Summary
हम एक झिल्ली पारगम्यता-निर्भर दोहरे डाई दृष्टिकोण के साथ मिलकर, लाइव सेल विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके न्यूट्रोफिल बाह्य जाल (एनईटीएस) की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक स्वचालित उच्च-थ्रूपुट विधि प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
न्यूट्रोफिल माइलॉयड-वंश कोशिकाएं हैं जो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली का एक महत्वपूर्ण हिस्सा बनाती हैं। पिछले दशक में अतिरिक्त महत्वपूर्ण भूमिकाओं का पता चला है जो न्यूट्रोफिल कैंसर, ऑटोइम्यून बीमारियों और विभिन्न तीव्र और पुरानी भड़काऊ स्थितियों के रोगजनन में खेलते हैं, जिसमें न्यूट्रोफिल बाह्य कोशिकीय जाल (एनईटीएस) का गठन सहित कई तंत्रों के माध्यम से प्रतिरक्षा विकृति की दीक्षा और स्थायित्व में योगदान होता है, जो रोगाणुरोधी रक्षा में महत्वपूर्ण संरचनाएं हैं। एक निष्पक्ष, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और कुशल तरीके से नेट गठन को मापने के लिए तकनीकों में सीमाओं ने स्वास्थ्य और रोगों में न्यूट्रोफिल की भूमिका को और समझने की हमारी क्षमता को प्रतिबंधित कर दिया है। हम इंट्रासेल्युलर और बाह्य डीएनए की छवि के लिए दो अलग-अलग डीएनए रंगों का उपयोग करके एक झिल्ली पारगम्यता-निर्भर दोहरे डाई दृष्टिकोण के साथ मिलकर एक लाइव सेल इमेजिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके नेट गठन से गुजरने वाले न्यूट्रोफिल की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक स्वचालित, वास्तविक समय, उच्च-थ्रूपुट विधि का वर्णन करते हैं। यह पद्धति न्यूट्रोफिल फिजियोलॉजी और परीक्षण अणुओं का आकलन करने में मदद करने में सक्षम है जो नेट गठन को लक्षित कर सकते हैं।
Introduction
न्यूट्रोफिल बाह्य कोशिकीय जाल (एनईटीएस) विभिन्न भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में न्यूट्रोफिल से निकाले गए वेब जैसी क्रोमैटिन संरचनाएं हैं। एनईटीएस डीएनए, हिस्टोन और विभिन्न एंटी-माइक्रोबियल प्रोटीन/पेप्टाइड्स से बने होते हैं, जो संक्रामक रोगजनकों को फंसाते हैं और मारते हैं और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का आह्वान करतेहैं।
जबकि एनईटीएस रोगजनकों के खिलाफ मेजबान रक्षा के लिए फायदेमंद हैं, उन्होंने विभिन्न ऑटोइम्यून बीमारियों2, घनास्त्रता3, चयापचय रोगों4, और कैंसर 5 के मेटास्टेटिक विकास के संभावितचालक के रूप में ध्यान आकर्षित किया है। जैसे, नेट गठन का निषेध इन बीमारियों के लिए एक संभावित चिकित्सीय विकल्प है। हालांकि, विकास6 में कुछ आशाजनक नेट-लक्ष्यीकरण अणुओं के बावजूद, अभी भी कोई अनुमोदित चिकित्सा नहीं है जो विशेष रूप से इस तंत्र को प्रभावित करती है। यह, कम से कम आंशिक रूप से, नेट गठन के लिए उद्देश्य, निष्पक्ष, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उच्च थ्रूपुट परिमाणीकरण विधियों की कमी के कारण है।
हम स्थापित और एक दोहरी रंग लाइव-सेल इमेजिंग मंच 7,8 का उपयोग कर एक नई विधि की सूचना दी. झिल्ली-पारगम्य परमाणु डाई और झिल्ली-अभेद्य डीएनए डाई के साथ दाग न्यूट्रोफिल की समय-चूक छवियों का विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा किया जाता है, और पूर्व और बाद के नेट बनाने वाले न्यूट्रोफिल की संख्या कई समय बिंदुओं पर गिनी जाती है। चूंकि पीकेसीα-मध्यस्थता लैमिन बी और सीडीके 4/6-मध्यस्थता लैमिन ए / सी डिस्सेप्लर9 के नियमन द्वारा नेट गठन के दौरान प्लाज्मा झिल्ली की अखंडता खो जाती है, इसलिए नेट बनाने वाले न्यूट्रोफिल झिल्ली-अभेद्य डीएनए डाई द्वारा दाग दिए जाते हैं जबकि स्वस्थ न्यूट्रोफिल नहीं होते हैं। यह विधि नेट गठन की मात्रा निर्धारित करने के लिए पहले से रिपोर्ट की गई तकनीकों की समस्याओं पर काबू पाती है और स्वचालित तरीके से निष्पक्ष, उच्च-थ्रूपुट, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सटीक शुद्ध मात्रा का ठहराव प्रदान करती है।
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Protocol
राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत सूचित सहमति प्रदान किए जाने के बाद स्वस्थ मानव विषयों से न्यूट्रोफिल प्राप्त किए गए थे। प्रोटोकॉल एनआईएच मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों का पालन करता है।
1. न्यूट्रोफिल का धुंधला होना और परख प्लेट की तैयारी
- प्रत्येक संस्थान के दिशानिर्देश का पालन करते हुए उचित लिखित सूचित सहमति के साथ परिधीय रक्त लें और किसी भी वांछित विधि का उपयोग करके न्यूट्रोफिल को अलग करें। उदाहरण के लिए, Ficoll-dextran विधि10,11 मानव परिधीय रक्त से न्यूट्रोफिल के अलगाव के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है।
नोट: यद्यपि यहां चर्चा की गई विधि मानव न्यूट्रोफिल का उपयोग करती है, माउस न्यूट्रोफिल का विश्लेषण भी एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया जा सकता है। - रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई; सामग्री की तालिका) 1640 मध्यम में 2.0 x 106 न्यूट्रोफिल / एमएल में न्यूट्रोफिल को फिर से निलंबित करें और न्यूट्रोफिल निलंबन को 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें।
नोट: हम आम तौर पर संस्कृति मीडिया में भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) नहीं जोड़ते हैं क्योंकि एफबीएस में एल्बुमिन नेट गठन12 को कम कर सकता है और एफबीएस में गर्मी-स्थिर नाभिक एनईटीएस13 को नीचा दिखा सकता है। - न्यूट्रोफिल निलंबन के 1.5 एमएल प्रति 1 माइक्रोन पर झिल्ली-पारगम्य लाल डीएनए डाई ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें।
- अंधेरे में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
- आरपीएमआई के 1 एमएल में न्यूट्रोफिल को फिर से निलंबित करें, फिर कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 2500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 2x दोहराएं (कुल 3x धोएं)।
- आरपीएमआई के 1 एमएल में न्यूट्रोफिल को फिर से निलंबित करें और सेल काउंटर का उपयोग करके गिनें। न्यूट्रोफिल निलंबन को 1.5 x 105 न्यूट्रोफिल /
- न्यूट्रोफिल निलंबन के 1 एमएल प्रति 1:100-पूर्व-पतला झिल्ली-अभेद्य हरी डीएनए डाई ( सामग्री की तालिकादेखें) के 4 माइक्रोन जोड़ें।
- एक स्पष्ट ऊतक-संस्कृति इलाज 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति न्यूट्रोफिल निलंबन के 100 माइक्रोन रखो ( सामग्री की तालिकादेखें). प्रत्येक स्थिति को तीन प्रतियों में सेट करें।
नोट: हमने पहले7 दिखाया है कि इस विधि के साथ नेट गठन और मात्रा का ठहराव में कोई अंतर नहीं है यदि न्यूट्रोफिल को पॉली-एल-लाइसिन कोटिंग के साथ या बिना प्लेटों में रखा जाता है। इसलिए, टिशू कल्चर उपचारित प्लेट का उपयोग इस विधि के लिए पर्याप्त है। - आरपीएमआई के 100 माइक्रोन जोड़ें जिसमें अवरोधक के साथ या बिना, या संबंधित कुओं में ब्याज के किसी अन्य अभिकर्मक के साथ उत्तेजना अभिकर्मक शामिल हैं। हमेशा 500 एनएम फोरबोल 12-मायरिस्टेट 13-एसीटेट (पीएमए) या 2.5 माइक्रोन कैल्शियम आयनोफोर (ए 23187) जोड़कर सकारात्मक नियंत्रण कुओं का उपयोग करें, यहां 30 माइक्रोन एकेटी अवरोधक का उपयोग किया गया था।
- लाइव सेल विश्लेषण प्रणाली में प्लेट रखें ( सामग्री की तालिकादेखें) जो 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखी गई है।
नोट: इस चरण के कुछ मिनट बाद प्लेट के ऊपर और नीचे संक्षेपण दिखाई दे सकता है। यह उचित इमेजिंग को बाधित कर सकता है। स्कैनिंग शुरू होने से पहले संक्षेपण को अच्छी तरह से पोंछ लें और हटा दें। प्लेट को मशीन में रखें, सॉफ्टवेयर, इनपुट स्कैनिंग प्रोटोकॉल शुरू करें, और फिर पहले स्कैन से ठीक पहले प्लेट को पोंछ लें।
2. नेट बनाने वाले न्यूट्रोफिल की कल्पना करने के लिए स्कैनिंग प्लेट
- सॉफ्टवेयर शुरू करें (सॉफ्टवेयर विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। ऊपरी बाएँ कोने में + दबाकर Add Vessel लॉन्च करें।
- शेड्यूल पर स्कैन चुनें। नया चुनें.
नोट:: एक बार यह बनाया गया है, कॉपी पिछला चुनने और अगली स्क्रीन पर संग्रहीत प्रोटोकॉल का चयन करके एक ही स्कैनिंग प्रोटोकॉल चलाएँ. - मानक चुनें. स्कैन सेटिंग्स को इस प्रकार सेट करें: सेल-दर-सेल विकल्प: कोई नहीं; छवि चैनल: चरण, हरा (अधिग्रहण समय: 200 एमएस), लाल (अधिग्रहण समय: 400 एमएस); उद्देश्य: 20x।
- सूची से उपयोग की जा रही प्लेट चुनें। पोत स्थान का चयन करें जहां लाइव सेल इमेजिंग सिस्टम की ट्रे पर प्लेट डाल करने के लिए.
- कुओं का चयन करें जहां नमूने मौजूद हैं और तय करें कि प्रति अच्छी तरह से कितनी छवियां लेनी हैं। अच्छी तरह से प्रति छवियों की संख्या के आधार पर, थाली के लिए एक अनुमानित स्कैन अवधि उत्पन्न. आमतौर पर, प्रति कुएं 4 छवियां पर्याप्त होती हैं; हालाँकि, यह स्कैन की स्थितियों और आवृत्ति के आधार पर भिन्न हो सकता है।
- अध्ययन के लिए एक नाम प्रदान करने के लिए प्लेट मैप बनाएं पर क्लिक करके प्रत्येक कुएं (जैसे, सेल प्रकार और यौगिक) से जानकारी इनपुट करें।
नोट: प्लेट मैप को सॉफ्टवेयर में प्लेट मैप एडिटर का उपयोग करके पहले से तैयार और सहेजा जा सकता है। सहेजे गए प्लेट मानचित्र डेटा को इस चरण के दौरान आयात किया जा सकता है। यदि वांछित है, तो प्लेट मैप जानकारी दर्ज करना छोड़ दिया जा सकता है और बाद में प्रदर्शन किया जा सकता है। प्लेट लेआउट की जानकारी दर्ज किए बिना भी डेटा प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, बाद के विश्लेषण को आसान बनाने के लिए प्लेट जानकारी इनपुट करने की सिफारिश की जाती है। - अगली स्क्रीन पर, विश्लेषण प्रकार के रूप में मूल विश्लेषक का चयन करें, और ड्रॉप-डाउन सूची से विश्लेषण प्रोटोकॉल चुनें, जो पहले उपयोग की गई विश्लेषण परिभाषाएँ दिखाता है (प्रोटोकॉल स्कैन नहीं करता है)। हरे और लाल दोनों के लिए वर्णक्रमीय अनमिक्सिंग को 0.0% पर छोड़ा जा सकता है।
नोट: यदि वांछित हो, तो इस चरण को छोड़ दिया जा सकता है। - स्कैन शेड्यूल करें। यहाँ प्रयोग के लिए, 8 घंटे के लिए हर 15-20 मिनट पर स्कैन. स्क्रीन के शीर्ष पर सफेद और ग्रे बार खींचकर स्कैन का शुरुआती समय निर्धारित करें।
नोट: बार-बार स्कैन करने से बचें, अन्यथा ओवरहीटिंग के कारण मशीन अच्छी तरह से काम नहीं कर सकती है। स्कैनिंग का समय 24 घंटे प्रति 12 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए। यदि स्कैनिंग बहुत बार होती है तो आपको एक चेतावनी दिखाई दे सकती है। - अगली स्क्रीन पर स्कैन सेटिंग की जाँच करें और स्कैनिंग शुरू करने के लिए शेड्यूल में जोड़ें दबाएं। यह पुष्टि करने के लिए छवियों के प्रारंभिक सेट को स्कैन करने तक प्रतीक्षा करें कि क्या सब कुछ ठीक से काम कर रहा है।
- कभी-कभी कोशिकाओं को ठीक से केंद्रित नहीं किया जा सकता है। उस स्थिति में, जांचें कि क्या संक्षेपण मौजूद है (और तदनुसार पोंछ लें), प्लेट ट्रे पर सही ढंग से सेट है, या प्लेट की स्थिति सही ढंग से निर्दिष्ट है, आदि। यदि कोशिकाएं अभी भी तैर रही हैं और कुएं के नीचे तक नहीं बस गई हैं, तो स्कैनिंग से पहले लगभग 5 मिनट प्रतीक्षा करें।
3. नेट की मात्रा निर्धारित करने के लिए विश्लेषण परिभाषा निर्धारित करना
- दृश्य टैब पर विश्लेषण किए जाने वाले अध्ययन (पोत) को खोलें। स्क्रीन के बाईं ओर लॉन्च विश्लेषण दबाएं। नई विश्लेषण परिभाषा बनाएँ चुनें.
- यदि कोई विश्लेषण पहले किया जा चुका है, तो मौजूदा विश्लेषण परिभाषा की प्रतिलिपि बनाएँ का चयन करके मामूली परिवर्तनों के साथ उसी विश्लेषण परिभाषा का उपयोग करें। इस स्थिति में, 3.3 कदम पर जाएँ. यदि बिना किसी परिवर्तन के विश्लेषण का उपयोग कर रहे हैं, तो मौजूदा विश्लेषण परिभाषा का उपयोग करें चुनें; यह अनुशंसित नहीं है क्योंकि प्रतिदीप्ति का स्तर अलग-अलग दिनों में परख के बीच भिन्न हो सकता है, और कुछ मामूली सुधार आमतौर पर आवश्यक होते हैं।
- मूल विश्लेषक का चयन करें. सभी छवि चैनलों का उपयोग करें: चरण, हरा, लाल और ओवरलैप।
नोट: हालांकि हम आमतौर पर नेट गिनने के लिए हरे और लाल ऑब्जेक्ट मास्क का उपयोग करते हैं, ओवरलैप ऑब्जेक्ट मास्क उपयोगी होता है जब मलबे मायने रखता है। ऐसे मामलों में, ओवरलैप ऑब्जेक्ट गणना की संख्या का उपयोग हरे ऑब्जेक्ट गणना के बजाय अंश के रूप में किया जाएगा (चरण 3.9 देखें)। यदि हरे ऑब्जेक्ट गणना के बजाय ओवरलैप ऑब्जेक्ट गणना का उपयोग किया जाता है, तो सभी लाल संकेतों को सही ढंग से गिना जाना चाहिए। बाद के समय बिंदुओं में ली गई छवियों में कम लाल सिग्नल वाली सभी लाल वस्तुओं को गिनने के लिए लाल सिग्नल की सेटिंग को समायोजित करें, लेकिन मलबे की गिनती करने के लिए नहीं। - प्रशिक्षण के लिए 6 - 8 प्रतिनिधि नमूना छवियों चुनें. यहां प्रयोग के लिए, निम्नलिखित चित्र शामिल करें:
गैर-नेट बनाने वाले न्यूट्रोफिल में उत्पन्न होने वाले सूक्ष्म हरे संकेतों की भरपाई के लिए ग्रीन सिग्नल सेटिंग को अनुकूलित करने के लिए 0 से 20 मिनट के बीच ली गई छवियां
सकारात्मक नियंत्रण के साथ अधिकतम नेट की छवियां, नेट बनाने वाले न्यूट्रोफिल को परिभाषित करने के लिए हरी सिग्नल सेटिंग को अनुकूलित करने के लिए 3-6 घंटे (समय उपयोग की जाने वाली उत्तेजना के आधार पर भिन्न होता है) के बीच लिया जाता है
परमाणु लाल संकेत (सभी कोशिकाओं अच्छी तरह से के नीचे करने के लिए बस गए हैं) के बाद से कुल कोशिकाओं (लाल डाई के साथ सना हुआ) की संख्या की गणना करने के लिए 1 घंटे timepoint के आसपास लिया 1 घंटे timepoint के आसपास लिया छवियों और धीरे-धीरे कोशिका मृत्यु के कारण घट जाती है.
मलबे वाली छवियां, उन्हें गिनने से बाहर करने के लिए। - विश्लेषण परिभाषा सेट करें। लाल वस्तुएं और हरी वस्तुएं क्रमशः सभी न्यूट्रोफिल और एनईटी बनाने वाले नाभिकों के साथ मेल खाती हैं। के निम्न उदाहरण के साथ प्रारंभ करें और पूर्वावलोकन वर्तमान या पूर्वावलोकन सभी दबाएँ, और परिणामों को अनुकूलित करने के लिए प्रत्येक पैरामीटर को संशोधित करें:
हरे रंग के लिए: विभाजन- पृष्ठभूमि घटाव: शीर्ष-टोपी; त्रिज्या: 100 माइक्रोन; दहलीज: 0.3 जीसीयू; एज स्प्लिट: चालू; एज संवेदनशीलता: -20; क्लीनअप-होल फिल: 100 माइक्रोन2; आकार 0 पिक्सेल समायोजित करें; फिल्टर- क्षेत्र: न्यूनतम 20 माइक्रोन2, अधिकतम 500 माइक्रोन2; विलक्षणता: अधिकतम 0.97; औसत तीव्रता: न्यूनतम 1.00
लाल के लिए: विभाजन- पृष्ठभूमि घटाव: शीर्ष-टोपी; त्रिज्या: 10 माइक्रोन; दहलीज: 1.0 जीसीयू; एज स्प्लिट: चालू; एज संवेदनशीलता: -50; क्लीनअप-होल भरण: 50 माइक्रोन2; आकार 0 पिक्सेल समायोजित करें; फिल्टर- क्षेत्र: न्यूनतम 20 माइक्रोन2, अधिकतम 400 माइक्रोन2; औसत तीव्रता: मिनट 1.5।- यदि न्यूट्रोफिल में अत्यधिक हरा संकेत दिखाई देता है जो एनईटीएस नहीं बनना चाहिए (उदाहरण के लिए, 0 मिनट पर अस्थिर न्यूट्रोफिल जिसमें लोबुलेटेड नाभिक है), तो यह हरे रंग के चैनल में पाए गए लाल सिग्नल के अतिप्रवाह के कारण हो सकता है। ऐसे मामले में, चरण 3.1 पर लौटें, स्क्रीन के बाईं ओर छवि परतें खोलें, और स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग का उपयोग करके हरे चैनल से लाल संकेतों को हटा दें।
- एक अन्य विकल्प परमाणु लाल डाई के साथ एकल धुंधला के लिए एक अच्छी तरह से सेट करने के लिए स्पष्ट करने के लिए कितना लाल संकेत हरे चैनल से हटाया जाना चाहिए. दूसरी ओर, आमतौर पर लाल चैनल में हरे रंग का संकेत रक्तस्राव विश्लेषण को प्रभावित नहीं करता है।
नोट: इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि लाल सिग्नल की संवेदनशीलता कम है और सभी लाल सिग्नल बाद के समय बिंदुओं (जैसे, 6 घंटे टाइमपॉइंट) पर ली गई छवियों में कैप्चर नहीं किए जाते हैं। प्रत्येक छवि में लाल वस्तु गिनती की अधिकतम संख्या छवि में न्यूट्रोफिल की कुल संख्या के रूप में माना जाता है और कदम 3.9 पर भाजक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. आमतौर पर, परमाणु लाल संकेत 1 घंटे टाइमपॉइंट के आसपास चोटी और धीरे-धीरे कोशिका मृत्यु(चित्रा 1बी)के कारण कम हो जाते हैं। इसलिए, अधिकतम लाल संकेतों के साथ छवियों में लाल वस्तुओं को सही ढंग से गिनने के लिए लाल सिग्नल की सेटिंग को समायोजित करें।
- विश्लेषण किए जाने वाले स्कैन समय और कुओं का चयन करें। आमतौर पर, सभी समय बिंदुओं और कुओं का विश्लेषण किया जाना चाहिए। विश्लेषण परिभाषा के लिए एक लेबल प्रदान करें।
- सारांश की जाँच करें और विश्लेषण लॉन्च करें। विश्लेषण पूरा होने में कुछ घंटे लगते हैं (अवधि टाइमपॉइंट और कुओं की संख्या पर निर्भर करती है)। एक बार लॉन्च होने के बाद, विश्लेषण परिभाषा का नाम व्यू टैब में अध्ययन के नाम के तहत दिखाया जाएगा, और जब यह किया जाएगा तो पूरी तारीख दिखाई जाएगी।
- इसके पूरा होने के बाद, विश्लेषण परिभाषा के नाम पर डबल क्लिक करके विश्लेषण किए गए अध्ययन को खोलें। स्क्रीन के बाईं ओर परतें खोलें और जांचें कि क्या प्रत्येक सेल सही ढंग से चिह्नित है। यदि यह सही ढंग से चिह्नित नहीं है, तो चरण 3.1 पर वापस लौटें और बाद के चरणों को दोहराएँ।
- डेटा निर्यात करने के लिए स्क्रीन के बाईं ओर ग्राफ़ मीट्रिक पर क्लिक करें। ग्रीन काउंट, रेड काउंट या ओवरलैप काउंट (प्रति छवि) का चयन करें, और फिर निर्यात किए जाने वाले टाइमपॉइंट और कुओं का चयन करें। चयन समूहीकरण के लिए, स्कैनिंग करते समय सभी कुओं को सही ढंग से निर्दिष्ट किया जाता है, तो प्लेट मैप प्रतिकृति का चयन करें।
- डेटा निर्यात करें. एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निम्नलिखित समीकरण द्वारा प्रत्येक स्थिति/टाइमपॉइंट के लिए नेट बनाने वाली कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करें।
नोट: हर अधिकतम लाल वस्तु गिनती क्यों है इसका कारण यह है कि लाल वस्तु की संख्या लगभग 1 घंटे टाइमपॉइंट पर होती है और कोशिका मृत्यु के कारण धीरे-धीरे कम हो जाती है।
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Representative Results
यह विधि चरण विपरीत, लाल फ्लोरोसेंट (झिल्ली-पारगम्य डाई) और हरे फ्लोरोसेंट (झिल्ली-अभेद्य डाई) छवियों को प्रत्येक टाइमपॉइंट पर ली गई प्रदान करती है। नेट बनाने की प्रक्रिया के साथ, चरण विपरीत और लाल फ्लोरोसेंट छवियों में रूपात्मक परिवर्तन देखे जाते हैं, और एक बार झिल्ली भंग हो जाने के बाद, हरी प्रतिदीप्ति (चित्रा 1) देखी जा सकती है। इस परख में, नेट बनाने वाले न्यूट्रोफिल आम तौर पर वेब जैसी संरचना बनाने के बजाय गोल होते हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि मशीन का रिज़ॉल्यूशन ठीक वेब जैसी संरचना और झिल्ली को पकड़ने के लिए पर्याप्त नहीं है, अभेद्य हरी डाई क्रोमैटिन को दाग देती है, इससे पहले कि यह झिल्ली टूट जाए। हमने पहले7 दिखाया है कि एनईटीएस को 4 घंटे इनक्यूबेशन के बाद प्राप्त 96-अच्छी प्लेटों में कॉन्फोकल इमेजिंग के उपयोग से कल्पना की जा सकती है।
जब विश्लेषण परिभाषा उचित रूप से सेट की जाती है, तो छवि में सभी न्यूट्रोफिल को लाल वस्तु के रूप में चिह्नित किया जाता है और नेट बनाने वाले न्यूट्रोफिल को हरी वस्तु(चित्रा 2)के रूप में चिह्नित किया जाता है। मशीन प्रत्येक समय बिंदु पर लाल और हरे रंग की वस्तुओं की संख्या की गणना करती है। नेट गठन के समय पाठ्यक्रम प्रत्येक समय बिंदु (चित्रा 3) पर नेट बनाने न्यूट्रोफिल के प्रतिशत की साजिश रचने के द्वारा कल्पना की है. संभावित अणु जो नेट गठन (जैसे, एकेटी अवरोधक) को लक्षित करते हैं, इस पद्धति का उपयोग करके उच्च थ्रूपुट तरीके से परीक्षण किया जा सकता है।
चित्रा 1: नेट गठन के दौर से गुजर न्यूट्रोफिल में रूपात्मक परिवर्तन। (ए) मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल जो 3 घंटे के लिए 2.5 माइक्रोन कैल्शियम आयनोफोर के साथ उत्तेजित थे। (बी) चरण विपरीत छवि, लाल चैनल (झिल्ली-पारगम्य परमाणु डाई), हरे चैनल (झिल्ली-अभेद्य डीएनए डाई), और विलय की छवि के प्रतिनिधि एकल-कोशिका दृश्य। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: न्यूट्रोफिल और नेट की सॉफ्टवेयर मान्यता दिखा प्रतिनिधि छवियों. मानव स्वस्थ स्वयंसेवकों से न्यूट्रोफिल को 1 घंटे के लिए 2.5 माइक्रोन कैल्शियम आयनोफोर के साथ प्रेरित किया गया था। चरण विपरीत इमेजिंग और प्रत्येक संकेत या मुखौटा की मढ़ा छवियों को दिखाया जाता है. नाभिक (ए) झिल्ली-पारगम्य लाल डाई के साथ दाग दिया गया था, और सॉफ्टवेयर को मान्यता दी गई और गिना गया (बी) नाभिक नीले रंग में चिह्नित किया गया था, जबकि एनईटी (सी) झिल्ली-अभेद्य हरे रंग की डाई के साथ दाग दिया गया था और सॉफ्टवेयर ने उन्हें (डी) बैंगनी के रूप में चिह्नित किया था। यदि (ई) ओवरसेंसिंग या (एफ) अंडरसेंसिंग होता है, तो पैरामीटर को बदलने की आवश्यकता हो सकती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: नेट बनाने न्यूट्रोफिल के प्रतिशत का समय पाठ्यक्रम। न्यूट्रोफिल को 25 एनएम फोरबोल, 12-मायरिस्टेट 13-एसीटेट (पीएमए) या 2.5 माइक्रोन कैल्शियम आयनोफोर द्वारा एनईटी को प्रेरित करने या आरपीएमआई में अस्थिर छोड़ दिया गया था। नेट गठन को अवरुद्ध करने के लिए 30 माइक्रोन एकेटी अवरोधक का जोड़ किया गया था। छवियों 6 घंटे के लिए हर 20 मिनट सॉफ्टवेयर द्वारा प्राप्त किए गए थे. नेट बनाने वाली कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना लाल वस्तु गणना (= सभी न्यूट्रोफिल की संख्या) द्वारा हरी वस्तु गणना (= नेट बनाने वाली कोशिकाओं की संख्या) को विभाजित करके की गई थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
नेट पूर्व विवो यों करने के लिए वर्तमान तरीकों में कई कमियां हैं जो न्यूट्रोफिल, नेट और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों का निष्पक्ष और उच्च-थ्रूपुट तरीके से अध्ययन करने की हमारी क्षमता को सीमित करती हैं10,14. उदाहरण के लिए, इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होने के बाद नेट बनाने वाली कोशिकाओं की प्रत्यक्ष गिनती, जिसे एनईटी के परिमाणीकरण के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है, कम-थ्रूपुट है और ऑपरेटर के व्यक्तिपरक दृश्य पर निर्भर है। झिल्ली-अभेद्य डीएनए डाई की प्रतिदीप्ति का पता लगाने वाली एक प्लेट परख एक उद्देश्य और उच्च-थ्रूपुट तरीके से एनईटीएस के सरोगेट मार्कर के रूप में बाह्य डीएनए की मात्रा निर्धारित करती है, लेकिन चूंकि इस विधि द्वारा रूपात्मक जानकारी प्राप्त नहीं की जा सकती है, इसलिए अन्य प्रकार की कोशिका मृत्यु द्वारा डीएनए रिलीज को गलत तरीके से नेट के रूप में माना जा सकता है। दूसरी ओर, विधि एनईटीएस7 के उच्च-थ्रूपुट और उद्देश्य मात्रा का ठहराव प्रदान करती है। यह देखते हुए कि न्यूट्रोफिल के रूपात्मक परिवर्तनों और इसके समय पाठ्यक्रम के बारे में जानकारी प्राप्त की जा सकती है, एनईटी को अन्य प्रकार की कोशिका मृत्यु से सटीक रूप से भेदभाव किया जाता है। हाल के कागजात विभिन्न रोगों 2,3,4,5 में नेट की रोगजनक भूमिका का सुझाव दिया है, और नेट के निषेध वर्तमान में एक संभावित आशाजनक उपचार लक्ष्य6 के रूप में माना जाता है. विधि तेजी से और निष्पक्ष तरीके से कई नेट-लक्ष्यीकरण अणुओं का पता लगाने के लिए फायदेमंद होगी।
सफल परिमाणीकरण के लिए कई महत्वपूर्ण बिंदु हैं। झिल्ली-पारगम्य डीएनए बाध्यकारी डाई का विकल्प उचित इमेजिंग के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण कारक है। कुछ रंजक साइटोटॉक्सिक होते हैं, और अन्य रंगों को नाभिक में प्रवेश करने में समय लगता है। चूंकि नेट गठन अपेक्षाकृत तेजी से होता है, इसलिए डाई को नाभिक में जल्दी से प्रवेश करना चाहिए। हमने इन कारकों को ध्यान में रखते हुए एक परमाणु लाल डाई ( सामग्री की तालिकादेखें) चुना। प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या भी सटीक गिनती के लिए महत्वपूर्ण है. यदि यह बहुत भीड़ है, तो प्रत्येक न्यूट्रोफिल के हरे और लाल संकेत एक दूसरे के साथ ओवरलैप होंगे, जिससे प्रत्येक न्यूट्रोफिल को अलग से गिनना मुश्किल हो जाता है।
इस पद्धति की कुछ सीमाएँ हैं। जबकि इंट्रा-परख परिवर्तनशीलता इस परख में उत्कृष्ट है, अंतर-परख परिवर्तनशीलता स्पष्ट नहीं है। ऐसा इसलिए है क्योंकि न्यूट्रोफिल, यहां तक कि जब सभी स्थितियों के साथ एक ही दाता से अलग रखा जाता है, तो अलग-अलग दिनों में अलग-अलग कार्य करते हैं और दूसरे दिन किए गए परखों के बीच कुछ भिन्नता हो सकती है। इसलिए, यदि अलग-अलग दिनों के डेटा को संयोजित करने की आवश्यकता है, तो परख को सावधानीपूर्वक डिजाइन करना आवश्यक है: उदाहरण के लिए, प्रत्येक दिन रोग और नियंत्रण समूहों से नमूनों की समान संख्या शामिल करना। इसके अलावा, हालांकि नेट गठन का मूल्यांकन उद्देश्य है एक बार विश्लेषण परिभाषा परिभाषित की जाती है (चरण 3), परिभाषा को स्वयं सेट करना कुछ हद तक प्रत्येक ऑपरेटर के व्यक्तिपरक दृष्टिकोण पर निर्भर करता है। चरण 3.3 और 3.4 व्यक्तिपरक निर्णयों को बाहर करने और अंतर-परख परिवर्तनशीलता को यथासंभव छोटा रखने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। इसके अलावा, एक सकारात्मक नियंत्रण (जैसे, 500 एनएम पीएमए या 2.5 माइक्रोन कैल्शियम आयनोफोर द्वारा उत्तेजित) को हर बार शामिल किया जाना चाहिए, ताकि सभी नेट को गिनने के लिए उपयुक्त कट-ऑफ सेट किया जा सके।
दूसरी ओर, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अन्य प्रकार की कोशिका मृत्यु को एनईटीएस के रूप में गिना जा सकता है। जब कोशिका झिल्ली का उल्लंघन होता है, या डीएनए को बाह्य अंतरिक्ष में छोड़ा जाता है, तो हरे रंग के संकेत देखे जाएंगे। जब कोशिकाएं नेक्रोटिक सेल मौत से गुजरती हैं या एपोप्टोटिक कोशिकाएं माध्यमिक परिगलन से गुजरती हैं, तो उनके डीएनए को हरी डाई7 से दाग दिया जाएगा। कोशिका मृत्यु के इन प्रकार सहित गलत तरीके से रोकने के लिए, समय पाठ्यक्रम और रूपात्मक परिवर्तन पर विचार किया जाना चाहिए. जबकि यह आमतौर पर माध्यमिक परिगलन प्रदर्शन करने के लिए एपोप्टोटिक कोशिकाओं के लिए 8 घंटे से अधिक लेता है, नेट गठन उत्तेजना15 के बाद 3-6 घंटे के बीच चोटियों. विशिष्ट रूपात्मक परिवर्तन चरण विपरीत इमेजिंग, जो कोशिका मृत्यु7 के प्रकार के भेदभाव के लिए फायदेमंद है द्वारा देखा जा सकता है.
कुल मिलाकर, विधि हमें उच्च थ्रूपुट और वस्तुनिष्ठ तरीके से नेट को सटीक रूप से निर्धारित करने में सक्षम बनाती है।
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Disclosures
लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।
Acknowledgments
हम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय गठिया और मस्कुलोस्केलेटल और त्वचा रोगों के राष्ट्रीय संस्थान में विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यालय में लाइट इमेजिंग सेक्शन का धन्यवाद करते हैं। इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (ZIA AR041199) के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ आर्थराइटिस एंड मस्कुलोस्केलेटल एंड स्किन डिजीज के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
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