analytical Chemistry. 94 (43), 15027-15032 (2022).
- Bruno, A. E., et al. Classification of crystallization outcomes using deep convolutional neural networks. PLoS One. 13 (6), 0198883 (2018).
- Holleman, E. T., Duguid, E., Keefe, L. J., Bowman, S. E. Polo: An open-source graphical user interface for crystallization screening. Journal of Applied Crystallography. 54 (2), 673-679 (2021).
- Niesen, F. H., et al. An approach to quality management in structural biology: Biophysical selection of proteins for successful crystallization. Journal of Structural Biology. 162 (3), 451-459 (2008).
- Padayatti, P., Palczewska, G., Sun, W., Palczewski, K., Salom, D. Imaging of protein crystals with two-photon microscopy. Biochemistry. 51 (8), 1625-1637 (2012).
- Haupert, L. M., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Modeling the SHG activities of diverse protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (11), 1513-1521 (2012).
- Luft, J. R., Grant, T. D., Wolfley, J. R., Snell, E. H. A new view on crystal harvesting. Journal of Applied Crystallography. 47 (3), 1158-1161 (2014).
- Bruno, A. E., Soares, A. S., Owen, R. L., Snell, E. H. The use of haptic interfaces and web services in crystallography: An application for a 'screen to beam' interface. Journal of Applied Crystallography. 49 (6), 2082-2090 (2016).
- Baldock, P., Mills, V., Stewart, P. S. A comparison of microbatch and vapour diffusion for initial screening of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 168 (1-4), 170-174 (1996).
