实时高通量技术定量人中性粒细胞中性粒细胞胞外诱捕网的形成

摘要

我们介绍一种利用活细胞分析系统结合膜通透性依赖性双染料方法的自动化高通量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）定量技术。

摘要

中性粒细胞是髓系细胞，构成先天免疫系统的重要组成部分。过去十年的研究揭示了中性粒细胞在癌症、自身免疫性疾病以及多种急性和慢性炎症性疾病的发病机制中发挥的其他关键作用，其通过多种机制促进免疫失调的启动和持续，其中包括形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），这种结构在抗微生物防御中至关重要。由于目前在无偏倚、可重复且高效地定量NET形成的检测技术方面存在局限性，限制了我们进一步理解中性粒细胞在健康与疾病中的作用。本文描述了一种自动化的、实时的、高通量的方法，利用活细胞成像平台结合依赖膜通透性的双荧光染料策略，使用两种不同的DNA染料分别标记细胞内和细胞外的DNA，从而定量发生NET形成的中性粒细胞。该方法有助于评估中性粒细胞的生理状态，并可用于筛选靶向NET形成的分子。

引言

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是中性粒细胞在多种炎症刺激下释放出的网状染色质结构。NETs 由 DNA、组蛋白以及多种抗菌蛋白/肽组成，可捕获并杀灭病原微生物，同时引发炎症反应¹。

尽管中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在宿主防御病原体方面具有积极作用，但其作为多种自身免疫性疾病²、血栓形成³、代谢性疾病⁴以及癌症转移性生长⁵潜在驱动因素的作用已引起广泛关注。因此，抑制NET的形成可能是治疗这些疾病的一种潜在治疗策略。然而，尽管目前有一些前景良好的靶向NETs的分子正在研发中⁶，但至今尚无特异性作用于该机制的获批疗法。这一现状至少部分归因于缺乏客观、无偏倚、可重复且高通量的NET形成定量检测方法。

我们建立并报道了一种利用双色活细胞成像平台的新方法^7,8。通过该软件分析用膜通透性核染料和膜不通透性DNA染料染色的中性粒细胞的时间推移图像，并在多个时间点统计NET形成前和形成后的中性粒细胞数量。由于在NET形成过程中，PKCα介导的Lamin B和CDK4/6介导的Lamin A/C解聚调控导致细胞质膜完整性丧失⁹，因此NET形成的中性粒细胞可被膜不通透性DNA染料染色，而健康的中性粒细胞则不能。该方法克服了以往报道的NET形成定量技术存在的问题，能够以自动化方式实现无偏倚、高通量、可重复且准确的NET定量。

方案

在获得受试者知情同意后，根据美国国立卫生研究院（NIH）机构审查委员会（IRB）批准的方案，采集健康人志愿者的中性粒细胞。该方案遵循NIH人类研究伦理委员会的指导原则。

1. 中性粒细胞染色及检测板的制备

1. 根据各机构的指南，在获得适当的书面知情同意后采集外周血，并使用任意所需方法分离中性粒细胞。例如，Ficoll-右旋糖酐法^10,11 是一种常用于从人外周血中分离中性粒细胞的方法。
   注意：尽管本文所述方法使用人中性粒细胞，但小鼠中性粒细胞也可采用类似方案进行分析。
2. 将中性粒细胞重悬于 Roswell Park Memorial Institute (RPMI；见材料表) 1640 培养基中，浓度为 2.0 × 10⁶ 个中性粒细胞/mL，并将细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管中。
   注意：我们通常不在培养基中添加胎牛血清（FBS），因为 FBS 中的白蛋白会抑制 NET 的形成¹²，而 FBS 中耐热的核酸酶可降解 NET¹³。
3. 每 1.5 mL 中性粒细胞悬液中加入 1 µL 膜通透性红色 DNA 染料（见材料表）。
4. 室温避光孵育 5 分钟，然后在室温下以 2500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
5. 将中性粒细胞重悬于 1 mL RPMI 培养基中，室温下以 2500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复该步骤两次（共洗涤三次）。
6. 将中性粒细胞重悬于 1 mL RPMI 培养基中，使用细胞计数仪进行计数，并将细胞悬液稀释至 1.5 × 10⁵ 个中性粒细胞/mL。
7. 每 1 mL 中性粒细胞悬液中加入 4 µL 已预先按 1:100 稀释的膜不通透性绿色 DNA 染料（见材料表）。
8. 将 100 µL 中性粒细胞悬液加入透明的组织培养处理过的 96 孔板的每个孔中（见材料表），每种实验条件设三个复孔。
   注意：我们先前已证实⁷，无论将中性粒细胞接种于经多聚-L-赖氨酸包被或未经包被的孔板中，NET 的形成与定量结果无差异。因此，使用组织培养处理过的孔板即可满足本方法的要求。
9. 向各孔中加入含刺激剂（可选加抑制剂）或其他目标试剂的 RPMI 培养基共 100 µL。始终设置阳性对照孔，加入 500 nM 佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）或 2.5 µM 钙离子载体（A23187）；本实验中使用了 30 µM AKT 抑制剂。
10. 将孔板置于放置于 5% CO₂ 培养箱内的活细胞分析系统中（见材料表）。
    注意：此步骤数分钟后，孔板顶部和底部可能出现冷凝水，这可能影响成像质量。在开始扫描前应彻底擦拭并去除冷凝水。将孔板放入仪器后启动软件并输入扫描程序，在首次扫描前再次仔细擦拭孔板表面。

2. 扫描平板以观察形成NET的中性粒细胞

1. 启动软件（软件详细信息参见材料表）。通过点击左上角的 + 按钮，启动添加容器功能。
2. 选择定时扫描，然后选择新建。
   注意：创建后，如需重复相同的扫描程序，可在下个界面选择复制上一次，并选择已存储的扫描程序。
3. 选择标准模式。设置扫描参数如下：逐细胞选项：无；图像通道：相位差、绿色（采集时间：200 ms）、红色（采集时间：400 ms）；物镜：20倍。
4. 从列表中选择正在使用的培养板，并选择将培养板放置在活细胞成像系统托盘上的具体位置。
5. 选择含有样品的孔，并确定每个孔采集的图像数量。根据每孔图像数量，系统将生成该培养板的预计扫描时长。通常每个孔采集4张图像已足够，但具体数量可能因实验条件和扫描频率而异。
6. 点击创建培养板图谱，输入每个孔的相关信息（例如细胞类型和化合物），并为研究项目命名。
   注意：可提前使用软件中的培养板图谱编辑器准备并保存培养板图谱。保存的图谱数据可在本步骤导入。如需要，也可跳过此步骤，稍后补录信息。即使不输入培养板布局信息，仍可获取数据。但建议输入培养板信息，以便后续分析更加便捷。
7. 在下一个界面中，选择基础分析器作为分析类型，并从下拉列表中选择分析程序，该列表将显示先前使用过的分析定义（非扫描程序）。绿色和红色通道的光谱分离值均可保持为0.0%。
   注意：此步骤可根据需要跳过。
8. 设置扫描时间计划。本实验中，每15–20分钟扫描一次，持续8小时。通过拖动屏幕顶部的白色和灰色条形来设定扫描的起始时间。
   注意：避免扫描过于频繁，否则设备可能因过热而运行异常。每24小时内扫描总时长不应超过12小时。若扫描频率过高，系统可能会发出警告。
9. 在下一个界面中检查扫描设置，然后点击添加到计划以开始扫描。等待初始图像扫描完成，以确认所有设置运行正常。
   1. 有时细胞可能未正确聚焦。此时应检查是否存在冷凝现象（如有则相应擦拭）、培养板是否正确放置在托盘上，或培养板位置是否正确指定等。若细胞仍处于悬浮状态且未沉降至孔底，建议等待约5分钟后再进行扫描。

3. 设置分析定义以定量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）

1. 在“查看”选项卡中打开要分析的研究（容器）。点击屏幕左侧的启动分析，然后选择创建新分析定义。
   1. 如果此前已进行过分析，可通过选择复制现有分析定义并稍作修改来重复使用相同的分析定义。在此情况下，请跳至步骤 3.3。如果无需任何修改而直接使用已有分析定义，请选择使用现有分析定义；但不推荐此做法，因为不同日期实验之间的荧光强度可能存在差异，通常需要进行一些微小调整。
2. 选择基础分析器。使用所有图像通道：相位、绿色、红色和重叠。
   注：尽管我们通常使用绿色和红色对象掩膜来计数 NETs，但在碎片干扰显著时，重叠对象掩膜非常有用。在这种情况下，将使用重叠对象计数作为分子而非绿色对象计数（见步骤 3.9）。如果使用重叠对象计数代替绿色对象计数，则必须准确计数所有红色信号。请调整红色信号设置，以确保在后期时间点拍摄的图像中能正确计数所有弱红色信号的对象，同时避免将碎片计入。
3. 选择 6–8 张具有代表性的样本图像用于训练。本实验应包括以下图像：
   在 0 至 20 分钟之间拍摄的图像，用于优化绿色信号设置，以补偿非 NET 形成性中性粒细胞可能产生的微弱绿色信号；
   使用阳性对照在 3–6 小时之间（具体时间取决于所用刺激方式）拍摄的 NET 数量达到最大时的图像，用于优化绿色信号设置以定义 NET 形成性中性粒细胞；
   约在 1 小时时间点拍摄的图像，用于计数总细胞数（以红色染料染色），因为此时细胞核的红色信号最强（所有细胞均已沉降至孔底），随后因细胞死亡而逐渐减弱；
   包含碎片的图像，用于排除碎片被误计的情况。
4. 设置分析定义。红色对象和绿色对象分别对应所有中性粒细胞的细胞核以及正在形成 NETs 的中性粒细胞。可参考以下示例参数，点击预览当前或预览全部，并逐项调节各参数以优化结果：
   绿色通道设置：分割 - 背景扣除：Top-Hat；半径：100 µM；阈值：0.3 GCU；边缘分割：开启；边缘敏感度：-20；清理 - 填孔：100 µm²；调整大小：0 像素；过滤器 - 面积：最小 20 µm²，最大 500 µm²；偏心率：最大 0.97；平均强度：最小 1.00；
   红色通道设置：分割 - 背景扣除：Top-Hat；半径：10 µM；阈值：1.0 GCU；边缘分割：开启；边缘敏感度：-50；清理 - 填孔：50 µm²；调整大小：0 像素；过滤器 - 面积：最小 20 µm²，最大 400 µm²；平均强度：最小 1.5。
   1. 如果在本不应形成 NETs 的中性粒细胞中出现过强的绿色信号（例如，在 0 分钟未受刺激且细胞核呈分叶状的中性粒细胞），可能是由于绿色通道检测到了红色信号的溢出所致。此时应返回步骤 3.1，打开屏幕左侧的图像图层，并通过光谱解混功能从绿色通道中去除红色信号。
   2. 另一种方法是设置一个仅用细胞核红色染料单染的孔，以明确应从绿色通道中去除多少红色信号。另一方面，绿色信号渗入红色通道通常不会影响分析结果。
      注：在较晚时间点（如 6 小时）拍摄的图像中，即使红色信号的灵敏度较低且未能捕获全部红色信号，也无妨。每张图像中红色对象的最大计数值将被视为该图像中性粒细胞的总数，并在步骤 3.9 中作为分母使用。通常，细胞核红色信号在约 1 小时时间点达到峰值，随后因细胞死亡而逐渐减弱（图 1B）。因此，请根据红色信号最强的图像调整红色信号设置，以确保红色对象被准确计数。
5. 选择要分析的扫描时间和孔位。通常应分析所有时间点和孔。为分析定义提供一个标签。
6. 检查摘要信息后启动分析。分析完成需要数小时（耗时取决于时间点和孔的数量）。启动后，分析定义的名称将显示在“查看”选项卡中研究名称下方，完成后会显示完成日期。
7. 分析完成后，通过双击分析定义名称打开已分析的研究。打开屏幕左侧的图层，检查每个细胞是否被正确标记。若标记不准确，请返回步骤 3.1 并重复后续步骤。
8. 点击屏幕左侧的图形指标以导出数据。选择绿色计数、红色计数或重叠计数（每张图像），然后选择要导出的时间点和孔。若需分组，请在扫描时已正确指定所有孔的情况下选择板图重复。
9. 导出数据。使用适当的软件，根据以下公式计算每种条件/时间点下 NET 形成细胞的百分比。
   
   注：分母采用最大红色对象计数的原因是，红色对象数量在约 1 小时时间点达到峰值，随后因细胞死亡而逐渐减少。

结果

该方法可在每个时间点获取相差图像、红色荧光（膜通透性染料）图像和绿色荧光（膜不通透性染料）图像。随着中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成过程，在相差图像和红色荧光图像中可观察到细胞形态的变化；一旦细胞膜破裂，即可观察到绿色荧光（图1）。在本实验中，形成NET的中性粒细胞通常呈圆形，而非形成网状结构。这是因为仪器分辨率不足以捕捉精细的网状结构，且当细胞膜破裂后，膜不通透的绿色染料会在染色质释放前即对其染色。我们此前已证实⁷，通过共聚焦成像可对孵育4小时后回收的96孔板中的NET进行可视化观察。

当分析参数设置适当时，图像中的所有中性粒细胞均被标记为红色对象，而形成中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的中性粒细胞则被标记为绿色对象（图2）。仪器会记录每个时间点的红色和绿色对象数量。通过绘制每个时间点形成NET的中性粒细胞所占百分比，可直观展示NET形成的动态过程（图3...

讨论

量化NETs的现有方法 离体 存在多种局限性，限制了我们以无偏倚且高通量的方式研究中性粒细胞、中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）及潜在治疗靶点的能力^10,14例如，免疫荧光染色后直接计数形成NET的细胞被认为是NET定量的金标准，但该方法通量低且依赖于操作者的主观判断。通过微孔板检测膜非通透性DNA染料荧光强度的方法可客观、高通量地将胞外DNA作为NET的替代标志物进行定量，但由于该方法无法获得形态学信息，其他类型细胞死亡所释放的DNA可能被误判为NET。另一方面，该方法可实现NET的高通量和客观定量。⁷鉴于能够获取中性粒细胞形态学变化及其时间进程的信息，可准确区分中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）与其他类型的细胞死亡。近期多项研究提示NETs在多种疾病中具有致病作用^2,3,4

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AKT抑制剂	Calbiochem	124028
透明96孔板	Corning	3596
活细胞分析系统	Sartorius	N/A	Incucyte软件（v2019B）
膜不通透性DNA绿色染料	Thermo Fisher Scientific	S7020
细胞核红色染料	Enzo	ENZ-52406	染色后中性粒细胞沉淀呈现蓝紫色。
RPMI	Thermo Fisher Scientific	11835030	含酚红的RPMI可用于实验。