Summary
Kateter üzerinde biyofilmin oluştuğu ve C.albicans ile konakçı arasındaki etkileşimin klinik CRI ile iyi korelasyon gösterdiği C.albicans ile ilişkili kateterle ilişkili enfeksiyonun (CRI) bir fare modelini oluşturduk. Bu model, C.albicans biyofilmle ilişkili CRI için tarama tedavilerine yardımcı olarak klinik dönüşüm için bir temel oluşturur.
Abstract
Kateter ilişkili enfeksiyon (CRI), kateter implantasyonu sırasında candida albicans'ın neden olduğu yaygın bir nozokomiyal enfeksiyondur. Tipik olarak, kateterin dış yüzeyinde biyofilmler oluşur ve hastalar için ölümcül olan yaygın enfeksiyonlara yol açar. Kliniklerde etkili bir önleme ve tedavi yönetimi yoktur. Bu nedenle, önlenmesi ve tedavisi için yeni stratejilerin klinik öncesi taranması için bir CRI hayvan modeli oluşturmak acildir. Bu çalışmada, yaygın olarak kullanılan bir tıbbi kateter olan polietilen kateter, epilasyondan sonra BALB/c farelerinin arkasına yerleştirildi. Candida albicans Gelişmiş yeşil floresan proteini eksprese eden ATCC MYA-2876 (SC5314) daha sonra kateter boyunca cildin yüzeyine aşılandı. 3 gün sonra floresan mikroskop altında kateter yüzeyinde yoğun floresan gözlendi. Taramalı elektron mikroskobu ile kateterin yüzeyinde olgun ve kalın biyofilmler bulundu. Bu sonuçlar, kateter yüzeyinde candida albicans'ın adezyonunu, kolonizasyonunu ve biyofilm oluşumunu gösterdi. Epidermisin hiperplazisi ve deri örneklerinde inflamatuar hücrelerin infiltrasyonu, CRI ile ilişkili derinin histopatolojik değişikliklerini gösterdi. Özetlemek gerekirse, bir fare CRI modeli başarıyla kuruldu. Bu modelin, candida albicans ilişkili CRI için terapötik yönetimin araştırılması ve geliştirilmesinde yardımcı olması beklenmektedir.
Introduction
Son yıllarda biyomedikal materyallerin gelişmesi ve uygulanması ile implant ilişkili enfeksiyonlar zor klinik problemler olarak karşımıza çıkmaktadır 1,2. Kliniklerde tıbbi kateterlerin yaygın olarak uygulanmasıyla, ilgili enfeksiyon ve ölümlerin sayısı her yılçok fazladır 3,4. Kateterle ilişkili bir enfeksiyonun (CRI) yaygın enfeksiyon yolları şunları içerir: (1) cilt yüzeyindeki patojenler vücuda sızar ve kateterin dış yüzeyine yapışır 5,6,7; (2) uygun olmayan aseptik operasyondan türetilen patojenler kateteri istila eder, yapışır ve kolonize olur; (3) kan dolaşımındaki patojenler katetere yapışır ve kolonize olur; (4) patojenik mikroorganizma ile kontamine olmuş ilaçlar.
Candida, CRI 8,9'un üçüncü en yaygın nedenidir. İmplant yüzeyinde biyofilmler oluştuktan sonra kan dolaşımı enfeksiyonuna ve diğer hayatı tehdit eden invaziv kandidiyazise neden olma olasılığı çok yüksektir. Prognoz kötüdür ve mortalite oranı yüksektir2. Santral venöz yerleştirildikten sonra 2 hafta içinde kateter yüzeyinde, birkaç hafta sonra ise kateter lümeninde biyofilm oluştuğu bildirilmektedir10,11.
Tıbbi kateterler üzerinde oluşan Candida albicans (C. albicans) biyofilmleri maya, stroma ve miselyumdan oluşan çift katmanlı bir ağ sergiler12,13. C. albicans biyofilmlerinin oluşumu sadece ilaç direnci ve bağışıklıktan kaçınma13 için bir anahtar değil, aynı zamanda daha fazla hematojen enfeksiyona 2,12 yol açan ve daha ciddi ve hatta yaşamı tehdit eden sonuçlara yol açan yayılmış sporların üretilmesi için hayati önem taşır. C. albicans ile ilişkili CRI, klinik fungal kan dolaşımı enfeksiyonlarının önemli bir nedenidir 7,14 ve santral venöz kateterde C. albicans enfeksiyonu olan hastaların %40'ından fazlası bakteriyemiyedönüşecektir 15.
Amerika Enfeksiyon Hastalıkları Derneği'ne göre, Candida CRI'nin önerilen tedavisi şunları içerir: (1) enfekte kateterin çıkarılması; (2) hastaları 14 günlük sistemik antifungal tedaviye tabi tutmak8; (3) yeni bir kateterin yeniden yerleştirilmesi4. Ancak klinik uygulamalarda kateterler bazen tam olarak çıkarılamamaktadır. Bazı hastalar sadece sistemik antibiyotikler ve antimikrobiyal kilit tedavisi ile tedavi edilebilir ve güçlü yan etkiler eşlik eder16,17.
Orofaringeal kandidiyazis modeli, vajinal kandidiyazis modeli ve kandidiyazisin neden olduğu invaziv sistemik enfeksiyon modeli gibi C. albicans 18,19 klinik CRI ile iyi korelasyon gösterememektedir. Bu nedenle, bu çalışmada, farelerde C. albicans ile ilişkili bir CRI modeli oluşturulmuştur. Klinik olarak yaygın olarak kullanılan polietilen kateterler subkutan implantlarolarak kullanıldı 20,21 ve C. albicans'ın tıbbi kateterlere yapışmasını ve biyofilm oluşumunu simüle etmek için cilt yüzeyine C. albicans aşılandı.
Bu model, farklı terapötiklerin anti-biyofilm etkisini taramak için laboratuvarımızda başarıyla kullanılmıştır22. Ek olarak, kateter enfeksiyonundan sonra C. albicans'ın gecikme tespiti nedeniyle, implante edilen kateter üzerindeki C . albicans kolonilerinin ve biyofilmlerinin sezgisel gözlemini kolaylaştırmak için farelerde gelişmiş yeşil floresan proteini (EGFP) içeren bir C . albicans suşu oluşturuldu ve aşılandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deney hayvanları, erkek BALB/c fareleri (12-16 g), Xi'an Jiaotong Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi, Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nden satın alındı. Tüm prosedürler, SCXK (Shaanxi) 2021-103 lisans numarası ile Xi'an Jiaotong Üniversitesi Kurumsal Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı.
1. Tampon ve ekipman hazırlığı
- Transfect C. albicans yüksek ekspresyonlu plazmid pCaExp ile suşlar.
- ATCC'den C. albicans (SC5314) satın alın. EGFP geninin tam açık okuma çerçevesini içeren yüksek ekspresyonlu bir plazmid pCaExp ile C. albicans'ı transfekte ederek EGFP yüksek ekspresyonlu floresan suşu22'yi elde edin (plazmit haritası Şekil 1'de gösterilmiştir) ve bunu sonraki deneyler için kullanın.
- Kültür, transfekte edilmiş C. albicans suşları .
- Maya ekstraktı pepton dekstroz ortamı (YPD) plakasından ve 5 mL YPD sıvı ortamında (YPD + 50 μg/mL karbenisilin) gece boyunca (30 °C ve 220 rpm) kültürden C. albicans floresan suşunun monoklonal kolonilerini seçin.
- RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjlemeden sonra C. albicans'ı normal salin içinde yeniden süspanse edin.
- Bulanıklığı 0,5 McFarland standardıyla karşılaştırarak C. albicans süspansiyonunun konsantrasyonunu 1 x 108 hücre/mL'ye ayarlayın.
- Cerrahi aletleri hazırlayın.
- Tüm cerrahi aletlerin (makas, forseps, hemostatik forseps, iğne tutucular, dikiş iğneleri) 121°C'de 30 dakika otoklavlandığından emin olun. Steril polietilen kateterler (iç çap: 0.28 mm; dış çap: 0.63 mm) kullanılır.
NOT: Bu çalışmada kullanılan kateterler etilen oksit gazı ile sterilize edildi ve ambalaj 30 dakikadan fazla UV'ye maruz bırakılan ultra temiz bir masada açıldı. Farelerde implantasyondan önce, kontaminasyonu önlemek için kateterler %75 etanole daldırıldı.
- Tüm cerrahi aletlerin (makas, forseps, hemostatik forseps, iğne tutucular, dikiş iğneleri) 121°C'de 30 dakika otoklavlandığından emin olun. Steril polietilen kateterler (iç çap: 0.28 mm; dış çap: 0.63 mm) kullanılır.
2. Bir fare CRI modelinin oluşturulması
NOT: Cerrahi prosedür Şekil 2'de gösterilmiştir.
- 30 BALB/c fareyi (12-16 g, erkek) suya ve yiyeceğe serbest erişim ve 12 saat-12 saat değişen aydınlık ve karanlık döngüsü ile spesifik patojensiz (SPF) koşullarda iklimlendirin.
- 30 BALB/c fareyi rastgele üç gruba ayırın (n = 10 fare/grup): (A) normal kontrol grubu; (B) kateter grubu ( C. albicans olmadan implante edilen kateterler); (C) Model grubu ( C. albicans implante edilmiş kateterler).
- Fareleri% 1-4 izofluran ile uyuşturun ve fareleri yüzüstü pozisyonda bir ameliyat masasına yerleştirin. Doğrultma refleksinin kaybı ve ayak parmağı uyarısına yanıt alınamaması anestezinin başarılı olduğunu doğrular. Saçları çıkarın ve cerrahi bölgeyi üç alternatif iyodofor veya klorheksidin ve alkol peelingi ile sterilize edin.
- Fareleri herhangi bir tedavi görmeden normal kontrol grubunda bırakın ve yiyecek ve suya serbest erişim sağlayın.
- Kateter ve model gruplarındaki fareler için anesteziyi% 3 izofluranda tutun. Ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmemesi nedeniyle yeterli anestezik derinliği onaylayın ve izofluran konsantrasyonunu gerektiği gibi ayarlayın.
- Kateter grubundaki fareler için, bir delik açmak için geri epilasyon alanına intradermal olarak 1 mL'lik steril bir şırınga iğnesi sokun. Şırınga iğnesini çıkardıktan sonra deliğe bir kateter (yaklaşık 1 cm uzunluğunda) yerleştirin.
- Model grubundaki fareler için, ciltte kommensal C. albicans'ı simüle etmek için sırt epilasyon alanına 20 μL C. albicans süspansiyonu pipetleyin.
- Solüsyon cilt tarafından emildikten sonra, adım 2.5'te tarif edilenle aynı prosedürlerle sırt epilasyonlu bölgeye bir kateter yerleştirin.
- Dış ortamda C. albicans'ı simüle etmek için kateter boyunca dokuya 20 μL C. albicans süspansiyonu daha pipetleyin.
- Kateterleri bant ve gazlı bezle sabitleyin ve fareleri beslenmek için kafeslere geri koyun. Tedavinin sonunda, farelere art arda üç gün boyunca analjezi olarak meloksikam (4 mg / kg) enjekte edin.
NOT: Ameliyattan sonra fareler dikkatlice su ve yiyecekle beslendi. Fareler günde iki kez izlendi. Fareler, beslenme güçlüğü, önemli kilo kaybı (% 10-20) ve hipotermi yaşarlarsa IACUC onaylı bir yöntemle ötenazi yapıldı.
3. CRI modelinin değerlendirilmesi
- 3 gün sonra, fareleri% 3 izofluran ile uyuşturun ve servikal çıkık ile kurban edin. Farelerin arkasından kateterleri ve cilt dokusu örneklerini toplayın.
- Elektron mikroskobu ile kateter üzerindeki C. albicans ve biyofilmleri gözlemleyin.
- Kateterleri 48 saat boyunca 4 ° C'de% 2,5 glutaraldehit çözeltisine daldırın. Kateterleri steril PBS ile üç kez durulayın.
- Kateterleri 3 saat boyunca% 1 osmik asit ile sabitleyin ve üç kez steril PBS ile durulayın.
- Kateterler üzerindeki hücreleri, artan konsantrasyonlarda (%50, %70, %80, %90 ve %100, 15 dakika/gradyan) gradyan etanol çözeltisinde kurutun.
- Kateterleri üç kez tert-bütil alkole batırın (her seferinde 30 dakika).
- Kateterleri sıvı nitrojen içinde hızlı bir şekilde dondurun ve numuneyi üreticinin talimatlarına göre bir dondurarak kurutucuda dondurarak kurutun.
- Kateter örneklerini bir iyon ışını biriktirme ile 10 nm altınla püskürtün.
- Taramalı elektron mikroskobu altında (yüksek vakum, 1.5 kV koşullarında) her grubun kateter yüzeyinde C. albicans ve biyofilminin varlığını gözlemleyin ve her gruptaki görüntüleri kaydedin.
- Floresan mikroskobu ile kateter üzerinde C. albicans'ı gözlemleyin.
- Kateterleri 48 saat boyunca 4 ° C'de fiksasyon için% 4 paraformaldehit çözeltisine daldırın.
- 484 nm uyarılma altında bir floresan mikroskobu ile her grubun kateter yüzeyinde C. albicans ve biyofilminin varlığını gözlemleyin ve her gruptaki görüntüleri kaydedin.
NOT: Büyütme 400x'tir. Candida albicans'ın floresansı 490 nm'de uyarma ve 510 nm'de emisyon ile gözlemlenebilir.
- Fare derisinde bulunan C. albicans'ı gözlemleyin.
- Farelerin dorsal deri dokularını 4 saat boyunca 4 ° C'de fiksasyon için% 48 paraformaldehit çözeltisine daldırın.
- Dorsal cilt dokularını artan konsantrasyonlarda (%50, %70, %80, %90 ve %100, 15 dk/gradyan) gradyan etanol çözeltisinde kurutun.
- Susuz kalmış sırt derisi dokularını 55-60 °C'de parafine gömün. Kırılgan dokuları önlemek için sıcaklığa dikkat edin. Mümkün olduğu kadar çok kirliliği gidermek için bu adımı üç kez tekrarlayın (her biri 30 dakika).
- Dorsal cilt dokularını (kalınlık = 5 μm) bir mikrotom ile bölümlere ayırın.
- Slaytları 20 dakika boyunca iki kez ksilene batırarak parafin bölümlerini mumdan arındırın.
- Her seferinde 5 dakika boyunca gradyan etanol (mutlak etanol, %90 etanol, %75 etanol, su) ile elüsyon yoluyla bölümleri yeniden sulandırın.
- Bir kez akan su ve iki kez damıtılmış su ile yıkamadan önce bölümü 15 dakika boyunca periyodik asit çözeltisine batırarak bölümleri periyodik asitle boyayın.
- Bölümleri karanlıkta 30 dakika boyunca bir chevron boyama solüsyonuyla (üreticinin talimatlarına göre) boyayın ve bölümleri 5 dakika akan su altında durulayın.
- Sırasıyla akan su (2-3 dakika), farklılaştırılmış çözelti (5-10 dakika) ve akan su ile yıkamadan önce bölümleri 3-5 dakika hematoksilen çözeltisine daldırın.
- Bölümü nötr sakızla kapatmadan önce bölümleri üç kez etanole (her biri 5 dakika) ve iki kez (her biri 5 dakika) ksilene daldırın.
- Numunenin görüntülerini mikroskopla gözlemleyin ve fare derisindeki C. albicans kalıntılarını analiz edin.
NOT: Büyütme, göz merceği için 10x ve objektif lens için 4x veya 10x'tir.
- Dorsal cilt dokularındaki histopatolojik değişiklikleri gözlemleyin.
- Dorsal cilt dokularını 4 saat boyunca 4 ° C'de fiksasyon için% 48 paraformaldehit çözeltisine daldırın. Dorsal cilt dokularını artan konsantrasyonlarda (%50, %70, %80, %90 ve %100, 15 dk/gradyan) gradyan etanol çözeltisinde kurutun.
- Susuz kalmış dorsal cilt dokularını adım 3.4.3'te açıklandığı gibi parafine gömün.
- Dorsal cilt dokularını (kalınlık = 5 mm) bir mikrotom ile bölümlere ayırın.
- Slaytları 20 dakika boyunca iki kez ksilene batırarak parafin bölümlerini mumdan arındırın.
- Her seferinde 5 dakika boyunca gradyan etanol (mutlak etanol, %90 etanol, %75 etanol, su) ile elüsyon yoluyla bölümleri yeniden sulandırın.
- Şamandıra rengini çıkarmak için musluk suyuyla durulamadan önce bölümleri 4 dakika hematoksilen ile boyayın.
- Slaytları akan su ile durulamadan önce numuneyi% 1 hidroklorik asit-etanol çözeltisi ile ayırt edin.
- Numuneyi 5 dakika boyunca %85 ve %95 etanole batırın ve 3 dakika boyunca eozin çözeltisi ile boyayın.
- Numuneyi gradyan etanol (%70, %90, %95 ve %100) ve her biri 2 dakika ksilene batırarak kurutun.
- Numuneyi nötr reçine ile kapatın.
- Numunenin görüntülerini mikroskopla gözlemleyin ve patolojik değişiklikleri analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kateterler üzerindeki C. albicans ve biyofilmler SEM tarafından izlenebildi. Şekil 322'de görüldüğü gibi, kateter grubundaki polietilen kateterlerin yüzeyi pürüzsüzdü ve yapışmış patojen mikroorganizma gözlenmedi. Bununla birlikte, model grubundaki polietilen kateterlerin yüzeyinde olgun ve yoğun C. albicans biyofilmleri görüldü, bu da C. albicans'ın deney koşulları altında farelerde kateter yüzeyinde başarılı bir şekilde kolonize olabileceğini ve biyofilmler oluşturabileceğini gösterdi. Ayrıca, floresan mikroskobu sonuçları daha da doğrulamıştır (Şekil 4)22. Kateter grubunda polietilen kateterlerin yüzeyinde belirgin bir floresan yoktu. Bununla birlikte, yapışık C. albicans hücreleri tarafından yayılan güçlü floresan, model grubundaki kateter yüzeyinde görüldü. Bu, çok sayıda C. albicans hücresinin kateterlerin yüzeyine yapıştığını gösterdi ve bu da farelerde C. albicans biyofilm ile ilişkili CRI modellerinin başarılı bir şekilde oluşturulduğunu gösterdi.
Fare cilt dokusunun enfeksiyonunu daha sezgisel olarak doğrulamak için Sheff Periodate boyama analizi yapıldı. Klinik araştırmalarda yaygın olarak kullanılan mantar hücrelerinin karbonhidratlarını tespit eder (Şekil 5)22. Normal kontrol ve kateter grubundaki deri dokusu, dokularda C. albicans hücrelerinin yokluğunu gösteren periyodik asit-Schiff (PAS) ile negatif olarak boyandı. Model grubunda az sayıda pozitif PAS ile boyanmış C. albicans hücresi gözlendi ve bu da C. albicans ile ilişkili invazyon ve adezyonun başarılı simülasyonunu doğruladı.
Daha sonra, C. albicans tarafından indüklenen fare cilt dokularındaki patolojik değişiklikler histopatolojik analiz ile değerlendirildi. Şekil 622'de gösterildiği gibi, model grubunda epidermis tabakası önemli ölçüde kalınlaşmış ve derinin iç kısmına kadar uzanmıştır. Enflamasyon infiltrasyonu da görülebiliyordu, bu da C. albicans enfeksiyonunun fare cilt dokusunda belirgin patolojik değişikliklere neden olduğunu gösteriyordu. Kateter grubunda epidermis tabakası, dermis tabakası, yağ bezleri, kıl folikülleri ve diğer yapılar berrak ve eksiksizdi. Normal kontrol grubuna benzer şekilde ödem ve inflamasyon infiltrasyonu gözlenmedi. Bu sonuçlar, kateterin tek başına yerleştirilmesinin cilt dokusunda belirgin değişikliklere neden olmadığını gösterdi. Model grubunun dokularındaki patolojik değişiklikler, C. albicans'ın neden olduğu enfeksiyondan kaynaklandı. Özetle, sonuçlar, C. albicans biyofilmi ile ilişkili bir CRI fare modelinin başarılı bir şekilde kurulduğunu doğrulamaktadır.
Şekil 1: pCaExp plazmid atlası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: C.albicans ile ilişkili CRI fare modelinin prosedürünü gösteren şematik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Her grupta kateterin yüzeyindeki SEM. (A) Kateter grubu; (B) Model grubu (1000x, ölçek çubuğu = 50 μm; 5000x, ölçek çubuğu = 10 μm). Bu rakam Mo ve ark.22'nin izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Her grupta kateter yüzeyi floresan mikroskobu. (A) Kateter grubu; (B) Model grubu (ölçek çubuğu = 100 μm). Bu rakam Mo ve ark.22'nin izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Her gruptaki farelerin arka derisinin H&E boyaması. (A) Kateter grubu; (B) Model grubu; (C) Kontrol grubu, (40x, ölçek çubuğu = 400 μm; 100x, ölçek çubuğu = 200 μm). Bu rakam Mo ve ark.22'nin izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Her gruptaki farelerin arka derisinin PAS boyaması. (A) Kateter grubu; (B) Model grubu; (C) Kontrol grubu, (40x, ölçek çubuğu = 400 μm; 100x, ölçek çubuğu = 200 μm). Model grubunda (kırmızı dikdörtgenler) epidermis tabakasının derinin iç kısmına doğru belirgin kalınlaşma ve genişleme görülebilir. Bu rakam Mo ve ark.22'nin izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRI, klinik pratikte en sık görülen nozokomiyal enfeksiyonlardan biridir23. Epidermis, yağ bezleri ve saç folikülleri gibi cilt uzantılarındaki patojenlerin tümü CRI 23,24'ün olası nedenleridir. Candida, CRI'ye neden olan üçüncü en büyük patojendir ve Candida albicans en yaygın biyofilm enfeksiyonu tipidir25,26. Bu nedenle, ilgili CRI'nin tedavisini ve önlenmesini desteklemek için Candida albicans biyofilm ile ilişkili CRI'nin ilgili bir hayvan modelini oluşturmayı amaçladık.
CRI modelini oluşturmak için, farelerin dorsal derisine az miktarda C. albicans eklendi, bu da C. albicans'ın bir kısmının rutin sterilizasyon ile cildin derin dokularında ve uzantılarında tamamen yok edilemediği klinik durumu simüle etti. Kateterin implantasyonundan sonra, C. albicans ameliyat sırasında dış ortamda C. albicans varlığını taklit etmek için yeniden aşılandı.
Bu çalışmada, model yapımı için biyofilm oluşumundaki zorluk nedeniyle geleneksel C. albicans biyofilm ile ilişkili hayvan modellerinden18,27 daha düşük olan 3 günlük bir zaman noktası seçilmiştir. Bu modelde enfeksiyon sonrası kateter yüzeyinde C. albicans adezyonu ve biyofilm oluşumu görülmüş, SEM ve floresan mikroskobu sonuçları ile kanıtlanmıştır (Şekil 3 ve Şekil 4). Bunun nedeni, bu çalışmada C. albicans konsantrasyonunun 1 × 108 CFU/mL olması ve diğer hayvan modellerinden çok daha yüksek olmasıolabilir 18,27. Ayrıca kateter çevresindeki deri dış ortamla sürekli temas halindedir. CRI'nin karşılaşabileceği aşırı ortamları simüle etmek için, C. albicans ameliyattan sonra tekrar aşılandı.
Enfeksiyonun nüksü genellikle çevre dokularda kalan patojenlerden kaynaklanır 23,28,29. Bu nedenle, dokularda patojenlerin varlığı veya yokluğu CRI için önemlidir. Bu yazıda, cilt dokularında C. albicans kalıntılarını araştırmak için PAS boyaması yapılmıştır. Bu yöntem aynı zamanda yeni terapötik ilaçların veya CRI için yöntemlerin klirens etkisini değerlendirmek için de kullanılabilir.
Sonuç olarak, kateterler üzerinde Candida albicans kolonizasyonunun sezgisel gözlemini kolaylaştırmak için bir fare CRI modeli oluşturmak için eGFP'li bir Candida albicans suşu kullanıldı. Bu suş aynı zamanda Candida albicans ve konakçı hücreler arasındaki etkileşimi, örneğin Candida albicans'ın konakçıya istilası ve yapışması, terapötiklerin anti-Candida albicans etkisi ve bağışıklık tepkisini değerlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, dış ortamdan ve vücuttan elde edilen patojenleri simüle etmek için iki aşamalı bir aşılama yöntemi kullanılmıştır. Enfeksiyondan sonra sonraki mikrobiyal kültürün yapılmadığını belirtmek gerekir. Biyofilmlerin varlığı, kültürlerin düşük duyarlılığında önemli bir faktördür 30,31,32. Önceki raporlar, enfeksiyon sonrası mikrobiyal kültürün düşük duyarlılık, özgüllük ve doğruluğa sahip olduğunu göstermektedir 30,31,32,33,34. Bunun yerine, implant üzerinde biyofilm varlığı daha güvenilir bir indekstir. Bu nedenle, bu çalışmada biyofilm oluşturan Candida albicans'ı görselleştirmek ve tanımlamak için SEM ve floresan mikroskobu kullanılmıştır.
Bununla birlikte, bu model, hastanın zayıflamış bağışıklığı ile kliniklerde gözlenen Candida albicans enfeksiyonu arasındaki etkileşimi simüle etmedi. Model, Candida albicans aşılamasından önce bağışıklığı baskılanmış tedavileri (sürekli glukokortikoid enjeksiyonları gibi)35 düşünebilseydi, klinik durumlarda meydana gelen enfeksiyonları daha iyi simüle etmek mümkün olurdu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu yazıda bildirilen çalışmayı etkilemiş gibi görünebilecek bilinen hiçbir rakip mali çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Shaanxi Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (hibe numarası 2021SF-118) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (hibe numaraları 81973409, 82204631) gelen mali destek için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 Mactutrius turbidibris | Shanghai Lujing Technology Co., Ltd | 5106063 | |
| 2.5% glutaraldehyde fixative solution | Xingzhi Biotechnology Co., Ltd | DF015 | |
| 4 °C refrigerator | Electrolux (China) Electric Co., Ltd | ESE6539TA | |
| Agar | Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd | 01-023 | |
| Analytical balances | Shimadzu | ATX124 | |
| Autoclaves Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Butanol | Tianjin Chemio Reagent Co., Ltd | 200-889-7 | |
| Carbenicillin | Amresco | C0885 | |
| Eclipse Ci Nikon upright optical microscope | Nikon | Eclipse Ts2-FL | |
| Glucose | Macklin | D823520 | |
| Inoculation ring | Thermo Scientific | 251586 | |
| Isoflurane | RWD | 20210103 | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology | P0099 | |
| PAS dye kit | Servicebio | G1285 | |
| Peptone | Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd | 01-001 | |
| Polyethylene catheter | Shining Plastic Mall | PE100 | |
| RWD R550 multi-channel small animal anesthesia machine | RWD | R550 | |
| SEM | Hitachi | TM-1000 | |
| Temperature incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd | ZQTY-50N | |
| Ultrapure water water generator | Heal Force | NW20VF | |
| Ultrasound machine | Do-Chrom | DS10260D | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10023428 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021B |
References
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O.
- Giri, S., Kindo, A. J. A review of Candida species causing blood stream infection. Indian Journal of Medical Microbiology. 30 (3), 270-278 (2012).
- Weinstein, R. A., Darouiche, R. O. Device-associated infections: A macroproblem that starts with microadherence. Clinical Infectious Diseases. 33 (9), 1567-1572 (2001).
- Mermel, L. A., et al. Guidelines for the management of intravascular catheter-related infections. Clinical Infectious Diseases. 32 (9), 1249-1272 (2001).
- Seidler, M., Salvenmoser, S., Müller, F. -M. C. In vitro effects of micafungin against Candida biofilms on polystyrene and central venous catheter sections. International Journal of Antimicrobial Agents. 28 (6), 568-573 (2006).
- Chaves, F., et al. Diagnosis and treatment of catheter-related bloodstream infection: Clinical guidelines of the Spanish Society of Infectious Diseases and Clinical Microbiology and (SEIMC) and the Spanish Society of Spanish Society of Intensive and Critical Care Medicine and Coronary Units (SEMICYUC). Medicina Intensiva. 42 (1), 5-36 (2018).
- Raad, I. I., Bodey, G. P. Infectious complications of indwelling vascular catheters. Clinical Infectious Diseases. 15 (2), 197-208 (1992).
- Paul DiMondi, V., Townsend, M. L., Johnson, M., Durkin, M. Antifungal catheter lock therapy for the management of a persistent Candida albicans bloodstream infection in an adult receiving hemodialysis. Pharmacotherapy. 34 (7), e120-e127 (2014).
- Bouza, E., Guinea, J., Guembe, M. The role of antifungals against candida biofilm in catheter-related candidemia. Antibiotics (Basel). 4 (1), 1-17 (2014).
- Raad, I., et al. Ultrastructural analysis of indwelling vascular catheters: a quantitative relationship between luminal colonization and duration of placement. The Journal of Infectious Diseases. 168 (2), 400-407 (1993).
- Yousif, A., Jamal, M. A., Raad, I. Biofilm-based central line-associated bloodstream infections. Advances in Experimental Medicine and Biology. 830, 157-179 (2015).
- Douglas, L. J. Candida biofilms and their role in infection. Trends in Microbiology. 11 (1), 30-36 (2003).
- Mack, D., et al. Biofilm formation in medical device-related infection. International Journal of Artificial Organs. 29 (4), 343-359 (2006).
- Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (5), 1727-1732 (2004).
- Anaissie, E. J., Rex, J. H., Uzun, O., Vartivarian, S. Predictors of adverse outcome in cancer patients with candidemia. The American Journal of Medicine. 104 (3), 238-245 (1998).
- Fujimoto, K., Takemoto, K. Efficacy of liposomal amphotericin B against four species of Candida biofilms in an experimental mouse model of intravascular catheter infection. Journal of Infection and Chemotherapy. 24 (12), 958-964 (2018).
- Shuford, J. A., Rouse, M. S., Piper, K. E., Steckelberg, J. M., Patel, R. Evaluation of caspofungin and amphotericin B deoxycholate against Candida albicans biofilms in an experimental intravascular catheter infection model. The Journal of Infectious Diseases. 194 (5), 710-713 (2006).
- Koh, A. Y., Köhler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), e35 (2008).
- Tucey, T. M., et al. Glucose homeostasis is important for immune cell viability during candida challenge and host survival of systemic fungal infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Lawrence, E. L., Turner, I. G. Materials for urinary catheters: a review of their history and development in the UK. Medical Engineering & Physics. 27 (6), 443-453 (2005).
- Schumm, K., Lam, T. B. Types of urethral catheters for management of short-term voiding problems in hospitalized adults: a short version Cochrane review. Neurourology and Urodynamics. 27 (8), 738-746 (2008).
- Mo, F., et al. Development and evaluation of a film forming system containing myricetin and miconazole nitrate for preventing candida albicans catheter-related infection. Microbial Drug Resistance. 28 (4), 468-483 (2022).
- Balikci, E., Yilmaz, B., Tahmasebifar, A., Baran, E. T., Kara, E. Surface modification strategies for hemodialysis catheters to prevent catheter-related infections: A review. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 109 (3), 314-327 (2021).
- María, L. T., Alejandro, G. S., María Jesús, P. G. Central venous catheter insertion: Review of recent evidence. Best Practice & Research. Clinical Anaesthesiology. 35 (1), 135-140 (2021).
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O.
- He, Y., et al. Retrospective analysis of microbial colonization patterns in central venous catheters, 2013-2017. Journal of Healthcare Engineering. 2019, 8632701 (2019).
- Mo, F., et al. In vitro and in vivo effects of the combination of myricetin and miconazole nitrate incorporated to thermosensitive hydrogels on C. albicans biofilms. Phytomedicine. 71, 153223 (2020).
- Cantón-Bulnes, M. L., Garnacho-Montero, J. Practical approach to the management of catheter-related bloodstream infection. Revista Espanola de Quimioterapia. 32 Suppl 2 (Suppl 2), 38-41 (2019).
- Böhlke, M., Uliano, G., Barcellos, F. C. Hemodialysis catheter-related infection: prophylaxis, diagnosis and treatment. The Journal of Vascular Access. 16 (5), 347-355 (2015).
- Fang, X., et al. Effects of different tissue specimen pretreatment methods on microbial culture results in the diagnosis of periprosthetic joint infection. Bone & Joint Research. 10 (2), 96-104 (2021).
- Naumenko, Z. S., Silanteva, T. A., Ermakov, A. M., Godovykh, N. V., Klushin, N. M. Challenging diagnostics of biofilm associated periprosthetic infection in immunocompromised patient: A clinical case. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 7 (5), 786-790 (2019).
- Cai, Y., et al. Metagenomic next generation sequencing improves diagnosis of prosthetic joint infection by detecting the presence of bacteria in periprosthetic tissues. International Journal of Infectious Diseases. 96, 573-578 (2020).
- Samanipour, A., Dashti-Khavidaki, S., Abbasi, M. R., Abdollahi, A. Antibiotic resistance patterns of microorganisms isolated from nephrology and kidney transplant wards of a referral academic hospital. Journal of Research in Pharmacy Practice. 5 (1), 43-51 (2016).
- Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans. Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).
- Garlito-Díaz, H., et al. A new antifungal-loaded sol-gel can prevent candida albicans prosthetic joint infection. Antibiotics (Basel). 10 (6), 711 (2021).
