Summary
Denne artikel præsenterer en protokol til rettet differentiering og funktionel analyse af β-cellelignende celler. Vi beskriver optimale dyrkningsbetingelser og passager for humane pluripotente stamceller, før der genereres insulinproducerende bugspytkirtelceller. Den seks-trins differentiering skrider frem fra endelig endodermdannelse til funktionelle β-cellelignende celler, der udskiller insulin som reaktion på glukose.
Abstract
Humane pluripotente stamceller (hPSC'er) kan differentiere sig til enhver form for celle, hvilket gør dem til en fremragende alternativ kilde til humane bugspytkirtel-β-celler. hPSC'er kan enten være embryonale stamceller (hESC'er) afledt af blastocysten eller inducerede pluripotente celler (hiPSC'er), der genereres direkte fra somatiske celler ved hjælp af en omprogrammeringsproces. Her præsenteres en videobaseret protokol for at skitsere de optimale dyrknings- og passagebetingelser for hPSC'er forud for deres differentiering og efterfølgende generering af insulinproducerende bugspytkirtelceller. Denne metode følger seks-trins processen for β-celle rettet differentiering, hvor hPSC'er differentierer sig til endelig endoderm (DE), primitivt tarmrør, bageste foregut skæbne, pancreas forfædre, pancreas endokrine forfædre og i sidste ende pancreas β-celler. Det er bemærkelsesværdigt, at denne differentieringsmetode tager en periode på 27 dage at generere humane β-celler i bugspytkirtlen. Potentialet for insulinsekretion blev evalueret gennem to forsøg, som omfattede immunfarvning og glucosestimuleret insulinsekretion.
Introduction
Humane pluripotente stamceller (hPSC'er) har den unikke evne til at differentiere sig til forskellige celletyper, hvilket gør dem til et levedygtigt alternativ til humane bugspytkirtel-β-celler1. Disse hPSC'er er kategoriseret i to typer: embryonale stamceller (hESC'er), afledt af blastocyst2, og inducerede pluripotente celler (hiPSC'er), genereret ved omprogrammering af somatiske celler direkte3. Udviklingen af teknikker til differentiering af hPSC'er i β-celler har vigtige konsekvenser for både grundforskning og klinisk praksis 1,4. Diabetes mellitus er en kronisk sygdom, der rammer >400 millioner mennesker verden over og skyldes kroppens manglende evne til at regulere glykæmi på grund af funktionsfejl eller tab af β-celler i bugspytkirtlen5. Den begrænsede tilgængelighed af bugspytkirteløceller til transplantation har hindret udviklingen af celleerstatningsterapier til diabetes 2,4,6,7. Evnen til at generere glukoseresponsive insulinudskillende celler ved hjælp af hPSC'er tjener som en nyttig cellulær model til undersøgelse af menneskelig øudvikling og funktion. Det kan også bruges til at teste potentielle terapeutiske kandidater til diabetesbehandling i et kontrolleret miljø. Desuden har hPSC'er potentialet til at producere bugspytkirteløceller, der er genetisk identiske med patienten, hvilket reducerer risikoen for immunafstødning efter transplantation 2,4,7.
I de senere år har der været betydelige fremskridt i forfiningen af hPSC-kultur og differentieringsprotokoller, hvilket resulterer i øget effektivitet og reproducerbarhed af differentieringsprocessen mod generering af bugspytkirtel-β-celler 8,9.
Følgende protokol skitserer de væsentlige stadier af rettet differentiering af β-celler i bugspytkirtlen. Det indebærer regulering af specifikke cellesignalveje på forskellige tidspunkter. Den er baseret på protokollen udviklet af Sui L. et al.10 (2018) til generering af hPSC'er i β-celler i bugspytkirtlen. Protokollen blev justeret til nylige opdateringer fra Sui L. et al.11 (2021), da den seneste forskning understreger betydningen af at bruge aphidicolin (APH) behandling for at forbedre differentieringen af β-celler. Den nuværende protokol omfatter tilsætning af APH til mediet i de senere faser af processen. Desuden er der foretaget ændringer i substratets sammensætning i de tidlige stadier af differentiering sammenlignet med den oprindelige protokol. En bemærkelsesværdig ændring er tilføjelsen af keratinocytvækstfaktor (KGF) på dag 6 og fortsætter indtil dag 8. Keratinocytvækstfaktoren (KGF) introduceres fra dag 6 til dag 8, hvilket adskiller sig lidt fra den oprindelige protokol10, hvor KGF ikke var inkluderet i trin 4-mediet.
Det første og væsentlige trin i dannelsen af β-cellelignende celler er den rettede differentiering af hPSC'er til endelig endoderm (DE), et primitivt kimlag, der giver anledning til epitelforing af forskellige organer, herunder bugspytkirtlen. Efter dannelsen af DE gennemgår cellerne differentiering i det primitive tarmrør, som efterfølges af specifikationen af den bageste foregutskæbne. Den bageste fortarm udvikler sig derefter til pancreas stamceller, som har potentiale til at differentiere sig til alle celletyper i bugspytkirtlen, herunder de endokrine og eksokrine celler. Den efterfølgende fase i processen involverer pancreas endokrine forfædre, hvilket giver anledning til de hormonudskillende celler, der findes i øerne Langerhans. I sidste ende når differentieringsprocessen sit sidste stadium ved at producere fuldt funktionelle bugspytkirtel- β-cellelignende celler 9,10. Det er vigtigt at bemærke, at denne proces er kompleks og ofte kræver optimering af dyrkningsbetingelserne, såsom specifikke vækstfaktorer og ekstracellulære matrixkomponenter, for at forbedre effektiviteten og specificiteten af differentiering 9,10. Desuden er generering af funktionelle β-cellelignende celler fra hPSC'er in vitro stadig en stor udfordring. Igangværende forskning fokuserer på at forbedre differentieringsprotokoller og forbedre modningen og funktionen af de resulterende β-celler9.
I denne protokol er brugen af blid celledissociation under dyrkning og passage af hPSC'er afgørende for at opretholde cellelevedygtighed og pluripotens, hvilket signifikant forbedrer effektiviteten af differentiering i bugspytkirtlen β-celler. Derudover er hvert trinspecifikt medium blevet omhyggeligt optimeret efter protokollen udviklet af Sui L. et al.10 for at fremme et højt udbytte af insulinudskillende celler i klynger, der ligner den menneskelige ø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før differentiering påbegyndes, anbefales det at bestemme det krævede antal ølignende organoider til eksperimentelle formål. I en 6-brøndsplade består en enkelt brønd med over 80% sammenløb typisk af 2-2,3 millioner hPSC'er. Mens en nøjagtig forudsigelse er udfordrende på grund af variationer i hPSC-linjer og differentieringseffektivitet, er et groft skøn 1,5 gange antallet af indledende brønde. En effektivt rettet differentiering giver normalt 1,6 til 2 millioner celler pr. brønd i seks-brøndplader, der omfatter alle celler i klyngerne snarere end udelukkende insulinproducerende celler. For en 50 μm klynge kan den tilnærmes til at indeholde omkring 10.000 celler. Tabel 1 giver et resumé af den mediesammensætning, der anvendes til hver dag/trin af rettet differentiering oven på stamcellematrix og medium sammen med den glukosestimulerede insulinsekretionsbuffer.
1. Overførsel af humane pluripotente stamceller før differentiering i 6 brøndplader
BEMÆRK: En passende overførsel af humane stamceller inden differentiering til β-cellelignende celler er et afgørende skridt i etableringen af den eksperimentelle proces. Forkert passagefortynding eller fastgørelsescellenummer kan kompromittere differentieringseffektivitet og troskab.
- Forbered stamcellekulturmedium, belægning og dissociationsopløsninger (som angivet i tabel 1).
- 1-2 timer før passering belægges en plade med seks brønde med kold belægningsopløsning (1 ml pr. hul) og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2.
- En prøve stamcellekulturmedium opvarmes ved stuetemperatur (15-25 °C) i 20 min.
- Opsug stamcellemediet og tilsæt 1 ml calcium/magnesiumfri D-PBS.
- Gentag trin 1.4. to gange.
BEMÆRK: D-PBS tilsættes for at vaske cellerne og fjerne det forrige medium og forbindelser. Det er vigtigt at bemærke, at der ikke kræves nogen specifik tidsramme for vasketrinnene, da eksponering for D-PBS ikke skader hPSC'erne og forhindrer cellebrud eller krympning forårsaget af osmose. - Aspirat D-PBS, tilsæt 500 μL dissociationsopløsning til hvert hul, og lad det sidde i 2-5 minutter ved stuetemperatur (15 - 25 °C).
- Mens cellerne dissocieres, aspireres belægningsopløsningen af den nye 6 brøndplade og tilsættes 1-2 ml calcium / magnesiumfri D-PBS til hver brønd.
- Kontroller regelmæssigt dissociationsprocessen under det omvendte mikroskop.
- Opsug dissociationsopløsningen, når 80 - 90% af cellerne er afrundede, men stadig klæber.
- Der tilsættes 1 ml stamcellemedium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer.
- De dissocierede celler samles i et 15 ml konisk rør ved hjælp af 1.000 μL sterilfiltrerede pipettespidser og en P1000-pipette.
- Triturér langsomt cellesuspensionen op og ned i pipetten med en 1.000 μL steril pipettefiltreret spids for at bryde kolonierne, men må ikke overstige 10 gange.
- Der tilsættes 1 ml stamcellemedium indeholdende ROCK-hæmmer for at hjælpe med at løsne de resterende hPSC'er og overføre cellesuspensionen til det samme 15 ml koniske rør (1.10).
- D-PBS suges ud af den nycoatede plade, og cellesuspensionen tilsættes straks fra det koniske 15 ml rør. For at sikre optimal cellevækst skal du frø et interval på 2 x 105- 1 x 106 levedygtige celler pr. Brønd, når du bruger en 6 brøndplade (1 ud af 10 til 1 ud af 50 split).
BEMÆRK: Til volumenberegningen skal hver brønd i en 6-brønds plade indeholde 2 ml stamcellemedium med ROCK-hæmmer. - Flyt pladen hurtigt frem og tilbage, og fra side til side 5 - 10 gange.
- Pladen anbringes ved 37 °C, 5% CO2 -inkubator i 24 timer.
- Udskift med frisk stamcellemedium uden ROCK-hæmmer den næste dag, og derefter hver 2. dag, indtil sammenløbet af hPSC'er har nået 80 - 95%.
2. Humane stamcelleafledte β-celler rettet differentiering
BEMÆRK: hPSC'erne kan bruges til den direkte differentieringsproces i β-celler i bugspytkirtlen, når der opnås 80-95% sammenløb.
- Dag -1: Passaging af cellerne Dag -1 af differentiering:
- 1-2 timer før passage belægges en 6 brøndplade med kold belægningsopløsning i en 37 ° C, 5% CO2 -inkubator i 1 time.
- Følg trin 1.1 til 1.10, og fortsæt til at tælle celler.
- Læg 10 μL af celleblandingen, tilsæt et lige så stort volumen Trypan Blue, og bland forsigtigt.
- Beregn cellekoncentrationen. Brug 0,8 × 106 celler / ml - 1,0 x 106 celler / ml stamcellemedium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer til at plade den belagte 6 brøndplade med 2 ml medier pr. Hul.
- Flyt pladen hurtigt frem og tilbage, side til side tre gange.
- Pladen anbringes i en 5 % CO2 -inkubator °C °C. Flyt hurtigt pladen frem og tilbage og fra side til side igen 10 gange. Derefter inkuberes pladen i 4 timer.
BEMÆRK: Sørg for, at den maksimale fastgørelse og den jævne fordeling af celler ikke forstyrrer cellerne ved at flytte pladen, når den er placeret i inkubatoren. Åbn og luk inkubatoren meget omhyggeligt. - Anbring flasken med basalmedium i dag 0 til 4 ved 4 °C for at tø den op natten over.
- Dag 0
BEMÆRK: hPSC'erne skal være 80 - 95% sammenflydende, start ikke differentieringsprocessen til endelig endoderm under denne sammenløb.- På is optø både basalmediet på dag 0 til 4 og kosttilskud (se materialetabel).
- Forbered i to koniske rør kun det nødvendige volumen, der skal bruges på dag 1 (2 ml pr. brønd i en 6-brøndplade), og i et separat rør fordobles volumenet for dag 2,5 til 4 (2 x 2 ml pr. hul på en 6-brøndplade). Opbevar substratet fra dag 2,5 til dag 4 ved 4 °C.
- En prøve af det nødvendige rumfang af dag 1-substratet opvarmes og vaskemediet 1 opvarmes i et 37 °C-vandbad i 5 min.
- Opsug stamcellemediet og tilsæt 2 ml vaskemedium 1.
BEMÆRK: Det vaskemedium, der anvendes i protokollen, består af det basale medium, der er specifikt for hver dag/trin, suppleret med 1% antibiotika. Vasketrinnene i protokollen for direkte differentiering omfatter kun tilsætning af det angivne vaskemedium (benævnt "vaskemedium 1 eller 2", materialetabel) og efterfølgende aspiration efter den beskrevne procedure 2.2.4. Det er vigtigt at nævne, at der ikke er angivet nogen specifik tidsramme for disse vasketrin. - Aspirer vaskemedium 1 og tilsæt straks 2 ml af dag 1-mediet til siden af brønden.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer.
- Dag 1
- Forvarm en prøve af det nødvendige volumen af dag 2,5 til 4 medium i et 37 °C vandbad i 5 min.
- Opsug dag 1-mediet og tilsæt straks 2 ml af dag 2,5 til 4 medium til siden af brønden. Vask ikke cellerne.
- Pladen anbringes ved 37 °C og 5 % CO2 i 36 timer.
- Dage 2,5 til 4
- Forvarm en prøve af det resterende volumen af dagen 2,5 til 4 medium i 37 °C vandbad i 5 min.
- Opsug mediet og tilsæt straks 2 ml frisklavede dage 2,5 til 4 medium til siden af brønden.
- Pladen anbringes ved 37 °C og 5 % CO2 i 36 timer.
- Dag 4
BEMÆRK: På dette stadium er ekspressionen af de endelige endodermmarkører maksimal, og celler kan initiere primitiv tarmrørdifferentiering.- Forbered en prøve af det nødvendige volumen af dag 4 primitivt tarmstadiemedium (2 ml pr. hul i en plade med seks brønde) og varm det op ved stuetemperatur (15 °C -25 °C) i 20 minutter.
- Aspirer dage 2,5 til 4 medium og tilsæt 2 ml vaskemedium 1.
- Opsug vaskemediet 1, og tilsæt straks 2 ml af dag 4 primitivt tarmstadium til siden af brønden.
- Pladen anbringes igen ved 37 °C og 5 % CO2 i 48 timer.
- Dag 6 til 8
BEMÆRK: På dette stadium initierer cellerne yderligere differentiering på bageste foregut skæbne.- Forbered det nødvendige volumen på dag 6 til 8 bageste fortarmmedium (2 ml pr. hul af en 6 brøndplade) og opvarm mediet ved stuetemperatur (15 °C -25 °C) i 20 minutter.
- Opsug dag 4-mediet og tilsæt straks 2 ml dag 6 til 8 bageste fortarmmedium til siden af brønden.
- Pladen anbringes ved 37 °C inkubator indeholdende 5% CO2 i 48 timer.
- Dag 8 til 12
BEMÆRK: Cellerne er klar til at gennemgå bugspytkirtelstamfædrenes differentiering.- Forbered det nødvendige volumen af dag 8 til 12 stamfædre i bugspytkirtlen stadium medium (2 ml pr. hul af en 6 brøndplade) og opvarm mediet ved stuetemperatur (15 ° C -25 ° C) i 20 minutter.
- Aspirer dag 6 til 8 medium og tilsæt straks 2 ml dag 6 til 8 bageste foregutmedium til siden af brønden.
- Pladen anbringes i en inkubator ved 37 °C indeholdende 5% CO2 i 48 timer.
- Dag 12: Udførelse af klyngetrinnet
BEMÆRK: På dette stadium danner cellerne et tæt monolag og vil blive overført til 3D-cellekultur for at danne klynger. Dette trin er afgørende for differentieringen for at forbedre den strukturelle lighed mellem β-lignende celler og indfødte menneskelige øer, men forbedrer også deres funktionelle lighed på både cellulært og klyngeniveau11 (figur 1).- En 6-brøndplade indeholdende mikrobrønde, der er 400 μm (som angivet i materialetabellen: Human Stamcelle-Derived β-cells Directed Differentiation, dag 12) behandles med 2 ml anti-adhærensskylleopløsning ved stuetemperatur (15 °C - 25 °C).
BEMÆRK: Mikrobrønden forhindrer celler i at binde sig til brøndbunden og letter den mekaniske dannelse af 3D-klynger. - Centrifugeringsplade ved 1.300 x g i 5 min.
- Kontroller for tilstedeværelsen af bobler under et omvendt mikroskop. Hvis der ikke observeres bobler, aspireres anti-vedhæftningsskylleopløsning og tilsættes straks 2 ml vaskemedium 2 (Tabel over materialer).
- Gentag trin 1.8.3. to gange.
- Forbered det nødvendige volumen af klyngemediet og varm det ved stuetemperatur (15 -25 °C) i 20 min. Sørg for, at to brønde i en 6-brøndplade går ind i en brønd i 400 μm mikrobrøndens 6-brøndplade med 4 ml klyngemedium.
- Aspirer pancreas stamfadermedium og tilsæt dissociationsbuffer (0,5 ml pr. Brønd).
- Inkuber ved stuetemperatur (15 °C - 25 °C) i 2-5 min. Kontroller regelmæssigt dissociationsprocessen under et omvendt mikroskop og aspirat dissociationsbuffer, når de fleste celler er afrundede, men stadig klæber.
- Opsug dissociationsbufferen, og tilsæt straks 1 ml klyngemedium til hvert hul.
- Adsocier celler ved forsigtigt at pipettere op og ned seks gange ved hjælp af en P1000-pipette og 1.000 μL filterspidser.
- Overfør cellerne og klyngemedieblandingen til et 50 ml konisk rør.
- Tilføj 1 ml af klyngemediet for at samle alle resterende celler.
- Tilføj klyngemediet til det samlede nødvendige volumen, så hver brønd i mikrobrøndpladen har 4 ml blandingsklyngemedium/celler.
- Opsug vaskemediet 2 fra mikrobrøndens 6-brøndplade, og overfør cellesuspensionen. Pladen inkuberes ved 37 °C i 24 timer.
- En 6-brøndplade indeholdende mikrobrønde, der er 400 μm (som angivet i materialetabellen: Human Stamcelle-Derived β-cells Directed Differentiation, dag 12) behandles med 2 ml anti-adhærensskylleopløsning ved stuetemperatur (15 °C - 25 °C).
- Dag 13: Håndtering af cellerne efter clustering og ændring af deres medier fra dag 13 og fremefter.
BEMÆRK: Klynger er meget følsomme og kræver omhyggelig håndtering for at sikre deres integritet og levedygtighed i de følgende dage. Derfor er det afgørende at overvåge klyngerne nøje i perioden efter klyngedannelse efter dag 12. Regelmæssig evaluering og justeringer er afgørende for at fremme vellykkede resultater i den eksperimentelle proces.- Forbered det nødvendige volumen af dag 13 medium (2 ml pr. hul af en 6 brøndplade) og i et separat konisk rør på 50 ml til dag 15 til 20 pancreas endokrine stamfadermedium.
- Opsaml langsomt klynger fra mikrobrøndens 6 brøndplade i et 50 ml konisk rør ved hjælp af en p1000-pipette og 1.000 μL filtrerede spidser.
- Tilsæt 1 ml dag 13-medium for at samle de resterende klynger og overføre klyngerne til røret.
- Lad cellerne sætte sig naturligt under tyngdekraften til bunden af det koniske rør i 5 min.
- Der suges så meget supernatant som muligt ud af røret uden at forstyrre celleklyngerne. Pipettespidserne må ikke røre eller aspirere klyngerne, men kun supernatanten.
- Tilsæt det nødvendige volumen af dag 13-mediet i henhold til følgende: 1 brønd mikrobrønd 6 brøndplade går ind i tre brønde med en 6 brøndplade med lav binding (2 ml medier pr. Brønd).
- Pipette forsigtigt op og ned, undgå aspirerende klynger.
- Overfør suspensionen til en meget lav klæbende 6 brøndplade.
- Flyt pladen hurtigt frem og tilbage, fra side til side seks gange.
- Pladen inkuberes ved 37 °C i 48 timer.
- Udfør medieændringerne i alle de næste trin indtil afslutningen af differentieringen som beskrevet i dette afsnit 2.9.
- Dage 15 til 20
- Skift til pancreas endokrine stamfader til stadium hver 48. time indtil dag 21 i differentieringen ved at opsamle cellesuspensionen i et 50 ml konisk rør og følge trin 2.9.4 til 2.9.10 for dag 13.
- Dag 21 til 27
BEMÆRK: På dette stadium differentierer klynger sig til bugspytkirtlen β-celler.- Forbered bugspytkirtlen β-celle stadium medium.
- Skift mediet hver anden dag som beskrevet for dag 15 til 21.
BEMÆRK: Efter dag 25 kan de ølignende organoider gennemgå analyse for at bekræfte, at de er fuldt funktionelle.
3. Farvning af bugspytkirtlen β-celleklynger
BEMÆRK: Udfør dette trin for at studere den funktionelle vurdering af klynger efter differentiering
- Saml fem til ti klynger i et 1,5 ml mikrocentrifugerør i slutningen af differentieringen.
- Fastgør celleklyngerne med 200 μL 4% PFA i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Tilføj 1 ml PBS til klyngerne, og fjern PBS med en 1.000 μL pipettespids uden at forstyrre klyngerne.
- Der tilsættes 200 μl 30% saccharose til klyngerne, og der inkuberes natten over ved 4 °C.
- Overfør klyngerne til en kryomod, fjern ekstra saccharose, tilsæt en dråbe O.C.T.-medium, og bland klyngerne med O.C.T.-medium.
- Kryomaden fryses på tøris og opbevares ved -80 °C.
- Skær 5 μm sektioner fra den frosne blok på mikroskopglas ved hjælp af et mikrotom/eller kryostat.
- Opbevar rutsjebaner ved -80 °C fryser indtil farvning.
- På farvningsdagen skal du tage diasene ud af fryseren -80 °C.
- Fjern forsigtigt isen omkring cryomolds sektioner.
- Cirkel celleklynger på dias med en hydrofob pen.
- Rehydrer dias i et diasfarvningsglas indeholdende PBS i 15 min.
- Tilsæt kold methanol til diasfarvningsglasset og læg krukken med dias ved -20 °C i 10 min.
- Dyp dias i en PBS-krukke.
- Gentag trin 3.14 tre gange.
BEMÆRK: Brug denne metode til alle følgende vasketrin. - PBS fjernes fra objektglassene og dækkes straks med 100 μL blokeringsopløsning med 2-5% BSA i PBS-T.
- Tilføj blokeringsopløsning til hvert dias og dæk med paraffinfilm.
- Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur (15-25 °C).
- Fortynd de primære antistoffer i blokeringsopløsningen ved hjælp af de forhold, der er angivet i afsnittet Reagenser og opløsninger.
- Fjern blokeringsopløsningen fra diasene.
- Tilsæt straks fortyndede antistoffer og dæk dias med parafilm for at forhindre, at diaset bliver tørt.
- Der inkuberes natten over ved 4 °C.
- Dagen efter vaskes rutsjebanerne 3 - 5 gange med PBS-T.
- Forbered fortyndede sekundære antistoffer og DNA-plet.
- Fjern overskydende PBS-T fra diasene.
- Tilsæt fortyndede sekundære antistoffer og DNA-plet. Inkuber i 45 minutter ved stuetemperatur (15-25 °C).
- Vask lysbillederne 3 - 5 gange med PBS-T.
- Fjern eventuel væske fra diasene.
- Tilføj en dråbe histologi monteringsmedium til hver sektion.
- Dæk diaset med et glasdæksel.
- Tag billeder af farvede dias ved hjælp af et fluorescerende mikroskop.
4. GSIS (glucose-stimuleret insulinsekretionsassay)
- Forbered tre forskellige opløsninger: KREBS-opløsning med lav glukose, KREBS-opløsning med høj glukose og KREBS-opløsning med lav glukose med KCl.
- Alle opløsningerne opvarmes ved 37 °C vandbad.
- Vælg omhyggeligt omkring 10-15 klynger af samme størrelse ved hjælp af en 1000 μL pipettespids og overfør dem til et 1,5 ml rør sammen med en lille mængde differentieret medium for at undgå udtørring af klyngerne.
BEMÆRK: Klyngerne skal være synlige for det blotte øje, men hvis ikke, skal du placere pladen indeholdende differentierede klynger under et omvendt mikroskop for at vælge klyngerne og overføre dem til et 1,5 ml rør. - Placer røret med klynger og medium på et rørstativ, og vent på, at klyngerne synker til bunden af røret.
- Supernatanten suges langsomt til med en 200 μL pipette og tilsættes 200 μL KREBS-opløsning med lavt glukoseindhold.
- Øerne inkuberes i lavglukoseopløsningen i 1 time ved 37 °C.
BEMÆRK: For at sikre en nøjagtig vurdering af klyngenumre og konsistens i eksperimenter anbefales det at kontrollere tilstedeværelsen af alle klynger i opløsningen under overførsel, da de har tendens til at klæbe til røret. - Fjern røret fra inkubatoren og aspirer langsomt 200 μL KREBS-opløsning uden at opsuge nogen klynger.
- Der tilsættes 200 μL KREBS-opløsning med lavt glucoseindhold og inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
- Opsug volumenet af 200 μL KREBS-opløsning med lavt glukoseindhold i et 500 μL rør og opbevar det straks ved -80 °C til insulinmålinger. Gentag for separate behandlinger.
- For at vaske klyngerne tilsættes 200 μL KREBS-opløsning uden glucose til røret indeholdende klyngerne. Lad klyngerne sætte sig til bunden af røret, og fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre klyngerne.
- Der tilsættes 200 μL KREBS-opløsning med højt glucoseindhold og inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
- 200 μL KREBS med højt glukoseindhold suges ind i et 500 μL rør og opbevar det straks ved -80 °C til insulinmåling. Gentag for separate behandlinger.
- For at vaske klyngerne tilsættes 200 μL KREBS-opløsning uden glucose til røret indeholdende klyngerne. Lad klyngerne sætte sig til bunden af røret, og fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre klyngerne.
- Der tilsættes 200 μL KCl KREBS-opløsning og gentages ved separate behandlinger.
- Der inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
- 200 μL KCl KREBS-opløsning suges til en 500 μL tube og opbevares straks ved -80 °C til insulinmålinger. Gentag for andre behandlinger.
- Tilsæt 50 μL ultrarent vand og fortsæt med at måle det samlede insulinindhold.
- Tilsæt 150 μL sur ethanolopløsning til røret med øer og ultrarent vand.
- Opbevar prøverne ved 4 °C natten over (12-15 timer).
- Den følgende dag, hvirvel hver prøve.
- Udfør sonikering med en elektrisk sonikator indstillet til 20% effekt i 1 s for at sikre fuldstændig lysering af øvævet.
BEMÆRK: Gentag trin 4.21, indtil der ikke er nogen resterende klynger synlige. - Alle prøver centrifugeres ved 10.000 × g i 10 minutter, og supernatanten opbevares.
- Mål DNA-koncentrationen ved hjælp af et nanodrop-spektrofotometer, som derefter kan bruges til at normalisere insulinmålinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet i dette papir tilbyder en yderst effektiv tilgang til differentiering af β-lignende celler fra hPSC'er10. Denne proces anvender et 2D-kultursystem, der er let skalerbart, hvilket gør det muligt at bruge det i forskellige eksperimentelle indstillinger, såsom læringsdifferentiering, mindre projekter og laboratorier og pilottest for at vurdere potentialet i en iPSC-linje til differentiering.
Det er vigtigt at karakterisere de funktionelle egenskaber af differentierede β-celler i holme for at få indsigt i glukosehomeostase. Dette opnås typisk gennem forskellige eksperimenter såsom immunfarvning til β-cellemarkører og insulinekspression samt glucosestimulerede insulinsekretionsassays (GSIS), som tester øfunktion som reaktion på lave og høje glukosekoncentrationer12,13. β-celler besidder signaturgener, herunder Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 og Neurod1, som er afgørende for at etablere og opretholde β-celleidentitet9. Immunfarvningsteknikker er værdifulde til undersøgelse af proteinekspression og lokalisering inden for vævssektioner. Immunfarvning til β-cellemarkører kan vurdere ekspressionsniveauerne for vigtige markører for bugspytkirtelafstamning, hvilket giver indsigt i differentieringsprocessens troskab og optimering til specifikke applikationer 9,12.
I denne undersøgelse blev Mel1 InsGFP / w (Mel1 INS-GFP)14 hESC reporterlinjen brugt til at differentiere klynger bestående af forskellige celletyper, herunder β-celler, der ligner dem, der findes i menneskelige indfødte øer. Figur 2 i dette papir giver betydelige resultater vedrørende effektiviteten og nøjagtigheden af differentieringsprocessen. Resultaterne viser en høj berigelse af insulinekspressive celler inden for bugspytkirtelafstamningen, og disse celler udviser glukosestimuleret insulinsekretion. Dette indikerer den vellykkede generering af funktionelle β-lignende celler gennem differentieringsprocessen.
De differentierede celler blev stimuleret med lave og høje glukosekoncentrationer, og GSIS-resultater viste, at klyngerne afledt af Mel1-celler fungerede på samme måde som øer i deres insulinsekretionsrespons på glukose. De Mel1-afledte klynger viste sig at udskille 100 gange mere insulin som reaktion på høje glukosekoncentrationer sammenlignet med lave glukosekoncentrationer. Specifikt var insulinindholdet 0,003 ± 0,002% ved 3,3 mM lav glukose og 0,236 ± 0,197% ved 16,7 mM høj glukose.
Klyngerne afledt af Mel1 INS-GFP hESC'er blev udsat for yderligere analyser for at bestemme deres sammensætning og funktionalitet ud over GSIS-assayet. Specifikt blev ekspressionen af β-celle signaturgener og tilstedeværelsen af forskellige celletyper i klyngerne undersøgt. Resultaterne viste, at bugspytkirtelafstamningen opnået fra denne proces er stærkt beriget i insulinpositive celler, hvilket indikerer et højt succesniveau i differentieringsprocessen af hESC'er i β-cellelignende celler. Desuden blev ekspressionen af signaturgener, såsom Nkx6.1 og Pdx1, der er vigtige for etablering og vedligeholdelse af β-celleidentiteter, undersøgt. Analysen afslørede, at ca. 25% og 40% af cellerne udtrykte henholdsvis Nkx6.1 og Pdx1, hvilket gav yderligere bevis for, at klyngerne indeholdt differentierede β-lignende celler (gennemsnit Nkx6.1+ celler pr. klynge 24.9% ± 6.2%, n = 9 klynger, Pdx1+ celler 40.2% ± 6.2%, n = 9, SEM, figur 2). Derudover indeholdt klyngerne andre celletyper, såsom glukagon-positive celler, som tegnede sig for omkring 15% af den samlede cellepopulation. Disse celler findes typisk i alfaceller på indfødte øer Langerhans, hvilket tyder på, at klyngerne ligner menneskelige øer med hensyn til cellesammensætning.
Figur 1: Differentiering af hPSC'er mod β-celler i bugspytkirtlen. (A) Skematisk repræsentation af in vitro-rettet differentiering af hPSC'er i β-celler i bugspytkirtlen, som involverer seks på hinanden følgende faser: endelig endoderminduktion, primitiv tarmrørdannelse, posterior foregut skæbnespecifikation, generering af stamfader i bugspytkirtlen, dannelse af pancreas endokrine stamfader og i sidste ende differentiering af bugspytkirtlen β-celler. Pancreas β-celle differentiering bruger nøglestadier af menneskelig øudvikling med regulering af specifikke cellesignalveje på bestemte tidspunkter. B27: B-27 Tillæg; Ri: rho-associeret proteinkinasehæmmer eller ROCK-hæmmer; T3: skjoldbruskkirtelhormon; KGF: humant KGF / FGF-7 protein; RepSox: Activin / Nodal / TGF-β pathway inhibitor; Hæmmer ALK5; RA: Retinsyre; ZS: zinksulfat; UFH: ufraktioneret heparin; XX: gamma-sekretasehæmmer XX; APH: bladlus; EGF: epidermal vækstfaktor LDN: BMP-hæmmer III, LDN-212854; Cyclo: Cyclopamine- KAAD. (B) Billeder af cellulær morfologi taget på forskellige stadier af differentiering fra pluripotente stamceller til pancreas β-celler. Det første billede viser humane pluripotente stamceller på den første differentieringsdag (monolag af HPSC'er). (C) På dag 11 er cellerne i bugspytkirtlens stamfaderstadie. Skalastang på 100 μm. (D) På dag 12 dannes klynger i mikrobrøndene på 6-brøndpladen efter dissociation af celler på bugspytkirtelstamfaderstadiet. (E) På dag 13 er klynger i en 6-brøndsplade med lav fastgørelse. Skalabjælke på 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Klynger opnået fra differentieret Mel1 InsGFP/w hESC reporterlinje14 blev evalueret for tilstedeværelsen af insulinproducerende celler, der udtrykker modenhedsmarkører for β-celler. (A) Immunofluorescensbilleder af klyngerne blev taget fra kryopartikler (5 μm) ved hjælp af spindeskivekonfokalmikroskopi, som afslørede overvægten af insulinproducerende celler (ca. 60%) sammenlignet med glukagonproducerende celler (ca. 15%) (n = 9 klynger, ca. 18.000 celler, SEM). (B) Immunofluorescensbilleder af klyngerne blev opnået fra kryopartikler (5 μm) ved hjælp af spindeskivekonfokalmikroskopi, som viste overvægten af insulinproducerende celler, der co-udtrykker bugspytkirtlen β-cellemarkørerne Nkx6.1 (n = 9 klynger, ca. 18.000 celler). (C) ImageJ-celletællermakro, specielt designet til immunfarvning af markører, blev anvendt til at bestemme procentdelen af insulinpositive, glukagonpositive og β-cellemarkører Nkx6.1-positive celler og β-cellemarkører Pdx1-positive celler. (D) Den glucosestimulerede insulinsekretion af Mel1 InsGFP/w hESC-afledte klynger blev evalueret, hvilket udviste en stigning på 100 gange som reaktion på høj glukosestimulering (16,7 mM glucose) i de differentierede klynger (n = 9, SEM). Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Oversigt over mediesammensætning for rettet differentiering. Denne tabel giver et resumé af mediesammensætningen, der anvendes til hver dag / trin af rettet differentiering oven på stamcellematrix og medium sammen med den glukosestimulerede insulinsekretionsbuffer. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den vellykkede differentiering af hPSC'er i bugspytkirtlen β-celler afhænger af optimering af alle aspekter af rutinemæssig dyrkning og passage af de valgte hPSC'er. Dette inkluderer at sikre, at cellelinjen har en normal karyotype, er negativ for mycoplasmainfektion og er fri for plasmid eller virale vektorgenomer. Når der anvendes hiPSC'er, er det desuden vigtigt at undgå at anvende den tidligste passage, som stadig er under omprogrammering, til pilotforsøg. Disse eksperimenter bør udføres i lille skala for at identificere hPSC-linjen med det bedste differentieringspotentiale og det optimale antal passager.
Andre parametre, der kan påvirke differentieringseffektiviteten, omfatter kvaliteten af det anvendte stamcellemedium, belægningstætheden og antallet af passager 10,12. Denne protokol er optimeret til at maksimere effektiviteten af differentiering ved at sikre, at alle relevante parametre optimeres10.
Differentieringsmedier med specifikke formuleringer anvendes på hvert trin til at understøtte differentieringen af hPSC'er i β-celler. Activin A og en Wnt-agonist anvendes i differentieringsmediet til at indlede overgangen til endelige endodermceller. Under det primitive tarmrørsstadium tilsættes KGF til mediet for at fremme yderligere differentiering i β-celler15, og denne inklusion af KGF opretholdes fra dag 6 til 8, forskellig fra den oprindelige protokol af Sui, Egli, et al.10. Under bugspytkirtelstamfaderstadiet optimeres den specifikke mediesammensætning for at forbedre ekspressionen af Pdx1-transkriptionsfaktoren. Dette opnås ved at anvende en høj koncentration af retinsyre (RA), KGF og LDN193189, som hæmmer knoglemorfogenetisk protein (BMP) vej8. Efterhånden som differentieringen skrider frem til det endokrine stadium, modificeres kulturmediet for at nedregulere Notch-signalering. Dette opnås ved at inkorporere XXI, en γ-sekretasehæmmer, sammen med T3 (skjoldbruskkirtelhormon), RA og RepSox, en hæmmer af Activin / BMP / TGF-β vej8. Denne specifikke kombination af forbindelser anvendes til at fremme differentieringen af stamceller i bugspytkirtlen i endokrine forfædre. Endelig, for at optimere den direkte differentieringsproces, introduceres aphidicolin (APH) under differentieringen fra bugspytkirtelstamfædre til endokrine forfædre. Denne tilføjelse af APH sigter mod yderligere at forbedre β-celledifferentiering, og den repræsenterer en særskilt ændring fra den oprindelige protokol foreslået af Sui, Egli, et al.10,11.
Under differentieringsprocessen er det afgørende at overvåge celletætheden og forhindre oversammenløb, da dette kan hindre korrekt differentiering. Kulturer med høj densitet kan opretholde et højt okt4-udtryk, hvilket hæmmer differentiering til definitiv endoderm. Fjernelse af ROCK-hæmmeren under det første vasketrin er afgørende for at initiere differentiering og gøre det muligt at ændre den pluripotente tilstand af hPSC'er. Brug af en fluorescensmarkør, såsom Mel1 INS-GFP med en GFP integreret på insulinlocus, letter vurderingen af differentieringsfremskridt ved bugspytkirtelstamfader og β-cellestadier, hvilket hjælper nedstrømsforsøg14.
Den nuværende protokol til differentiering af humane pluripotente stamceller i bugspytkirtlen β-lignende celler har vist variation i effektivitet blandt forskellige hPSC-linjer10. Derudover udviser de resulterende β-lignende celler funktionel umodenhed sammenlignet med humane bugspytkirteløer, hvilket viser lavere insulinsekretion pr. Celle. For yderligere at imødegå denne begrænsning kan in vivo-modning af β-lignende celler opnås ved transplantation af øorganoider til dyremodeller i de sidste faser af differentiering 6,7.
På trods af disse begrænsninger har differentieringen af hPSC'er i β-celler i bugspytkirtlen et betydeligt potentiale i forhold til eksisterende metode 8,9,10. Denne teknik gør det muligt at producere et stort antal β-cellelignende celler, der reagerer på glukose og udtrykker β-cellemarkører (Pdx1 og Nkx6.1, se figur 2). Dette gøres uden de etiske, tekniske og kildemæssige begrænsninger, der er forbundet med brugen af menneskelige bugspytkirteløer. Derudover har denne teknik potentialet til at blive anvendt til personlig medicin, da patientspecifikke β-celler kan genereres til lægemiddeltest og sygdomsmodellering 4,6,7. Teknikken kan også have fremtidige anvendelser til behandling af diabetes, der involverer tab eller dysfunktion af bugspytkirtlen β-celler 4,6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ines Cherkaoui blev støttet af et Diabetes UK-studieophold (BDA 18/0005934) til GAR, som også takker Wellcome Trust for en Investigator Award (212625/Z/18/Z), UKRI MRC for et programtilskud (MR/R022259/1), Diabetes UK for Project-tilskud (BDA16/0005485), CRCHUM for opstartsfonde, Innovation Canada for en John R. Evans Leader Award (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) for et projekttilskud og CIHR, JDRF for et teamtilskud (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion og Dr. Harry Leitch for deres hjælp med human hiPSC'er generation og kultur, NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre) Organoid facilitet, London.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube | Starlabs | S1615-5500 | |
| 6-well Cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 165218 | |
| AggreWell 400 6-well plate | STEMCELL Technologies | 34425 | |
| Anti-Glucagon | Sigma-aldrich | G2654-100UL | |
| Anti-Insulin | Dako | A0564 | |
| Anti-NKX6.1 | Novus Biologicals | NBP1-49672SS | |
| Anti-PDX1 | Abcam | ab84987 | |
| Aphidicolin | Sigma-Aldrich | A4487 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A3803-100G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Calcium/Magnesium free D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Cyclopamine-KAAD | Calbiochem | 239804 | |
| D-(+)-Glucose,BioXtra | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Disodium hydrogen phosphate, anhydrous | Sigma-Aldrich | 94046-100ML- | |
| DMEM plus GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566016 | For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. |
| DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
| Ethanol | VWR | 20821.33 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
| Gamma-Secretase Inhibitor XX | Thermo Fisher Scientific | J64904 | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100. |
| Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21435 | |
| Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150187 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H3375-500G | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H1399 | |
| Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0094 | |
| Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 295426 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Agar Scientific | AGG4582 | |
| LDN193189 | Sigma-Aldrich | SML0559-5MG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272-500G | |
| OCT Compound 118 mL | Agar Scientific | AGR1180 | |
| PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Penicillin-Streptomycin (PS) | Thermo Fisher Scientific, | 15070-063 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Recombinant Human EGF Protein | R&D Systems | 236-EG-200 | |
| Rectangular cover glasses, 22×50 mm | VWR | 631-0137 | |
| RepSox (Hydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72394 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS. |
| Shandon Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium dihydrogen phosphate anhydrous | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
| STEMdiff Endoderm | STEMCELL Technologies | 5110 | |
| StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium. |
| Stemolecule All-Trans Retinoic Acid | Reprocell | 04-0021 | |
| Thyroid Tormone 3 (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| TrypL Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P2287-500ML | |
| Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture | Thermo Fisher Scientific | 38071 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | Z4750 |
References
- Kolios, G., Moodley, Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Nair, G. G., Tzanakakis, E. S., Hebrok, M. Emerging routes to the generation of functional β-cells for diabetes mellitus cell therapy. Nature Reviews Endocrinology. 16 (9), 506-518 (2020).
- Diagnosis and classification of diabetes mellitus. American Diabetes Association. Diabetes Care. 32 (Supplement_1), S62-S67 (2009).
- Sui, L., et al. β-Cell Replacement in mice using human Type 1 diabetes nuclear transfer embryonic stem cells. Diabetes. 67 (1), 26-35 (2018).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. Generation of insulin-producing pancreatic β-cells from multiple human stem cell lines. Nature Protocols. 16 (9), 4109-4143 (2021).
- Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (8), 1940-1953 (2007).
- Sui, L., Leibel, R. L., Egli, D. Pancreatic β-cell differentiation from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68 (2018).
- Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), 141553 (2021).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. Metabolic and functional specialisations of the pancreatic β-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity. Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).
- Micallef, S. J., et al. INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells. Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).
- Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth. Science. 245 (4919), 752-755 (1989).
