我们介绍一种利用活细胞分析系统结合膜通透性依赖性双染料方法的自动化高通量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）定量技术。
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本文内容
摘要
摘要
中性粒细胞是髓系细胞，构成先天免疫系统的重要组成部分。过去十年的研究揭示了中性粒细胞在癌症、自身免疫性疾病以及多种急性和慢性炎症性疾病的发病机制中发挥的其他关键作用，其通过多种机制促进免疫失调的启动和持续，其中包括形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），这种结构在抗微生物防御中至关重要。由于目前在无偏倚、可重复且高效地定量NET形成的检测技术方面存在局限性，限制了我们进一步理解中性粒细胞在健康与疾病中的作用。本文描述了一种自动化的、实时的、高通量的方法，利用活细胞成像平台结合依赖膜通透性的双荧光染料策略，使用两种不同的DNA染料分别标记细胞内和细胞外的DNA，从而定量发生NET形成的中性粒细胞。该方法有助于评估中性粒细胞的生理状态，并可用于筛选靶向NET形成的分子。
引言
中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是中性粒细胞在多种炎症刺激下释放出的网状染色质结构。NETs 由 DNA、组蛋白以及多种抗菌蛋白/肽组成，可捕获并杀灭病原微生物，同时引发炎症反应1。
尽管中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在宿主防御病原体方面具有积极作用，但其作为多种自身免疫性疾病2、血栓形成3、代谢性疾病4以及癌症转移性生长5潜在驱动因素的作用已引起广泛关注。因此，抑制NET的形成可能是治疗这些疾病的一种潜在治疗策略。然而，尽管目前有一些前景良好的靶向NETs的分子正在研发中6，但至今尚无特异性作用于该机制的获批疗法。这一现状至少部分归因于缺乏客观、无偏倚、可重复且高通量的NET形成定量检测方法。
我们建立并报道了一种利用双色活细胞成像平台的新方法7,8。通过该软件分析用膜通透性核染料和膜不通透性DNA染料染色的中性粒细胞的时间推移图像，并在多个时间点统计NET形成前和形成后的中性粒细胞数量。由于在NET形成过程中，PKC....
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方案
在获得国家卫生研究院（NIH）机构审查委员会（IRB）批准的方案下，经受试者知情同意后采集健康人来源的中性粒细胞。该方案遵循NIH人类研究伦理委员会的指导原则。
1. 中性粒细胞染色及检测板的制备
- 根据各机构的指南，在获得适当的书面知情同意后采集外周血，并使用任意所需方法分离中性粒细胞。例如，Ficoll-葡聚糖法10,11 是一种常用于从人外周血中分离中性粒细胞的方法。
注意：尽管本文讨论的方法使用人中性粒细胞，小鼠中性粒细胞也可采用类似方案进行分析。 - 将中性粒细胞重悬于 Roswell Park Memorial Institute (RPMI；见 材料表) 1640 培养基中，浓度为 2.0 × 106 个中性粒细胞/mL，并将细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管中。
注意：我们通常不在培养基中添加胎牛血清（FBS），因为 FBS 中的白蛋白会抑制 NET 的形成12，而 FBS 中耐热的核酸酶可降解 NET13。 - 每 1.5 mL 中性粒细胞悬液中加入 1 µL 可穿透细胞膜的红色 DN....
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结果
该方法可在每个时间点提供相差图像、红色荧光（膜通透性染料）和绿色荧光（膜不通透染料）图像。随着中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成过程的进行，在相差图像和红色荧光图像中可观察到细胞形态的变化；一旦细胞膜破裂，即可观察到绿色荧光（图1）。在本实验中，形成NET的中性粒细胞通常呈圆形，而非网状结构。这是因为成像设备的分辨率不足以捕捉精细的网状结构，且当细胞膜破裂后，膜不通透的绿色染料会在染色质释放前即对其染色。我们此前已证实7，可通过共聚焦成像对孵育4小时后回收的96孔板中的NET进行可视化观察。
当分析定义设置适当时，图像中的所有中性粒细胞均被标记为红色对象，而形成 NET 的中性粒细胞则被标记为绿色对象（图 2）。机器会统计每个时间点的红色和绿色对象的数量。通过绘制每个时间点形成 NET 的中性粒细胞所占的百分比，可直观展示 NET 形成的时间进程（图 3）。.......
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讨论
量化NETs的现有方法 离体 存在多种局限性，限制了我们以无偏倚且高通量的方式研究中性粒细胞、中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）及潜在治疗靶点的能力10,14例如，免疫荧光染色后直接计数形成NET的细胞被认为是NET定量的金标准，但该方法通量低且依赖于操作者的主观判断。通过微孔板检测膜非通透性DNA染料荧光强度的方法可客观、高通量地将胞外DNA作为NET的替代标志物进行定量，但由于该方法无法获得形态学信息，其他类型细胞死亡所释放的DNA可能被误判为NET。另一方面，该方法可实现NET的高通量和客观定量。7鉴于能够获取中性粒细胞形态学变化及其时间进程的信息，可准确区分中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）与其他类型的细胞死亡。近期多项研究提示NETs在多种疾病中具有致病作用2,3,4
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
感谢美国国立卫生研究院下属的国立关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所科学与技术办公室的光成像部门。本研究由美国国立卫生研究院下属的国立关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所内部研究计划（项目编号：ZIA AR041199）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AKT抑制剂 | Calbiochem | 124028 | |
| 透明96孔板 | Corning | 3596 | |
| 活细胞分析系统 | Sartorius | N/A | Incucyte软件（v2019B） |
| 膜不通透性DNA绿色染料 | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| 细胞核红色染料 | Enzo | ENZ-52406 | 染色后中性粒细胞沉淀呈现蓝紫色。 |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | 含酚红的RPMI可用于实验。 |
参考文献
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288....
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