Summary
Aqui, apresentamos uma adaptação da técnica de captura da conformação cromossômica (3C) em detalhes com ênfase no envolvimento e aprendizagem da graduação.
Abstract
A captura de conformação cromossômica (3C) é uma ferramenta poderosa que gerou uma família de técnicas semelhantes (por exemplo, Hi-C, 4C e 5C, referidas aqui como técnicas 3C) que fornecem informações detalhadas da organização tridimensional da cromatina. As técnicas 3C têm sido utilizadas em uma ampla gama de estudos, desde o monitoramento das mudanças na organização da cromatina em células cancerosas até a identificação de contatos intensificadores feitos com promotores gênicos. Embora muitos dos estudos usando essas técnicas estejam fazendo grandes perguntas sobre o genoma com tipos de amostra intrincados (ou seja, análise de célula única), o que muitas vezes se perde é que as técnicas 3C são fundamentadas em métodos básicos de biologia molecular que são aplicáveis a uma ampla gama de estudos. Ao abordar questões fortemente focadas na organização da cromatina, esta técnica de ponta pode ser usada para melhorar a experiência de laboratório de pesquisa e ensino de graduação. Este artigo apresenta um protocolo 3C e fornece adaptações e pontos de ênfase para implementação em instituições de ensino e pesquisa de graduação.
Introduction
O genoma de um organismo não só contém todos os genes necessários para a função, mas também todas as instruções sobre como e quando usá-los. Isso faz com que regular o acesso ao genoma seja uma das funções mais importantes da célula. Existem muitos mecanismos para controlar a função gênica; no entanto, em seu nível básico, a regulação gênica se resume à capacidade dos fatores de transcrição regulatórios (trans-fatores) de se ligarem às suas sequências específicas de DNA (sequências cis-regulatórias). Esta não é uma habilidade inata; em vez disso, é governada pela organização/estrutura do genoma no núcleo, que controla a disponibilidade/exposição das sequências cis-regulatórias aos trans-fatores 1,2,3. Se os trans-fatores não podem encontrar suas sequências cis-regulatórias, então os trans-fatores não podem executar suas tarefas regulatórias. Isso tornou a compreensão de como os genomas estão organizados no núcleo uma importante fonte de investigação.
É amplamente aceito que, durante a interfase, os cromossomos eucarióticos no núcleo ocupam seu próprio domínio ancorados à lâmina nuclear e à matriz nuclear (Figura 1), tornando o cromossomo mais parecido com uma fatia de pizza do que com um macarrão em um prato de espaguete. Os cromossomos são parcialmente condensados por interações proteína-DNA (cromatina) que torcem e fazem loop de porções do cromossomo. Através de microscopia eletrônica, fluorescência tridimensional do DNA hibridização in situ (FISH) e técnicas de marcação de DNA (i.e., metilação fluorescente e artificial do DNA), domínios inativos da cromatina foram encontrados firmemente embalados ao longo da periferia nuclear 4,5,6, enquanto porções de cromatina ativa menos condensada são encontradas no interior do núcleo 7,8,9, 10º. Esses experimentos fornecem uma visão grande angular da dinâmica cromossômica, mas pouco fazem para capturar as mudanças que ocorrem localmente ao redor dos promotores gênicos observados nos estudos com DNase11,12 e nucleossomo13,14,15.
A chave para desbloquear a dinâmica da cromatina de alta resolução foi a formulação da técnica de mapeamento cromossômico 3D, 3C. A técnica 3C propriamente dita compreende quatro etapas principais: reticulação da cromatina, digestão da cromatina por enzimas de restrição, ligadura da cromatina e purificação do DNA (Figura 2). Os novos fragmentos artificiais de DNA gerados por esse processo podem então ser caracterizados para revelar a estreita associação física entre pedaços linearmente distantes de DNA16. A técnica 3C tornou-se a base para a criação de múltiplas técnicas derivadas que utilizam os passos iniciais do 3C para fazer perguntas mais amplas sobre o genoma (por exemplo, Hi-C, 4C, ChIP-C). Esta família de técnicas 3C identificou que os cromossomos são organizados em múltiplas unidades discretas denominadas domínios topologicamente associados (DATs). As DATs são codificadas no genoma e definidas por alças de cromatina flanqueadas por limites não loopados16,17,18,19. Os limites das DAT são mantidos por dois fatores evolutivamente conservados e ubíquos, incluindo o fator de ligação da TCCCT (CTCF) e a coesão, que impedem que laços dentro de DATs separadosinterajam 16,20. As alças são mediadas pela interação de transfatores com suas sequências regulatórias, assim como a TCCF e a coesão21.
Embora muitos estudos usando tecnologias 3C façam perguntas amplas sobre o genoma e empreguem técnicas complicadas de coleta de amostras, a formulação da técnica 3C é baseada em técnicas básicas de biologia molecular. Isso torna o 3C intrigante para implantação em laboratórios de iniciação científica e ensino. A técnica 3C pode ser empregada para questões focadas menores e é inerentemente flexível para escalar para cima ou para baixo (genes únicos22, cromossomos16 e/ou genomas18), dependendo do foco e direção das perguntas feitas. Essa técnica também tem sido aplicada a uma ampla gama de sistemas modelo7,16,19,23 e tem se mostrado versátil em seu uso. Isso torna o 3C uma excelente técnica para graduandos, na medida em que os alunos podem ganhar experiência em técnicas comuns de biologia molecular, ao mesmo tempo em que ganham experiência valiosa em responder a perguntas direcionadas.
Apresenta-se um protocolo adaptado para preparação de biblioteca 3C baseado em protocolos previamente publicados24,25,26,27. Este protocolo foi otimizado para aproximadamente 1 × 107 células, embora tenha gerado bibliotecas 3C com apenas 1 × 105 células. Este protocolo provou ser versátil e tem sido usado para gerar bibliotecas 3C a partir de embriões de peixe-zebra, linhagens celulares de peixe-zebra e filho-adulto (YA) Caenorhabditis elegans (lombriga). O protocolo também deve ser apropriado para linhagens celulares de mamíferos e, com maior adaptação, leveduras.
O objetivo dessas adaptações é tornar o 3C mais acessível para os graduandos. Tem-se tido o cuidado de utilizar técnicas semelhantes àquelas que podem ser realizadas em um laboratório de ensino de graduação. A técnica 3C oferece muitas oportunidades de aprendizado para os alunos de graduação aprenderem técnicas básicas de biologia molecular que beneficiarão seu desenvolvimento na bancada, na sala de aula e em seus esforços após a graduação.
Protocol
1. Projeto do primer
NOTA: As ferramentas de projeto de primers 3C estão disponíveis on-line28. Alternativamente, cartilhas personalizadas podem ser projetadas pelos alunos (veja abaixo).
- Identificação da localização dos primers
- Abra o UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), selecione o organismo de estudo e pesquise a região do genoma a ser avaliada usando 3C.
- Na próxima janela, ative a trilha enzimática na guia Mapeamento e Sequenciamento abaixo do navegador, clicando em Enzimas Restr.
- Insira a(s) enzima(s) de restrição a ser usada e defina o modo de exibição para embalar. Clique em Enviar.
- Em Variação e Repetições, verifique se RepeatMasker está definido como denso.
- Usando os sites de restrição como guias, identifique os locais de interesse que não estão dentro das regiões repetidas mascaradas (barras pretas). Realce 300 pares de bases (bp) flanqueando a sequência a montante e a jusante ao redor do local de restrição, clicando na posição (faixa mais alta) e arrastando para o comprimento desejado (~600 bp).
- Solte o mouse e uma caixa pop-up aparecerá. Anote a localização genômica, clique em Zoom in e deixe o navegador se reajustar à seleção.
- Passe o mouse sobre a guia Exibir na faixa de opções superior do navegador e, no menu suspenso, selecione DNA.
- Deixe a opção padrão, observe a designação de sequências mascaradas (há uma opção para torná-las N's). Clique em obter DNA.
- A sequência realçada será exibida na janela. Copie e cole esta sequência em Primer3 (https://primer3.ut.ee/).
- Usando as configurações padrão Primer3, gere primers clicando em Selecionar primers.
- Nos resultados, anote a localização da enzima de restrição e selecione primers que criam um produto de PCR de 200-500 pb com o local de restrição localizado no meio.
- Seguindo essas etapas, projete primers de teste de 1 kilobase (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb e 20 kb do(s) local(is) de interesse.
- Para projetar os primers de controle de entrada, repita essas etapas para um site de 1 a 2 kB do local de interesse que não tenha um site de restrição, o que significa que ele nunca é cortado.
- Validação funcional do primer
- Para validar a funcionalidade do primer, configure reações de PCR usando concentrações tituladas de primers e DNA genômico purificado. Seja por meios quantitativos ou semiquantitativos, determine se os primers criam o produto esperado.
- Redesenhar primers que falham na validação.
2. Dia 1
NOTA: O protocolo pode ser pausado (congelado a −20 °C) após a reticulação da cromatina e após a coleta de núcleos. As etapas levam, em média, de 5 a 6 h com os alunos de graduação.
- Coleção de núcleos de C. elegans adulto-jovem (YA) (adaptado de Han et al.29)
- Reticulação da cromatina
- Coletar 5.000 vermes YA em 30 mL de meio M9 em um tubo cônico de 50 mL e girar a 400 × g por 2 min à temperatura ambiente (TR).
- Lave o pellet de minhoca 3x mais com M9 para remover bactérias.
- Retirar o sobrenadante, ressuspender a pastilha de verme em 47,3 mL de M9 contendo 2,7 mL de formaldeído a 37% (2% final) e incubar com agitação (balanço ou nutação) por 30 min em TR.
CUIDADO: Manuseie o formol com cuidado e trabalhe sob uma capa de fumaça com equipamentos de proteção individual adequados (EPI-jaleco, luvas adequadas e proteção ocular). O formaldeído é um irritante que afeta os olhos, nariz, garganta e pulmões. - Gire os vermes a 400 × g por 2 min no RT.
- Retire o sobrenadante e ressuspenda a pastilha de verme em 50 mL de glicina 1 M. Gire os vermes a 400 × g por 2 min no TR.
- Coleção de núcleos
- Ressuspender o pellet de verme em 6 mL de tampão NP resfriado (50 mM HEPES a pH 7,5, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5mM EGTA, 0,1% Tween 20, 0,2 mM DTT, 0,5 mM espermidina, 0,25 mM espermina, 1x inibidor completo de protease).
- Transfira a suspensão de verme para um Dounce solto de 7 mL no gelo. Recupere a amostra 15x e segure no gelo por 5 min.
- Transfira a suspensão do verme para um Dounce de encaixe apertado de 7 mL no gelo. Recupere a amostra 20x e segure no gelo por 5 min.
- Transfira a suspensão do worm para um tubo cônico limpo de 15 mL e adicione tampão NP a 10 mL no total (aproximadamente 4 mL).
- Vórtice a suspensão de vermes em uma configuração alta por 30 s. Incubar a amostra no gelo durante 5 min.
- Repita a etapa anterior.
- Gire a suspensão do worm a 100 × g durante 5 min a 4 °C.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo cônico de 15 mL.
- Verifique se há detritos de vermes na amostra. Visualize 10 μL da amostra com um microscópio de luz. Se houver restos de vermes, gire a amostra a 2.000 × g por 5 min a 4 °C, ressuspenda o pellet em um novo 10 mL de tampão NP e gire a amostra novamente a 100 × g por 5 min a 4 °C. Descarte o pellet, verifique se há restos de vermes no sobrenadante e repita até que a amostra esteja livre de detritos de vermes.
NOTA: Alternativamente, os detritos do verme também podem ser removidos forçando a amostra através de um filtro de células de 40 μm (6x) seguido por um filtro de células de 20 μm (6x). - Se a amostra estiver livre de restos de vermes, pegue 5 μL da amostra, adicione 5 μL de pironina verde de metila (os núcleos serão azuis) e conte os núcleos com um hemocitômetro.
- Girar a amostra a 2.000 × g durante 5 min a 4 °C
- Retire o sobrenadante, coloque as amostras no gelo e prossiga; alternativamente, congele os núcleos e armazene a -80 °C.
- Reticulação da cromatina
- Digestão da cromatina
- Ressuspender os núcleos em 450 μL de água limpa. Transfira os núcleos para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL.
- Para a amostra reticulada, adicione 60 μL de tampão de enzima de restrição 10x DpnII e misture bem.
NOTA: Outras enzimas de restrição que ainda cortam o DNA reticulado podem ser usadas. - Adicionar 15 μL de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10% para permeabilizar os núcleos e incubar com agitação (balanço ou nutação) a 37 °C por 1 h.
CUIDADO: O SDS é irritante e tóxico se ingerido ou absorvido pela pele. Manuseie com cuidado e use EPIs adequados (jaleco, luvas adequadas e proteção ocular). - Extinguir o SDS adicionando 75 μL de Triton X-100 a 20% e incubando com agitação a 37 °C por 1 h.
- Tomar 10 μL da amostra como um controle não digerido. Conservar a 4 °C.
- Adicionar 400 U de DpnII e incubar a 37 °C durante a noite com agitação.
3. Dia 2
OBS: Em média, os graduandos levam 5 h para concluir essas etapas.
- Digestão da cromatina
- Adicionar mais 200 U de DpnII e incubar as amostras durante 4 h a 37 °C com agitação para assegurar a digestão completa da amostra reticulada.
- Tome uma alíquota de 10 μL das amostras como controle da digestão.
- Inactivar caloricamente a enzima de restrição incubando a amostra durante 20 minutos a 65 °C (ou de acordo com as instruções do fabricante). Continue para a etapa 2.1.3.
- Se a enzima não puder ser inactivada pelo calor, adicionar 80 μL de SDS a 10% e incubar a amostra durante 30 min a 65 °C. Em seguida, adicione 375 μL de 20% Triton X-100 e misture em rodopio. Incubar a amostra durante 1 h a 37 °C e continuar até ao passo 2.2.
- Ligadura da cromatina
- Transfira a amostra para um tubo cônico limpo de 50 mL, ajuste o volume da amostra para 5,7 mL com H2O de grau molecular e misture em rodopio.
- Adicionar 700 μL de tampão 10x T4 Ligase e misturar em rodopio.
- Adicione 60 U de T4 DNA Ligase e misture girando.
- Incubar durante a noite a 16 °C.
4. Dia 3
NOTA: Em média, os alunos de graduação levam de 15 a 30 minutos para concluir essas etapas. Após a incubação durante a noite, as amostras podem ser congeladas.
- Digestão de proteínas e reticulação reversa
- Adicionar 30 μL de proteinase K (10 mg/mL) à amostra 3C e incubar a 65 °C durante a noite com agitação. Adicionar 5 μL de proteinase K (10 mg/mL) ao controle não digerido e da digestão e incubar a 65 °C durante a noite com agitação.
5. Dia 4
NOTA: Em média, os graduandos levam de 4 a 5 h para concluir essas etapas.
- Purificação da biblioteca 3C
- Adicionar 30 μL de RNase A (10 mg/mL) à amostra 3C e agitar para misturar. Incubar a amostra durante 45 min a 37 °C.
- Adicionar 7 ml de fenol-clorofórmio à amostra e misturar agitando.
CUIDADO: O fenol-clorofórmio é irritante para a pele e os olhos e pode causar queimaduras se o contato não for tratado. O fenol-clorofórmio deve ser usado em uma capela com proteção ocular adequada e luvas (nitrilo). - Centrifugar a amostra por 15 min a 3.270 × g em RT. Coletar a fase aquosa e transferir para um tubo cônico limpo de 50 mL. Adicionar volumes iguais de clorofórmio e misturar a amostra agitando.
- Centrifugar a amostra por 15 min a 3.270 × g em RT. Coletar a fase aquosa e transferir para um tubo cônico limpo de 50 mL. Adicionar 7,5 mL de H2O de grau molecular, 35 mL de etanol a 100% e (opcional) 7 μL de glicogênio (1 mg/mL). Misturar agitando e incubar a -80 °C até que a amostra esteja congelada.
NOTA: Pode levar 1 h ou mais para a amostra congelar. O protocolo pode ser pausado aqui.- Enquanto a amostra 3C estiver congelando, purifice as amostras controle. Para as amostras de controle, ajustar o volume para 500 μL usando água de grau molecular e adicionar 2 μL de mistura de RNase A (10 mg/mL) agitando o tubo.
- Gire brevemente para coletar a amostra no fundo do tubo. Incubar as amostras durante 45 min a 37 °C.
- Às amostras de controle, adicionar 1 mL de fenol-clorofórmio e misturar agitando os tubos. Centrifugar a amostra por 15 min a 3.270 × g em RT. Coletar a fase aquosa dos controles e colocar em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL.
- Adicionar volumes iguais de clorofórmio e misturar a amostra agitando. Centrifugar a amostra por 15 min a 3.270 × g em RT. Coletar a fase aquosa dos controles e colocar em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL.
- Adicionar 1 mL de etanol a 100% e 2 μL de glicogênio (1 mg/mL). Misture agitando e incube a -80 °C durante 30 minutos.
- Centrifugar a amostra durante 15 min a 3,270 × g a 4 °C. Retire o sobrenadante e adicione 750 μL de etanol 70% resfriado.
- Centrifugar a amostra durante 10 min a 3.270 × g a 4 °C. Retire o sobrenadante e seque as amostras ao ar. Ressuspenda o pellet em 50 μL de grau molecular H2O. Congelar, ou continuar até a etapa 6.
- Centrifugar a amostra durante 60 min a 3.270 × g a 4 °C. Retire o sobrenadante e adicione 10 mL de etanol 70% resfriado. Interrompa e quebre a pelota de DNA agitando a amostra para misturar.
- Centrifugar a amostra durante 30 min a 3.270 × g a 4 °C. Remova o sobrenadante e deixe a amostra secar parcialmente ao ar em RT. Ressuspenda o pellet em 150 μL de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) pipetando para cima e para baixo. Esta é a "Biblioteca 3C".
NOTA: Congele a amostra ou continue para a análise.
6. Dia 5
NOTA: Em média, os graduandos levam de 1 a 2 h para concluir essas etapas.
- Determinação da qualidade da amostra utilizando a curva padrão do primer de controle
- Quantificar a concentração de ADN para a amostra de 3C, bem como para todos os controlos, e ajustar as amostras para 30 μg/μL (se as concentrações o permitirem). Serially as amostras diluídas duas vezes quatro vezes, resultando em cinco diluições para cada amostra (1x, 0,5x, 0,25x, 0,125x, 0,0625x).
NOTA: Se a quantificação não puder ser facilmente feita, dilua em série as amostras conforme indicado acima e prossiga. - Estabelecer reações de PCR para o 3C, controle genômico e controle digerido para cada amostra diluída com os primers controle: 1 μL de DNA, 10 μL de tampão de reação 5x, 1 μL de dNTPs 10 mM, 1 μL de primer controle 10 mM (misto direto e reverso), 1 μL de Taq polimerase e 36 μL de água.
- Seguindo as instruções para o software específico para a máquina de PCR, configure o programa de PCR de curva padrão usando as seguintes condições de ciclagem: 30 s a 98 °C; 30 ciclos de 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C e 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; 4 °C segurar.
- Usando o software, gerar as curvas padrão para as amostras. Depois que o software gerar a curva, anote a eficiência do PCR e o valor de R2 .
- Quantificar a concentração de ADN para a amostra de 3C, bem como para todos os controlos, e ajustar as amostras para 30 μg/μL (se as concentrações o permitirem). Serially as amostras diluídas duas vezes quatro vezes, resultando em cinco diluições para cada amostra (1x, 0,5x, 0,25x, 0,125x, 0,0625x).
- Determinação da concentração de DNA
- Para determinar a concentração de DNA das amostras 3C, compare as amostras com uma amostra de DNA genômico de concentração conhecida. Diluir as amostras para 30 ng/μL e diluir em série o controle genômico de 10 ng/μL a 0,01 ng/μL em duas etapas para criar uma curva padrão.
NOTA: Se a quantificação não puder ser facilmente feita, dilua a amostra 1:10 e prossiga. - Estabelecer as reações de PCR para o 3C, controle genômico e controle digerido para cada amostra diluída com os primers controle: 1 μL de DNA, 10 μL de tampão de reação 5x, 1 μL de dNTPs 10 mM, 1 μL de primer controle 10 mM (mistura direta e reversa), 1 μL de Taq polimerase e 36 μL de água.
- Seguindo as instruções para o software específico para a máquina de PCR, configure o programa de PCR de curva padrão usando as condições de ciclagem da seguinte forma: 30 s a 98 °C; 30 ciclos de 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C e 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; 4 °C segurar.
- Usando o software, gere as curvas padrão para as amostras, plotando as amostras 3C na curva. Comparar a posição da abundância da amostra 3C com a curva padrão criada pelas reações do DNA genômico de concentração conhecida, e ajustar as amostras 3C para 30 ng/μL.
- Para determinar a concentração de DNA das amostras 3C, compare as amostras com uma amostra de DNA genômico de concentração conhecida. Diluir as amostras para 30 ng/μL e diluir em série o controle genômico de 10 ng/μL a 0,01 ng/μL em duas etapas para criar uma curva padrão.
- Determinação da presença ou ausência de interação cromatina
- Estabelecer reações de qPCR com 30 ng da amostra 3C, amostra de controle genômico e amostra de controle digerida: 1 μL de DNA, 10 μL de tampão de reação 5x, 1 μL de dNTPs 10 mM, 1 μL de primer 10 mM (mistura direta e reversa), 1 μL de Taq polimerase e 36 μL de água.
NOTA: As reacções devem ser configuradas utilizando o primer de controlo, os primers de ensaio para loci genómicos individuais e as combinações desejadas dos primers de ensaio (sítio "a" para a frente e sítio "b" para a reversão) para determinar a interacção da cromatina (Figura 3). - Seguindo as instruções para o software da máquina de PCR, configure o programa de PCR da seguinte forma: 30 s a 98 °C; 40 ciclos de 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C e 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; 4 °C segurar.
- Após a execução do PCR, inspecione o gráfico de amplificação. Certifique-se de que as reações de PCR apresentem amplificação exponencial, dobrando a cada ciclo.
Observação : reações que não exibem amplificação exponencial não podem ser analisadas mais. - Seguindo as instruções para o software da máquina de PCR, defina o limiar do experimento de qPCR.
- Exporte os valores de Ct para todas as amostras.
- Determinar a eficiência da digestão utilizando os valores de Ct do primer de ensaio (TP) e do primer de controlo (CP) das amostras de controlo não digerido (UC) e de controlo digerido (DC) utilizando a equação (1).
Porcentagem digerida = 100 -
(1) - Esses valores devem estar na faixa de 80% a 90% de digestão. Registre esses valores (Figura 4A).
- Determinar a interacção relativa da cromatina utilizando os valores de Ct da combinação de primers de ensaio (TPC) e do iniciador de controlo (CP) das amostras de controlo não digerido (UC) e 3C (3C) utilizando a equação (2).
Interação cromatina = 100 -
(2) - Plotar os valores para cada amostra em um gráfico de barras para cada combinação de primers de teste.
- Comparar o sinal das amostras 3C com as amostras de controlo para determinar se a amostra de 3C tem enriquecimento de uma interacção de cromatina específica sobre as amostras de controlo. Amostras 3C que mostram enriquecimento sobre o controle podem ser consideradas condicionalmente positivas e requerem validação usando o sequenciamento de Sanger (Figura 4B).
NOTA: Ao analisar os dados do gráfico, é importante lembrar que, a menos que um "modelo de controle" seja usado (ver discussão), a abundância entre as reações (ou seja, de um conjunto de primers para o próximo) não pode ser comparada.
- Estabelecer reações de qPCR com 30 ng da amostra 3C, amostra de controle genômico e amostra de controle digerida: 1 μL de DNA, 10 μL de tampão de reação 5x, 1 μL de dNTPs 10 mM, 1 μL de primer 10 mM (mistura direta e reversa), 1 μL de Taq polimerase e 36 μL de água.
- Identificação dos produtos 3C
- Execute os produtos de PCR em um gel de agarose a 1,5%.
- Visualize o gel para o tamanho correto dos produtos de PCR usando uma caixa de luz UV ou sistema de documentação de gel.
NOTA: Bibliotecas 3C bem construídas conterão uma gama diversificada de fragmentos de DNA e, apesar da validação prévia dos primers para especificidade, as reações de PCR de bibliotecas 3C têm o potencial de conter muitas bandas (Figura 5A). Isso não impede a análise das bibliotecas 3C. - Excise as bandas do produto correspondentes ao tamanho esperado do fragmento e realize a extração em gel dos produtos de PCR seguindo as instruções de um kit comercial ou do protocolo caseiro descrito abaixo.
CUIDADO: A luz UV é um carcinógeno conhecido, e muito cuidado deve ser tomado para limitar o tempo exposto à luz UV. Proteção ocular resistente aos raios UV, um escudo para espécimes, luvas e um jaleco devem ser usados.- Para construir um cartucho de purificação caseiro, faça um furo no fundo de um tubo de 0,5 mL com uma agulha.
- Embale uma pequena quantidade de algodão de uma bola de algodão no fundo do tubo de 0,5 mL, enchendo não mais do que metade do tubo.
- Colocar o tubo de 0,5 mL em um tubo de 1,5 mL; Certifique-se de que o tubo menor repousa no lábio do tubo maior, não no tubo.
- Corte cuidadosamente um fragmento de gel em pedaços menores e coloque-o no tubo de 0,5 mL do cartucho.
- Coloque o conjunto num congelador de -20 °C durante 5 minutos. Gire o conjunto por 3 min a 13.000 × g em RT.
- Manter o tubo de 1,5 mL com o DNA extraído em tampão e descartar o tubo de 0,5 mL contendo os detritos de agarose.
- O DNA purificado pode ser enviado para o sequenciamento de Sanger usando primers forward e reverse para o fragmento 3C.
- Identificação de contatos de cromatina usando Blat
- Após a conclusão do sequenciamento, determine se as amostras atendem aos padrões de controle de qualidade indicados no relatório de sequenciamento.
- Para sequências que passam pelo QC, abra os arquivos .seq e .ab1 (rastreamento) em um programa de edição de sequenciamento, como Outro Editor de Plasmídeos (ApE), inspecione o arquivo .ab1 em busca de picos de chamada de base claros e edite os picos chamados incorretamente no arquivo .seq.
- Usando o arquivo .seq editado, procure o site DpnII. Dependendo do resultado da sequência, isso deve estar na metade da sequência relatada.
- Para determinar se a sequência é a sequência alvo esperada, destaque o sítio DpnII e um adicional de 30-50 pb da sequência a montante correspondente ao primer forward dos loci genômicos testados para 3C. Realize uma busca Blat desta sequência contra a espécie-alvo. Certifique-se de que os loci genômicos correspondam aos do primer.
- Repita a etapa acima para a sequência de primers reversos, certificando-se de que o locus genômico retornado corresponda ao do primer reverso.
(1)
(2)Representative Results
Este procedimento produzirá uma amostra experimental de 3C e duas amostras controle (não digeridas e digeridas). Utilizando essas três amostras, foi realizada qPCR. A partir desses resultados, a eficiência da digestão foi calculada (equação 1) e registrada (Tabela 1). A partir desses cálculos, determinou-se que a amostra 3C apresentou aproximadamente 88% de eficiência de digestão (média da Tabela 1) nos sete loci genômicos testados.
Em seguida, as amostras foram testadas para a presença de contatos de cromatina de longo alcance entre os diferentes loci genômicos usando combinações de primers loci específicos (Tabela 2) e qPCR. Com esses resultados, as abundâncias de produtos relativas a um conjunto de primers controle foram calculadas (equação 2) e grafadas para comparação (Figura 4). Esses dados indicaram que 8 das 10 reações foram condicionais positivas para interações de longo alcance.
As reações de PCR foram então executadas em gel de agarose. O produto de PCR esperado para os oito positivos condicionais e uma reação negativa foram purificados em gel e enviados para sequenciamento de Sanger. Os resultados para as reações representativas positivas (seta azul, caixa azul) e negativas (seta vermelha, caixa vermelha) são mostrados (Figura 5).
Figura 1: Estrutura cromossômica no núcleo. Organização cromossômica hipotética dentro do núcleo. (A) Envelope nuclear, linhas pretas; (B) lâmina nuclear, laranja; (C) heterocromatina, linhas compactadas; (D) eucromatina, laços soltos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema do protocolo 3C. Porções distantes de cromossomos lineares (azul, amarelo e rosa) são aproximadas dentro do núcleo através de laços regulatórios. (A) As estruturas das alças são mediadas por fatores de transcrição (círculo cinza e estrela preta); Essas interações são preservadas através de reticulação química. (B) As alças são quebradas através da digestão enzimática (linhas pretas). (C) Pedaços distantes de cromatina são ligados entre si através das extremidades de aderência criadas pela digestão. (D) O DNA é purificado a partir de proteínas. (E) A sequência dentro dos fragmentos é identificada e mapeada de volta ao genoma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O esquema de primers 3C. Os primers 3C são projetados em torno de locais de restrição a distâncias variáveis do local genômico de interesse. As setas rosas representam os conjuntos de primers experimentais que circundam um sítio DpnII. Os primers experimentais podem ser misturados e combinados para avaliar o looping da cromatina na região. Os primers laranja representam um controle negativo sem um sítio DpnII. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Dados representativos de qPCR para um experimento 3C. Abundância relativa dos conjuntos de primers teste 3C. (A) Gráfico de controle mostrando a abundância relativa do produto na amostra controle não digerida (azul), controle digerido (cinza) e 3C (laranja). (B) O experimento 3C; a abundância relativa do produto a partir de combinações de primers de teste na amostra controle não digerido (azul), controle digerido (cinza) e 3C (laranja). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Visualização dos produtos 3C qPCR. Superior, gel com os produtos de endpoint qPCR com as amostras indicadas. Abaixo, arquivos de rastreamento de sequência de Sanger representativos para as reações indicadas. A amostra laranja é um exemplo de falso positivo (ver Figura 4, r38/34), e a amostra azul é um exemplo de um verdadeiro positivo com o sítio DpnII indicado acima do traço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Local | % digestão |
| R8 | 86.98 |
| R3 | 88.44 |
| r38 | 89.64 |
| r34 | 87.55 |
| r33 | 87.85 |
| r14 | 86.97 |
| r47 | 89.45 |
Tabela 1: Eficiência de digestão calculada.
| Nome | Seqüenciar | Loci genômicos | ||
| r3 FWD | ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC | chrX:11361475 | ||
| RVS r3 | TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC | chrX:11361561 | ||
| r38 FWD | TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC | chrX:5859700 | ||
| RVS r38 | AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG | chrX:5859775 | ||
| r34 FWD | ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG | chrX:5429702 | ||
| RVS r34 | AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC | chrX:5429777 | ||
| r33 FWD | AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC | chrX:6296704 | ||
| RVS r33 | TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG | chrX:6296807 | ||
| r14 FWD | AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG | chrX:8036367 | ||
| RVS r14 | ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC | chrX:8036427 | ||
| r47 FWD | ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC | chrX:9464939 | ||
| RVS r47 | AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC | chrX:9465064 | ||
| r8 FWD | GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG | chrX:11094257 | ||
| RVS r8 | TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC | chrX:11094362 | ||
| Primer de controle FWD | CAATCGTCTCGCTCACTTGTC | chrX:7608049 | ||
| Primer de controle RVS | GATGTGAGCAACAAGGCACC | chrX:7608166 | ||
Tabela 2: Primers para o experimento representativo 3C.
Discussion
O 3C é uma técnica poderosa que está enraizada em técnicas moleculares básicas. É essa base de ferramentas fundamentais que torna o 3C uma técnica tão intrigante para usar com alunos de graduação. Com tantos estudos recentes observando a dinâmica da cromatina em uma escala tão ampla, usar esses resultados para elaborar um experimento com foco restrito em um único gene ou região genômica tem o potencial de criar um experimento único e impactante na iniciação científica. Muitas vezes, experimentos como esses são considerados muito avançados para os graduandos, mas com um planejamento cuidadoso, eles são facilmente alcançáveis. É importante notar que os ensaios projetados para sondar as conexões de cromatina capturadas pela biblioteca 3C podem variar de PCR semiquantitativo final a sequenciamento do genoma inteiro. Na verdade, os dados do primeiro papel 3C16 foram gerados a partir de qPCR. Essa ampla gama de ensaios pode ser usada porque todas as tecnologias 3C produzem o mesmo produto - uma biblioteca de fragmentos de DNA representando conexões 3D no núcleo.
Apresenta-se aqui uma adaptação de um protocolo mais flexível e acomodado que melhor se adapta aos pesquisadores de graduação. Os períodos de pausa listados acima implicam atrasos durante a noite; No entanto, essas pausas podem se estender por finais de semana e, no caso das células e núcleos, por semanas. A consideração mais crucial é quando o trabalho será feito. Muitas vezes, em protocolos, há etapas sensíveis ao tempo quando a pausa não é uma opção. Fora alguns pontos (dia 1 e dia 2), há muitos lugares para parar e congelar a amostra. Estes são críticos quando se trabalha com estudantes de graduação, onde os horários e horários do trabalho de laboratório precisam ser flexíveis. Além de engendrar essas paradas no protocolo, os graduandos são incentivados a trabalhar em duplas ou mesmo pequenos grupos de três ou quatro. Os grupos funcionam bem para esse protocolo, pois os alunos podem apoiar uns aos outros e criar um sistema de amigos para que todos estejam trabalhando com segurança. O trabalho de laboratório também é mais divertido com os outros envolvidos. Com os grupos, os alunos também podem trabalhar uma variedade de questões focadas na organização da cromatina enquanto ainda realizam o mesmo protocolo. Assim, mesmo enquanto os alunos estão trabalhando em projetos separados, o protocolo vincula seus esforços e, por isso, eles podem apoiar uns aos outros.
Outras adaptações visam contornar o fato de que certas ferramentas e equipamentos especializados não são necessariamente encontrados em todas as instituições de graduação. Esses equipamentos incluem, mas não estão limitados a termocicladores qPCR, sistemas de documentação de gel e espectrômetros de nanovolume. Na verdade, esses equipamentos são convenientes, mas não são uma exigência. Aqui, o método clássico do 3C também é descrito na parte de design do primer; Isso envolve a identificação de um locus genômico de interesse e, a partir disso, a avaliação de outros loci genômicos para pontos de contato com a cromatina mais distantes. Essa técnica também funciona bem se um conjunto de dados publicado for usado, como um conjunto de dados usando Hi-C, onde loci positivos (conectando) e negativos (não conectando) conhecidos são identificados. Projetar experimentos usando esses conjuntos de dados publicados é outra ótima adaptação para laboratórios de ensino, pois a chance de sucesso na identificação de conexões de cromatina é geralmente maior. Além disso, o artigo de pesquisa pode ser discutido em sala de aula e ser utilizado como referência.
Este protocolo usa uma abordagem de qPCR modificada para visualizar a formação do produto 3C. Os controles são essenciais para o sucesso da técnica 3C. Cada experimento usa controles de amostra e controles de primer para determinar a conclusão do procedimento 3C. Os controles da amostra incluem um controle não digerido (DNA genômico) e um controle digerido. O controle não digerido determina o sinal basal para os conjuntos de primers e é usado com o controle de digestão reticulado para determinar a eficiência da digestão Espera-se que haja uma queda no produto para quaisquer primers direcionados através de um local de restrição. A comparação desse valor com o controle não digerido fornece uma indicação de quão bem a amostra foi digerida.
Os primers para a PCR incluem um primer de controle e primers de teste. O primer controle é um conjunto de primers que está próximo à região genômica que está sendo ensaiada e não contém um local de restrição. Isso fornece a linha de base para determinar a abundância dos produtos de PCR do primer de teste. Os primers de teste são primers para frente e para trás que ladeiam um local de restrição para um determinado locus genômico de interesse (Figura 3). As reações usando esses conjuntos de primers são comparadas para determinar a eficiência da digestão, pois a abundância do produto deve cair se o local de restrição tiver sido cortado. Na determinação da organização da cromatina, um primer de teste de um locus é emparelhado com outro primer de teste de um locus genômico diferente para determinar se esses dois loci estão próximos no espaço 3D. Nesse caso, a expectativa é que um produto de PCR só seja encontrado usando a amostra 3C como modelo.
É importante notar que mesmo os primers validados têm a tendência de falhar (Figura 4: conjunto de primers r14). Além disso, os produtos de PCR são frequentemente identificados em reações de controle e em reações nas quais uma conexão de cromatina não é prevista (como o controle digerido, uma vez que não é ligado). Essas instâncias são sequenciadas e falham no QC do Sanger ou retornam sem uma sequência definida (Figura 5). Além disso, os experimentos tradicionais em 3C geram um "modelo de controle", uma amostra de DNA não cruzada, digerida e ligada, que representa todos os possíveis fragmentos ligados que podem ser produzidos com uma determinada quantidade de DNA. O "modelo de controle" desempenha um papel importante na comparação das intensidades dos sinais de qPCR entre dois loci genômicos para determinar se o sinal representa uma interação verdadeira ou apenas uma associação aleatória. Criar um "modelo de controle" pode ser problemático, pois uma grande parte da cromatina que está sendo ensaiada deve ser capturada na forma de um cromossomo artificial e processada junto com as amostras 3C. Garantir tal construção pode não ser viável, e criar uma pode estar fora do escopo de um projeto semestral. Devido a essas dificuldades, sugere-se o uso de um primer controle. O primer de controle não substitui toda a funcionalidade do "modelo de controle", mas ainda fornece a oportunidade de analisar os dados para fazer determinações de "presença" ou "ausência".
Ao realizar qPCR, o uso de quantidades iguais da amostra é importante. Isso deve ser determinado, mesmo usando um nanoespectrofotômetro como uma nanogota, gerando uma curva padrão a partir do DNA genômico de uma concentração conhecida e ajustando as amostras de 3C a essa linha. Essas quantidades devem ser registradas e usadas em PCRs subsequentes. A qualidade da reação de PCR também é importante. Como a PCR é executada em qPCR, a abundância do produto é medida usando fluorescência e registrada. Esta gravação é acessível no gráfico de amplificação. Uma vez terminado o programa, é importante verificar o gráfico de amplificação e garantir que as reações (exceto os controles sem modelo) tenham três fases: uma linha de base, uma exponencial e uma fase de platô/saturação. É importante verificar se as reações têm uma fase exponencial, em particular para a definição do limiar (ver abaixo). Além disso, para amostras diluídas em série, deve haver uma mudança nos valores de Ct consistente com a diluição da amostra (a concentração mais alta terá os menores valores de Ct, enquanto a menor concentração terá os maiores valores de Ct). Amostras que não refletem essa mudança no gráfico de amplificação requerem uma nova diluição ou indicam um problema maior com a formação da amostra 3C. Finalmente, ao gerar a curva padrão, o software PCR calculará a eficiência da PCR e o valor de R2 . A eficiência da PCR deve ser maior que 90%, e o valor de R2 deve ser maior que 0,99. Se qualquer uma dessas condições não for atendida, é provável que algo esteja errado com a amostra ou os primers do PCR.
Após a qPCR, a porcentagem de digestão e a presença de interações 3C podem ser calculadas usando o qPCR Ct para cada reação. Para determiná-los, primeiro, o limiar para a reação de PCR deve ser definido. Isso normalmente é feito usando o software que vem com a máquina qPCR. A definição do limiar definirá a concentração do produto de PCR que será usado para comparar os valores de Ct da amostra. O limiar deve bissetriz as curvas de amplificação das reações de PCR na fase exponencial de amplificação. Somente as reações de PCR com amplificação exponencial podem ser comparadas (neste caso, os primers de controle e as reações de primer teste), pois esta é a única maneira de garantir que as reações estejam amplificando o DNA na mesma taxa e possam ser comparadas fielmente. Ao analisar os gráficos 3C, as reações condicionalmente positivas são identificadas como aquelas com mais produto do que as amostras controle, o controle genômico e o controle da digestão (Figura 4B). No entanto, essas amostras devem ser validadas usando o sequenciamento de Sanger após a purificação em gel do produto de PCR.
Após o sequenciamento de Sanger, as amostras que passam pelo CQ podem ser analisadas usando Blat. O objetivo desta análise é determinar se a amostra possui a sequência de ambos os loci genômicos alvo flanqueando o sítio de restrição (DpnII no caso deste protocolo). Se ambas as sequências forem identificadas, o fragmento 3C pode ser considerado validado. Se os resultados do Blat não retornarem a sequência esperada, isso pode indicar que um ou ambos os primers não são ideais, resultando em um resultado falso positivo de qPCR. Os arquivos de rastreamento para as amostras falso-positivas terão picos de base indefinidos, e os relatórios Seq conterão principalmente "n" chamadas de base.
A validação de Sanger é essencial, pois falsos positivos da formação de produtos de PCR artefactuais são possíveis. Esses falsos positivos podem ser identificados quando os produtos de sequenciamento não têm a sequência alvo esperada ou um sítio DpnII característico de um fragmento 3C adequado (Figura 5). O sequenciamento dos fragmentos de PCR também fornece outro ponto de dados para o experimento e mostra aos alunos que a técnica 3C está identificando loci genômicos distantes que estão se juntando no espaço 3D dentro dos núcleos.
A técnica 3C fornece uma riqueza de técnicas moleculares fundamentais para estudantes de graduação em um procedimento flexível e direto. Esta técnica 3C também é um ponto de partida para as outras técnicas 3C que incorporam sequenciamento de próxima geração (NGS). Esses tipos de experimentos podem expor os graduandos a aspectos importantes da bioinformática e estão enraizados nos princípios básicos aqui descritos. A experiência e o envolvimento na graduação são fundamentais para seu sucesso e desenvolvimento como jovens cientistas. Ao oferecer essas oportunidades, os graduandos podem fortalecer sua compreensão dos princípios básicos e, ao mesmo tempo, construir sua confiança para lidar com técnicas e questões de ponta.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte pela Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence do National Institute of General Medical Sciences dos National Institutes of Health sob o número de concessão P20GM103430 e pelo Bryant Center of Health and Behavioral Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Millapore-Sigma | F8775 | |
| 100% Ethanol | Millapore-Sigma | E7023 | |
| CaCl2 | MP Biomedical | 215350280 | |
| chloroform | Millapore-Sigma | C0549 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millapore-Sigma | COEDTAF-RO | mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
| Dithiothreitol (DTT) | Millapore-Sigma | D0632 | 1 M stock diluted to 500 µM in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
| DpnII | NEB | R0543M | |
| Glycerol | Millapore-Sigma | G9012 | |
| glycine | Millapore-Sigma | G8898 | |
| glycogen | Millapore-Sigma | 10901393001 | |
| HEPES | Millapore-Sigma | H3375 | |
| KCl | Millapore-Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Millapore-Sigma | P5655 | |
| methyl green pyronin | Millapore-Sigma | HT70116 | |
| MgAc2 | Thermoscientific | 1222530 | |
| Na2HPO4 | Millapore-Sigma | S5136 | |
| NaCl | Millapore-Sigma | S9888 | |
| phenol-chloroform | Millapore-Sigma | P3803 | |
| Pronase | Millapore-Sigma | 11459643001 | |
| Proteinase K | IBI Scientific | IB05406 | |
| qPCR Ready mix (Phire Taq etc) | Millapore-Sigma | KCQS07 | |
| RNase A | Millapore-Sigma | R6148 | |
| Sodium Acetate | Millapore-Sigma | S2889 | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Millapore-Sigma | L3771 | |
| Sucrose | Millapore-Sigma | S0389 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1804 | |
| Tris-HCl | Millapore-Sigma | 108319 | |
| Triton X-100 | Millapore-Sigma | T9284 | |
| Trypsin-EDTA | Millapore-Sigma | T4049 |
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