Summary
Denna artikel presenterar ett protokoll för riktad differentiering och funktionell analys av β-cellsliknande celler. Vi beskriver optimala odlingsbetingelser och passager för humana pluripotenta stamceller innan de genererar insulinproducerande bukspottkörtelceller. Differentieringen i sex steg fortskrider från definitiv endodermbildning till funktionella β-cellsliknande celler som utsöndrar insulin som svar på glukos.
Abstract
Humana pluripotenta stamceller (hPSC) kan differentiera till alla typer av celler, vilket gör dem till en utmärkt alternativ källa till humana β-celler i bukspottkörteln. hPSCs kan antingen vara embryonala stamceller (hESC) som härrör från blastocysten eller inducerade pluripotenta celler (hiPSCs) som genereras direkt från somatiska celler med hjälp av en omprogrammeringsprocess. Här presenteras ett videobaserat protokoll för att beskriva de optimala odlings- och passageförhållandena för hPSCs, före deras differentiering och efterföljande generering av insulinproducerande bukspottkörtelceller. Denna metod följer sexstegsprocessen för β-cellsriktad differentiering, där hPSCs differentierar till definitiv endoderm (DE), primitivt tarmrör, bakre framtarmens öde, pankreas stamceller, pankreas endokrina stamceller och slutligen pankreas β-celler. Det är anmärkningsvärt att denna differentieringsmetod tar en period på 27 dagar för att generera humana β-celler i bukspottkörteln. Potentialen för insulinutsöndring utvärderades genom två experiment, som inkluderade immunfärgning och glukosstimulerad insulinutsöndring.
Introduction
Humana pluripotenta stamceller (hPSCs) har den unika förmågan att differentiera till olika celltyper, vilket gör dem till ett livskraftigt alternativ till humana β-celleri bukspottkörteln. Dessa hPSCs kategoriseras i två typer: embryonala stamceller (hESC), härledda från blastocyst2, och inducerade pluripotenta celler (hiPSCs), genererade genom omprogrammering av somatiska celler direkt3. Utvecklingen av tekniker för att differentiera hPSCs till β-celler har viktiga implikationer för både grundforskning och klinisk praxis 1,4. Diabetes mellitus är en kronisk sjukdom som drabbar > 400 miljoner människor världen över och beror på kroppens oförmåga att reglera glykemi på grund av funktionsfel eller förlust av bukspottkörtelnsβ-celler. Den begränsade tillgången på ö-celler från bukspottkörteln för transplantation har hindrat utvecklingen av cellersättningsterapier för diabetes 2,4,6,7. Förmågan att generera glukosresponsiva insulinfrisättande celler med hjälp av hPSCs fungerar som en användbar cellulär modell för att studera utveckling och funktion hos mänskliga öar. Den kan också användas för att testa potentiella terapeutiska kandidater för diabetesbehandling i en kontrollerad miljö. Dessutom har hPSCs potential att producera ö-celler i bukspottkörteln som är genetiskt identiska med patienten, vilket minskar risken för immunavstötning efter transplantation 2,4,7.
Under de senaste åren har det skett betydande framsteg i förfiningen av hPSC-odling och differentieringsprotokoll, vilket har resulterat i ökad effektivitet och reproducerbarhet av differentieringsprocessen för att generera β-celler i bukspottkörteln 8,9.
Följande protokoll beskriver de väsentliga stadierna av riktad differentiering av bukspottkörtelns β-celler. Det handlar om reglering av specifika cellsignalvägar vid olika tidpunkter. Den är baserad på det protokoll som utvecklats av Sui L. et al.10 (2018) för generering av hPSC i bukspottkörtelns β-celler. Protokollet justerades till de senaste uppdateringarna från Sui L. et al.11 (2021), eftersom den senaste forskningen betonar betydelsen av att använda aphidicolin (APH) -behandling för att förbättra differentieringen av β-celler. Det nuvarande protokollet inkluderar tillsats av APH till mediet under de senare stadierna av processen. Dessutom har ändringar gjorts i mediets sammansättning under de tidiga stadierna av differentiering jämfört med det ursprungliga protokollet. En anmärkningsvärd förändring är tillägget av Keratinocyte Growth Factor (KGF) på dag 6 och fortsätter fram till dag 8. Keratinocyttillväxtfaktorn (KGF) introduceras från dag 6 till dag 8, vilket skiljer sig något från det ursprungliga protokollet10, där KGF inte ingick i steg 4-mediet.
Det första och väsentliga steget i genereringen av β-cellliknande celler är den riktade differentieringen av hPSCs till definitiv endoderm (DE), ett primitivt könsskikt som ger upphov till epitelfodret i olika organ, inklusive bukspottkörteln. Efter bildandet av DE genomgår cellerna differentiering till det primitiva tarmröret, vilket följs av specifikationen av det bakre förtarmens öde. Den bakre framtarmen utvecklas sedan till pankreasprogenitorceller, som har potential att differentiera till alla celltyper i bukspottkörteln, inklusive de endokrina och exokrina cellerna. Nästa steg i processen involverar endokrina stamceller i bukspottkörteln som ger upphov till de hormonutsöndrande celler som finns i de Langerhanska öarna. Till slut når differentieringsprocessen sitt slutskede genom att producera fullt fungerande pankreas- β-cellliknande celler 9,10. Det är viktigt att notera att denna process är komplex och ofta kräver optimering av odlingsförhållandena, såsom specifika tillväxtfaktorer och extracellulära matriskomponenter, för att förbättra effektiviteten och specificiteten hos differentiering 9,10. Dessutom är det fortfarande en stor utmaning att generera funktionella β-cellliknande celler från hPSCs in vitro. Pågående forskning fokuserar på att förbättra differentieringsprotokoll och förbättra mognaden och funktionen hos de resulterande β-cellerna9.
I detta protokoll är användningen av skonsam celldissociation under odling och passage av hPSCs avgörande för att upprätthålla cellviabilitet och pluripotens, vilket avsevärt förbättrar effektiviteten av differentiering till bukspottkörtelns β-celler. Dessutom har varje stegspecifikt medium optimerats noggrant enligt det protokoll som utvecklats av Sui L. et al.10 för att främja ett högt utbyte av insulinfrisättande celler i kluster som liknar den mänskliga ön.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Innan differentiering påbörjas rekommenderas att man bestämmer det erforderliga antalet öliknande organoider för experimentella ändamål. I en platta med 6 brunnar består en enda brunn med över 80 % sammanflöde vanligtvis av 2-2,3 miljoner hPSC. Även om en exakt förutsägelse är utmanande på grund av variationer i hPSC-linjer och differentieringseffektivitet, är en grov uppskattning 1,5 gånger antalet initiala brunnar. En effektivt riktad differentiering ger vanligtvis 1,6 till 2 miljoner celler per brunn i plattor med sex brunnar, som omfattar alla celler i klustren snarare än uteslutande insulinproducerande celler. För ett kluster på 50 μm kan det uppskattas till att innehålla cirka 10 000 celler. Tabell 1 ger en sammanfattning av den mediesammansättning som används för varje dag/stadium av riktad differentiering ovanpå stamcellsmatris och medium, tillsammans med den glukosstimulerade insulinutsöndringsbufferten.
1. Passaging av humana pluripotenta stamceller före differentiering i 6 brunnsplattor
OBS: Lämplig passage av humana stamceller innan de differentieras till β-cellsliknande celler är ett avgörande steg för att etablera den experimentella processen. Felaktig passageutspädning eller antal fasthållande celler kan äventyra differentieringens effektivitet och trohet.
- Bered stamcellsodlingsmedium, beläggning och dissociationslösningar (enligt specifikationen i tabell 1).
- 1-2 timmar före passering, belägg en platta med sex brunnar med kallbeläggningslösning (1 ml per brunn) och inkubera vid 37 °C, 5 % CO2 .
- Värm en alikvot av stamcellsodlingsmediet i rumstemperatur (15–25 °C) i 20 minuter.
- Aspirera stamcellsmediet och tillsätt 1 ml kalcium/magnesiumfritt D-PBS.
- Upprepa steg 1.4. två gånger.
OBS: D-PBS tillsätts för att tvätta cellerna och ta bort det tidigare mediet och föreningarna. Det är viktigt att notera att ingen specifik tidsram krävs för tvättstegen, eftersom exponering för D-PBS inte skadar hPSCs, vilket förhindrar cellruptur eller krympning orsakad av osmos. - Aspirera D-PBS, tillsätt 500 μL dissociationslösning för varje brunn och låt den stå i 2-5 minuter vid rumstemperatur (15 - 25 °C).
- Medan cellerna dissocierar, aspirera beläggningslösningen från den nya 6-hålsplattan och tillsätt 1-2 ml kalcium/magnesiumfri D-PBS till varje brunn.
- Kontrollera regelbundet dissociationsprocessen under det inverterade mikroskopet.
- Aspirera dissociationslösningen när 80 - 90% av cellerna har rundats men fortfarande är vidhäftande.
- Tillsätt 1 ml av stamcellsmediet som innehåller 10 μM ROCK-hämmare.
- Samla de dissocierade cellerna i ett 15 ml koniskt rör med hjälp av 1 000 μL sterila filtrerade pipettspetsar och en P1000-pipett.
- Triturera långsamt cellsuspensionen upp och ner i pipetten med en 1 000 μL steril pipettfiltrerad spets för att bryta kolonierna, men överskrid inte 10 gånger.
- Tillsätt 1 ml av stamcellsmediet som innehåller ROCK-hämmare för att hjälpa till att lossa de återstående hPSC:erna och överför cellsuspensionen till samma 15 ml koniska rör (1.10).
- Aspirera D-PBS från den nybelagda plattan och tillsätt omedelbart cellsuspensionen från det 15 ml koniska röret. För att säkerställa optimal celltillväxt, så ett intervall på 2 x 105- 1 x 106 livskraftiga celler per brunn när du använder en 6-hålsplatta (1 på 10 till 1 på 50 delningar).
OBS: För volymberäkningen måste varje brunn på en 6-hålsplatta innehålla 2 ml stamcellsmedium med ROCK-hämmare. - Flytta plattan snabbt fram och tillbaka och från sida till sida 5 - 10 gånger.
- Placera plattan vid 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 24 timmar.
- Ersätt med färskt stamcellsmedium utan ROCK-hämmare nästa dag, och sedan varannan dag tills sammanflödet av hPSC har nått 80 - 95%.
2. Riktad differentiering av β-celler från mänskliga stamceller
OBS: hPSCs kan användas för den direkta differentieringsprocessen till pankreas β-celler när 80-95 % sammanflöde uppnås.
- Dag -1: Passage av cellerna Dag -1 av differentiering:
- 1-2 timmar före passage, belägg en 6-hålsplatta med kallbeläggningslösning i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 1 timme.
- Följ steg 1.1 till 1.10 och fortsätt med att räkna celler.
- Fyll på 10 μL av cellblandningen, tillsätt en lika stor volym Trypan Blue och blanda försiktigt.
- Beräkna cellkoncentrationen. Använd 0,8 × 106 celler/ml - 1,0 x 106 celler/ml stamcellsmedium som innehåller 10 μM ROCK-hämmare för att plätera den belagda 6-hålsplattan med 2 ml media per brunn.
- Flytta plattan snabbt fram och tillbaka, från sida till sida tre gånger.
- Placera plattan i en inkubator för 37 °C, 5 % CO2 . Flytta snabbt plattan fram och tillbaka och från sida till sida igen 10 gånger. Inkubera sedan plattan i 4 timmar.
OBS: Se till att den maximala infästningen och den jämna fördelningen av celler inte stör cellerna genom att flytta plattan när den väl har placerats i inkubatorn. Öppna och stäng inkubatorn mycket försiktigt. - Placera flaskan med basalmedium dag 0 till 4 vid 4 °C för att tina den över natten.
- Dag 0
OBS: hPSCs måste vara 80 - 95 % konfluenta, starta inte differentieringsprocessen till definitiv endoderm under det sammanflödet.- På is, tina både basalmediet för dag 0 till 4 och kosttillskott (se materialförteckning).
- Bered i två koniska rör endast den nödvändiga volymen som ska användas dag 1 (2 ml per brunn på en 6-hålsplatta), och i ett separat rör, dubbla volymen för dag 2,5 till 4 (2 x 2 ml per brunn på en 6-hålsplatta). Förvara medium från dag 2.5 till dag 4 vid 4 °C.
- Värm en alikvot av den nödvändiga volymen av medium dag 1 och tvättmedium 1 i ett vattenbad på 37 °C i 5 minuter.
- Aspirera stamcellsmediet och tillsätt 2 ml tvättmedium 1.
OBS: Tvättmediet som används i protokollet består av det basala mediet som är specifikt för varje dag/stage, kompletterat med 1 % antibiotika. Tvättstegen i protokollet för direkt differentiering omfattar endast tillsats av det avsedda tvättmediet (kallat "tvättmedium 1 eller 2", materialtabell) och efterföljande aspiration, enligt det beskrivna förfarandet 2.2.4. Det är viktigt att nämna att det inte finns någon specifik tidsram angiven för dessa tvättsteg. - Aspirera tvättmedium 1 och tillsätt omedelbart 2 ml av medium dag 1 på sidan av brunnen.
- Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 % CO2 i 24 timmar.
- Dag 1
- Förvärm en alikvot av den nödvändiga volymen av medium för dag 2,5 till 4 i ett vattenbad på 37 °C i 5 minuter.
- Aspirera dag 1-mediet och tillsätt omedelbart 2 ml av dag 2.5 till 4-mediet vid sidan av brunnen. Tvätta inte cellerna.
- Sätt tillbaka plattan vid 37 °C och 5 % CO2 i 36 timmar.
- Dag 2,5 till 4
- Förvärm en alikvot av den återstående volymen av Day 2.5 till 4 medium i 37 °C vattenbad i 5 min.
- Aspirera mediet och tillsätt omedelbart 2 ml nyberedd Days 2.5 till 4 medium vid sidan av brunnen.
- Sätt tillbaka plattan vid 37 °C och 5 % CO2 i 36 timmar.
- Dag 4
OBS: I detta skede är uttrycket av de definitiva endodermmarkörerna maximalt, och celler kan initiera primitiv tarmrörsdifferentiering.- Bered en alikvot av den nödvändiga volymen av det primitiva tarmmediet dag 4 (2 ml per brunn på en platta med sex brunnar) och värm det i rumstemperatur (15 °C -25 °C) i 20 minuter.
- Aspirera dag 2,5 till 4 medium och tillsätt 2 ml tvättmedium 1.
- Aspirera tvättmediet 1 och tillsätt omedelbart 2 ml av dag 4 primitiva tarmstadiet på sidan av brunnen.
- Sätt tillbaka plattan vid 37 °C och 5 % CO2 i 48 timmar.
- Dag 6 till 8
OBS: I detta skede initierar cellerna ytterligare differentiering till det bakre förtarmens öde.- Bered den nödvändiga volymen av medium för dag 6 till 8 bakre framtarmen (2 ml per brunn på en platta med 6 brunnar) och värm mediet i rumstemperatur (15 °C -25 °C) i 20 minuter.
- Aspirera medium dag 4 och tillsätt omedelbart 2 ml av dag 6 till 8 bakre framtarmsmedium vid sidan av brunnen.
- Placera plattan i en inkubator med 5 % CO2 vid 37 °C i 48 timmar.
- Dag 8 till 12
OBS: Cellerna är redo att genomgå pankreasstamcellers differentiering.- Bered den nödvändiga volymen av medium för dag 8 till 12 pankreasprogenitorer (2 ml per brunn på en 6-hålsplatta) och värm mediet i rumstemperatur (15 °C -25 °C) i 20 minuter.
- Aspirera dag 6 till 8 medium och tillsätt omedelbart 2 ml dag 6 till 8 bakre framtarmsmedium vid sidan av brunnen.
- Placera plattan i en inkubator vid 37 °C som innehåller 5 % CO2 i 48 timmar.
- Dag 12: Utföra klustringssteget
OBS: I detta skede bildar cellerna ett tätt monolager och kommer att övergå till 3D-cellodling för att bilda kluster. Detta steg är avgörande för differentieringen för att förbättra den strukturella likheten mellan β-liknande celler och inhemska mänskliga öar, men förbättrar också deras funktionella likhet på både cell- och klusternivå11 (figur 1).- Behandla en 6-hålsplatta som innehåller mikrobrunnar som är 400 μm (enligt specifikationen i materialtabellen: Human Stem Cell-Derived β-cells Directed Differentiering, Day 12) med 2 ml anti-vidhäftande sköljlösning vid rumstemperatur (15 °C - 25 °C).
OBS: Mikrobrunnen förhindrar celler från att fästa vid brunnens botten och underlättar den mekaniska bildningen av 3D-kluster. - Centrifugera plattan med 1 300 x g i 5 minuter.
- Kontrollera om det finns bubblor under ett inverterat mikroskop. Om inga bubblor observeras, aspirera anti-vidhäftande sköljlösning och tillsätt omedelbart 2 ml tvättmedium 2 (Materialtabell).
- Upprepa steg 1.8.3. två gånger.
- Bered den nödvändiga volymen av klustermediet och värm det i rumstemperatur (15 -25 °C) i 20 minuter. Se till att två brunnar på en 6-hålsplatta går in i en brunn på 400 μm mikrobrunnar 6-brunnsplattan med 4 ml klustermedium.
- Aspirera pankreasprogenitormedium och tillsätt dissociationsbuffert (0,5 ml per brunn).
- Inkubera i rumstemperatur (15 °C - 25 °C) i 2-5 min. Kontrollera regelbundet dissociationsprocessen under ett inverterat mikroskop och aspirera dissociationsbuffert när de flesta cellerna har rundats men fortfarande är vidhäftande.
- Aspirera dissociationsbufferten och tillsätt omedelbart 1 ml klustermedium till varje brunn.
- Dissociera cellerna genom att försiktigt pipettera upp och ner sex gånger med hjälp av en P1000-pipett och 1 000 μL filterspetsar.
- Överför cellerna och klustermedieblandningen till ett 50 ml koniskt rör.
- Tillsätt 1 ml av klustermediet för att samla upp alla återstående celler.
- Tillsätt klustermediet till den totala volym som behövs så att varje brunn på mikrobrunnsplattan har 4 ml blandningsklustermedium/celler.
- Aspirera tvättmediet 2 från microwells 6-brunnsplatta och överför cellsuspensionen. Inkubera plattan vid 37 °C i 24 timmar.
- Behandla en 6-hålsplatta som innehåller mikrobrunnar som är 400 μm (enligt specifikationen i materialtabellen: Human Stem Cell-Derived β-cells Directed Differentiering, Day 12) med 2 ml anti-vidhäftande sköljlösning vid rumstemperatur (15 °C - 25 °C).
- Dag 13: Hantering av cellerna efter klustring och byte av media från dag 13 och framåt.
Kluster är mycket känsliga och kräver noggrann hantering för att säkerställa deras integritet och livskraft under de följande dagarna. Därför är det viktigt att noga övervaka klustren under perioden efter klustringen efter dag 12. Regelbunden utvärdering och justeringar är avgörande för att främja framgångsrika resultat i experimentprocessen.- Bered den nödvändiga volymen av dag 13 medium (2 ml per brunn på en 6-hålsplatta) och i ett separat koniskt rör på 50 ml för dag 15 till 20 pankreas endokrina stammodermedium.
- Samla långsamt upp kluster från mikrobrunnarnas 6-brunnsplatta i ett 50 ml koniskt rör med hjälp av en p1000-pipett och 1 000 μL filtrerade spetsar.
- Tillsätt 1 ml medium dag 13 för att samla upp de återstående klustren och överför klustren till röret.
- Låt cellerna stelna naturligt under gravitationen till botten av det koniska röret i 5 minuter.
- Sug upp så mycket supernatant som möjligt ur röret utan att störa cellklustren. Pipettspetsarna ska inte vidröra eller aspirera klustren utan endast supernatanten.
- Tillsätt den nödvändiga volymen av dag 13-medium enligt följande: 1 brunn med mikrobrunnar 6 brunnsplatta går in i tre brunnar med en lågfästande 6-brunnsplatta (2 ml media per brunn).
- Pipettera försiktigt upp och ner, undvik aspirerande kluster.
- Överför suspensionen till en 6-hålsplatta med mycket låg vidhäftning.
- Flytta plattan snabbt fram och tillbaka, sida till sida sex gånger.
- Inkubera plattan vid 37 °C i 48 timmar.
- Utför mediebytena i alla följande steg fram till slutet av differentieringen enligt beskrivningen i detta avsnitt 2.9.
- Dag 15 till 20
- Byt till endokrint stamcellsmedium i bukspottkörteln var 48:e timme fram till dag 21 av differentieringen genom att samla cellsuspensionen i ett 50 ml koniskt rör och följa steg 2.9.4 till 2.9.10 för dag 13.
- Dag 21 till 27
OBS: I detta skede differentierar kluster till bukspottkörtelns β-celler.- Förbered medium för bukspottkörteln β-cellsstadiet.
- Byt medium varannan dag enligt beskrivningen för dag 15 till 21.
OBS: Efter dag 25 kan de ö-liknande organoiderna genomgå analys för att bekräfta att de är fullt fungerande.
3. Färgning av bukspottkörtelns β-cellskluster
OBS: Utför detta steg för att studera funktionell bedömning av kluster efter differentiering
- Samla fem till tio kluster i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör i slutet av differentieringen.
- Fixera cellklustren med 200 μL 4% PFA i 15 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 1 ml PBS till klustren och ta bort PBS med en 1 000 μL pipettspets utan att störa klustren.
- Tillsätt 200 μl 30 % sackaros till klasarna och inkubera över natten vid 4 °C.
- Överför klustren till en kryomold, ta bort extra sackaros, tillsätt en droppe O.C.T.-medium och blanda klustren med OCT-medium.
- Frys kryomolden på torris och förvara vid -80 °C.
- Skär ut 5 μm sektioner från det frysta blocket på objektglas med hjälp av en mikrotom/eller kryostat.
- Förvara objektglasen i frysen -80 °C tills de färgar av sig.
- På färgningsdagen, ta ut glasen ur frysen på -80 °C.
- Ta försiktigt bort isen runt kryomoldens sektioner.
- Cirkla in cellkluster på objektglas med en hydrofob penna.
- Återfukta objektglasen i en glasfärgningsburk som innehåller PBS i 15 min.
- Tillsätt kall metanol i glasfärgningsburken och placera burken med objektglas vid -20 °C i 10 minuter.
- Sänk ner objektglasen i en PBS-burk.
- Upprepa steg 3.14 tre gånger.
OBS: Använd denna metod för alla följande tvättsteg. - Ta bort PBS från objektglasen och täck omedelbart med 100 μL blockerande lösning med 2-5 % BSA i PBS-T.
- Tillsätt blockeringslösning till varje objektglas och täck med paraffinfilm.
- Inkubera i 1 timme i rumstemperatur (15–25 °C).
- Späd de primära antikropparna i den blockerande lösningen med hjälp av de förhållanden som anges i avsnittet Reagenser och lösningar.
- Ta bort den blockerande lösningen från objektglasen.
- Tillsätt omedelbart utspädda antikroppar och täck objektglasen med parafilm för att förhindra att objektglaset blir torrt.
- Inkubera över natten vid 4 °C.
- Tvätta objektglasen 3 - 5 gånger med PBS-T nästa dag.
- Förbered utspädda sekundära antikroppar och DNA-färg.
- Ta bort överflödigt PBS-T från objektglasen.
- Tillsätt utspädda sekundära antikroppar och DNA-färg. Inkubera i 45 minuter i rumstemperatur (15-25 °C).
- Tvätta objektglasen 3 - 5 gånger med PBS-T.
- Ta bort eventuell vätska från objektglasen.
- Tillsätt en droppe histologimonteringsmedium till varje sektion.
- Täck objektglaset med en glaskåpa.
- Ta bilder av färgade objektglas med ett fluorescerande mikroskop.
4. GSIS (glukosstimulerad insulinutsöndringsanalys)
- Bered tre olika lösningar: KREBS-lösning med låg glukoshalt, KREBS-lösning med hög glukoshalt och KREBS-lösning med låg glukoshalt med KCl.
- Värm alla lösningar i ett 37 °C vattenbad.
- Välj noggrant ut cirka 10 - 15 kluster av liknande storlek med hjälp av en 1000 μL pipettspets och överför dem till ett 1,5 ml rör tillsammans med en liten mängd differentierat medium för att undvika att klustren torkar ut.
OBS: Klustren ska vara synliga för blotta ögat, men om inte, placera plattan som innehåller differentierade kluster under ett inverterat mikroskop för att välja ut klustren och överföra dem till ett 1.5 ml rör. - Placera röret med kluster och medium på ett rörställ och vänta tills klustren sjunker till botten av röret.
- Aspirera långsamt supernatanten med en 200 μL pipett och tillsätt 200 μL KREBS-lösning med lågt glukosvärde.
- Inkubera öarna i lösningen med låg glukoshalt i 1 timme vid 37 °C.
OBS: För att säkerställa korrekt bedömning av klusterantal och konsistens i experiment, är det lämpligt att kontrollera om det finns alla kluster i lösningen under överföringen, eftersom de tenderar att fästa vid röret. - Ta ut slangen ur inkubatorn och aspirera långsamt 200 μl KREBS-lösning utan att aspirera några kluster.
- Tillsätt 200 μl KREBS-lösning med lågt glukosvärde och inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
- Sug upp volymen 200 μl KREBS-lösning med lågt glukosvärde i ett 500 μL rör och förvara det omedelbart vid -80 °C för insulinmätningar. Upprepa för separata behandlingar.
- För att tvätta klungorna, tillsätt 200 μl KREBS-lösning utan glukos till röret med klasarna. Låt klustren lägga sig till botten av röret och ta försiktigt bort supernatanten utan att störa klustren.
- Tillsätt 200 μl KREBS-lösning med högt glukosvärde och inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
- Sug upp 200 μl KREBS med högt glukosvärde i en 500 μL slang och förvara den omedelbart vid -80 °C för insulinmätning. Upprepa för separata behandlingar.
- För att tvätta klungorna, tillsätt 200 μl KREBS-lösning utan glukos till röret med klasarna. Låt klustren lägga sig till botten av röret och ta försiktigt bort supernatanten utan att störa klustren.
- Tillsätt 200 μl KCl KREBS-lösning och upprepa för separata behandlingar.
- Inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
- Sug upp 200 μL KCl KREBS-lösning i en 500 μL slang och förvara den omedelbart vid -80 °C för insulinmätningar. Upprepa för andra behandlingar.
- Tillsätt 50 μL ultrarent vatten och fortsätt att mäta det totala insulininnehållet.
- Tillsätt 150 μl sur etanollösning till röret med öar och ultrarent vatten.
- Förvara proverna vid 4 °C över natten (12–15 timmar).
- Följande dag, virvla varje prov.
- Utför ultraljudsbehandling med en elektrisk sonikator inställd på 20% effekt i 1 s för att säkerställa fullständig lys av ö-vävnaden.
Upprepa steg 4.21 tills det inte finns några kvarvarande kluster synliga. - Centrifugera alla prover vid 10 000 × g i 10 minuter och behåll supernatanten.
- Mät DNA-koncentrationen med hjälp av en nanodroppsspektrofotometer, som sedan kan användas för att normalisera insulinmätningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs i detta dokument erbjuder ett mycket effektivt tillvägagångssätt för att differentiera β-liknande celler från hPSCs10. Denna process använder ett 2D-odlingssystem som är lätt skalbart, vilket möjliggör dess användning i olika experimentella miljöer, såsom inlärningsdifferentiering, mindre projekt och laboratorier och pilottester för att bedöma potentialen hos en iPSC-linje för differentiering.
Det är viktigt att karakterisera de funktionella egenskaperna hos differentierade β-celler i öar för att få insikt i glukoshomeostas. Detta uppnås vanligtvis genom olika experiment såsom immunfärgning för β-cellsmarkörer och insulinuttryck, samt glukosstimulerad insulinutsöndring (GSIS) -analyser, som testar ö-funktion som svar på låga och höga glukoskoncentrationer12,13. β-celler har signaturgener, inklusive Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 och Neurod1, som är avgörande för att etablera och upprätthålla β-cellidentitet9. Immunfärgningstekniker är värdefulla för att undersöka proteinuttryck och lokalisering inom vävnadssnitt. Immunfärgning för β-cellsmarkörer kan bedöma uttrycksnivåerna av viktiga markörer för bukspottkörtelns härstamning, vilket ger insikter i differentieringsprocessens trohet och optimering för specifika tillämpningar 9,12.
I denna studie användes Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)14 hESC-reporterlinjen för att differentiera kluster som består av olika celltyper, inklusive β-celler som liknar de som finns i mänskliga naturliga öar. Figur 2 i detta dokument ger viktiga resultat om effektiviteten och noggrannheten i differentieringsprocessen. Resultaten visar på en hög anrikning av insulinuttryckande celler i bukspottkörteln, och dessa celler uppvisar glukosstimulerad insulinutsöndring. Detta indikerar framgångsrik generering av funktionella β-liknande celler genom differentieringsprocessen.
De differentierade cellerna stimulerades med låga och höga glukoskoncentrationer, och GSIS-resultaten visade att klustren som härrörde från Mel1-celler fungerade på liknande sätt som öar i sitt insulinutsöndringssvar på glukos. De Mel1-härledda klustren visade sig utsöndra 100 gånger mer insulin som svar på höga glukoskoncentrationer jämfört med låga glukoskoncentrationer. Specifikt var insulinhalten 0,003 ± 0,002 % vid 3,3 mM lågt glukos och 0,236 ± 0,197 % vid 16,7 mM högt glukos.
Klustren som härrörde från Mel1 INS-GFP hESCs utsattes för ytterligare analyser för att bestämma deras sammansättning och funktionalitet, utöver GSIS-analysen. Specifikt undersöktes uttrycket av β-cellssignaturgener och förekomsten av olika celltyper inom klustren. Resultaten visade att bukspottkörtelns härstamning som erhålls från denna process är starkt anrikad i insulinpositiva celler, vilket indikerar en hög grad av framgång i differentieringsprocessen av hESCs till β-cellsliknande celler. Vidare undersöktes uttrycket av signaturgener, såsom Nkx6.1 och Pdx1, som är viktiga för etablering och upprätthållande av β-cellsidentiteter. Analysen visade att cirka 25 % och 40 % av cellerna uttryckte Nkx6.1 respektive Pdx1, vilket ger ytterligare bevis för att klustren innehöll differentierade β-liknande celler (medelvärde Nkx6.1+ celler per kluster 24.9 % ± 6.2 %, n=9 kluster, Pdx1+-celler 40.2 % ± 6.2 %, n=9, SEM, figur 2). Dessutom innehöll klustren andra celltyper, till exempel glukagonpositiva celler, som stod för cirka 15 % av den totala cellpopulationen. Dessa celler finns vanligtvis i alfaceller på inhemska Langerhanska öar, vilket tyder på att klustren liknar mänskliga öar när det gäller cellsammansättning.
Figur 1: Differentiering av hPSCs mot pankreas β-celler. (A) Schematisk framställning av in vitro-riktad differentiering av hPSCs till pankreas β-celler, som omfattar sex på varandra följande steg: definitiv endoderminduktion, primitiv tarmrörsbildning, posterior foregut fate specification, pankreas stamcellsgenerering, pankreas endokrin stambildning och slutligen pankreas- β-celldifferentiering. Differentiering av bukspottkörteln β celler använder viktiga stadier av utvecklingen av mänskliga öar, med reglering av specifika cellsignalvägar vid specifika tidpunkter. B27: B-27 Tillägg; Ri: rho-associerad proteinkinashämmare eller ROCK-hämmare; T3: sköldkörtelhormon; KGF: humant KGF/FGF-7-protein; RepSox: Aktivin/Nodal/TGF-β signalvägshämmare; Hämmar ALK5; RA: Retinsyra; ZS: zinksulfat; UFH: ofraktionerat heparin; XX: gammasekretashämmare XX; APH: aficiolin; Europeiska fonden för justering för globaliseringseffekter: epidermal tillväxtfaktor. LDN: BMP-hämmare III, LDN-212854; Cyklo: Cyklopamin- KAAD. (B) Bilder av cellulär morfologi tagna vid olika stadier av differentiering från pluripotenta stamceller till pankreas β-celler. Den första bilden visar humana pluripotenta stamceller på den första dagen av differentiering (monolager av HPSC). (C) På dag 11 befinner sig cellerna i bukspottkörtelns stamcellsstadium. Skalstapel på 100 μm. (D) På dag 12 bildas kluster i mikrobrunnarna på 6-hålsplattan efter dissociation av celler i pankreasprogenitorstadiet. (E) På dag 13 befinner sig klustren i en 6-hålsplatta med lågt fäste. Skalstapel på 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kluster erhållna från differentierade Mel1 InsGFP/w hESC reporterlinje14 utvärderades med avseende på förekomst av insulinproducerande celler som uttrycker β-cellsmognadsmarkörer. (A) Immunofluorescensbilder av hoparna togs från kryomoldsnitt (5 μm) med hjälp av konfokalmikroskopi med snurrskiva, vilket avslöjade dominansen av insulinproducerande celler (cirka 60 %) jämfört med glukagonproducerande celler (cirka 15 %) (n=9 kluster, cirka 18 000 celler, SEM). (B) Immunofluorescensbilder av klustren erhölls från kryomoldsnitt (5 μm) med hjälp av konfokalmikroskopi med snurrande disk, som visade dominansen av insulinproducerande celler som samuttrycker bukspottkörtelns β-cellsmarkörer Nkx6.1 (n=9 kluster, cirka 18 000 celler). (C) ImageJ-cellräknarmakro, speciellt utformad för immunfärgning av markörer, användes för att bestämma andelen insulinpositiva, glukagonpositiva och β-cellsmarkörer Nkx6.1-positiva celler och β-cellsmarkörer Pdx1-positiva celler. (D) Den glukosstimulerade insulinutsöndringen av Mel1 InsGFP/w hESC-härledda kluster utvärderades, vilken uppvisade en 100-faldig ökning som svar på hög glukosstimulering (16,7 mM glukos) i de differentierade klustren (n=9, SEM). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Sammanfattning av mediesammansättningen för riktad differentiering. Denna tabell ger en sammanfattning av mediesammansättningen som används för varje dag/stadium av riktad differentiering ovanpå stamcellsmatris och medium, tillsammans med den glukosstimulerade insulinutsöndringsbufferten. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den framgångsrika differentieringen av hPSCs till pankreas-β-celler beror på optimering av alla aspekter av rutinmässig odling och passage av de utvalda hPSCs. Detta inkluderar att säkerställa att cellinjen har en normal karyotyp, är negativ för mykoplasmainfektion och är fri från plasmid- eller virusvektorgenom. Dessutom, när man använder hiPSC, är det viktigt att undvika att använda den tidigaste passagen, som fortfarande genomgår omprogrammering, för pilotexperiment. Dessa experiment bör utföras i liten skala för att identifiera den hPSC-linje som har den bästa differentieringspotentialen och det optimala antalet passager.
Andra parametrar som kan påverka differentieringseffektiviteten inkluderar kvaliteten på det stamcellsmedium som används, beläggningsdensiteten och antalet passager10,12. Detta protokoll har optimerats för att maximera effektiviteten i differentieringen genom att se till att alla relevanta parametrar är optimerade10.
Differentieringsmedier med specifika formuleringar används i varje steg för att stödja differentieringen av hPSCs till β-celler. Activin A och en Wnt-agonist används i differentieringsmediet för att initiera övergången till definitiva endodermceller. Under det primitiva tarmrörsstadiet tillsätts KGF till mediet för att främja ytterligare differentiering till β-celler15, och denna inkludering av KGF bibehålls från dag 6 till 8, vilket skiljer sig från det ursprungliga protokollet av Sui, Egli, et al.10. Under pankreasstadiet optimeras den specifika mediesammansättningen för att förbättra uttrycket av Pdx1-transkriptionsfaktorn. Detta uppnås genom att använda en hög koncentration av retinsyra (RA), KGF och LDN193189, vilket hämmar benmorfogenetiska proteinvägen(BMP) 8. När differentieringen fortskrider till det endokrina stadiet modifieras odlingsmediet för att nedreglera Notch-signalering. Detta uppnås genom att införliva XXI, en γ-sekretashämmare, tillsammans med T3 (sköldkörtelhormon), RA och RepSox, en hämmare av Activin/BMP/TGF-β väg8. Denna specifika kombination av föreningar används för att främja differentieringen av bukspottkörtelns stamceller till endokrina stamceller. Slutligen, för att optimera den direkta differentieringsprocessen, introduceras aphidicolin (APH) under differentieringen från pankreasprogenitorer till endokrina progenitorer. Detta tillägg av APH syftar till att ytterligare förbättra differentieringen av β-celler, och det representerar en distinkt modifiering från det ursprungliga protokollet som föreslagits av Sui, Egli, et al.10,11.
Under differentieringsprocessen är det viktigt att övervaka celltätheten och förhindra översammanflöde, eftersom detta kan hindra korrekt differentiering. Kulturer med hög densitet kan upprätthålla ett högt Oct4-uttryck, vilket hämmar differentiering till definitiv endoderm. Att ta bort ROCK-hämmaren under det första tvättsteget är viktigt för att initiera differentiering och tillåta att det pluripotenta tillståndet för hPSC ändras. Att använda en fluorescensmarkör, såsom Mel1 INS-GFP med en GFP integrerad vid insulinlokus, underlättar bedömningen av differentieringsframsteg vid pankreasprogenitor- och β-cellsstadierna, vilket underlättar nedströmsexperiment14.
Det nuvarande protokollet för att differentiera humana pluripotenta stamceller till pankreasliknande β-liknande celler har visat variation i effektivitet mellan olika hPSC-linjer10. Dessutom uppvisar de resulterande β-liknande cellerna funktionell omognad jämfört med mänskliga bukspottkörtelöar, vilket visar lägre insulinutsöndring per cell. För att ytterligare ta itu med denna begränsning kan mognad in vivo av β-liknande celler uppnås genom transplantation av ö-organoider till djurmodeller under de sista stadierna av differentiering 6,7.
Trots dessa begränsningar har differentieringen av hPSCs till pankreas-β-celler betydande potential jämfört med befintliga metoder 8,9,10. Denna teknik gör det möjligt att producera ett stort antal β-cellliknande celler som svarar på glukos och uttrycker β-cellsmarkörer (Pdx1 och Nkx6.1, se figur 2). Detta görs utan de etiska, tekniska och källmässiga begränsningar som är förknippade med användningen av mänskliga bukspottkörtelöar. Dessutom har denna teknik potential att tillämpas på individanpassad medicin, eftersom patientspecifika β-celler kan genereras för läkemedelstestning och sjukdomsmodellering 4,6,7. Tekniken kan också ha framtida tillämpningar vid behandling av diabetes som innebär förlust eller dysfunktion av bukspottkörtelns β-celler 4,6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ines Cherkaoui fick stöd av ett Diabetes UK-studentskap (BDA 18/0005934) till GAR, som också tackar Wellcome Trust för ett Investigator Award (212625/Z/18/Z), UKRI MRC för ett programbidrag (MR/R022259/1), Diabetes UK för projektbidrag (BDA16/0005485), CRCHUM för startfonder, Innovation Canada för ett John R. Evans Leader Award (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) för projektbidrag, och CIHR, JDRF för ett teambidrag (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion och Dr Harry Leitch för deras hjälp med generering och kultur av mänskliga hiPSCs, NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre) Organoid facility, London.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube | Starlabs | S1615-5500 | |
| 6-well Cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 165218 | |
| AggreWell 400 6-well plate | STEMCELL Technologies | 34425 | |
| Anti-Glucagon | Sigma-aldrich | G2654-100UL | |
| Anti-Insulin | Dako | A0564 | |
| Anti-NKX6.1 | Novus Biologicals | NBP1-49672SS | |
| Anti-PDX1 | Abcam | ab84987 | |
| Aphidicolin | Sigma-Aldrich | A4487 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A3803-100G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Calcium/Magnesium free D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Cyclopamine-KAAD | Calbiochem | 239804 | |
| D-(+)-Glucose,BioXtra | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Disodium hydrogen phosphate, anhydrous | Sigma-Aldrich | 94046-100ML- | |
| DMEM plus GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566016 | For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. |
| DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
| Ethanol | VWR | 20821.33 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
| Gamma-Secretase Inhibitor XX | Thermo Fisher Scientific | J64904 | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100. |
| Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21435 | |
| Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150187 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H3375-500G | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H1399 | |
| Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0094 | |
| Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 295426 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Agar Scientific | AGG4582 | |
| LDN193189 | Sigma-Aldrich | SML0559-5MG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272-500G | |
| OCT Compound 118 mL | Agar Scientific | AGR1180 | |
| PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Penicillin-Streptomycin (PS) | Thermo Fisher Scientific, | 15070-063 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Recombinant Human EGF Protein | R&D Systems | 236-EG-200 | |
| Rectangular cover glasses, 22×50 mm | VWR | 631-0137 | |
| RepSox (Hydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72394 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS. |
| Shandon Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium dihydrogen phosphate anhydrous | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
| STEMdiff Endoderm | STEMCELL Technologies | 5110 | |
| StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium. |
| Stemolecule All-Trans Retinoic Acid | Reprocell | 04-0021 | |
| Thyroid Tormone 3 (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| TrypL Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P2287-500ML | |
| Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture | Thermo Fisher Scientific | 38071 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | Z4750 |
References
- Kolios, G., Moodley, Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Nair, G. G., Tzanakakis, E. S., Hebrok, M. Emerging routes to the generation of functional β-cells for diabetes mellitus cell therapy. Nature Reviews Endocrinology. 16 (9), 506-518 (2020).
- Diagnosis and classification of diabetes mellitus. American Diabetes Association. Diabetes Care. 32 (Supplement_1), S62-S67 (2009).
- Sui, L., et al. β-Cell Replacement in mice using human Type 1 diabetes nuclear transfer embryonic stem cells. Diabetes. 67 (1), 26-35 (2018).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. Generation of insulin-producing pancreatic β-cells from multiple human stem cell lines. Nature Protocols. 16 (9), 4109-4143 (2021).
- Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (8), 1940-1953 (2007).
- Sui, L., Leibel, R. L., Egli, D. Pancreatic β-cell differentiation from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68 (2018).
- Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), 141553 (2021).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. Metabolic and functional specialisations of the pancreatic β-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity. Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).
- Micallef, S. J., et al. INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells. Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).
- Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth. Science. 245 (4919), 752-755 (1989).
