Summary
Vi presenterer en automatisert metode med høy gjennomstrømning for å kvantifisere nøytrofile ekstracellulære feller (NET) ved hjelp av analysesystemet for levende celler, kombinert med en membranpermeabilitetsavhengig dual-dye-tilnærming.
Abstract
Neutrofiler er myeloide avstamningsceller som danner en viktig del av det medfødte immunsystemet. Det siste tiåret har avslørt flere nøkkelroller som nøytrofiler spiller i patogenesen av kreft, autoimmune sykdommer og ulike akutte og kroniske inflammatoriske tilstander ved å bidra til initiering og videreføring av immundysregulering gjennom flere mekanismer, inkludert dannelsen av nøytrofile ekstracellulære feller (NET), som er strukturer som er avgjørende for antimikrobielt forsvar. Begrensninger i teknikker for å kvantifisere NET-dannelse på en objektiv, reproduserbar og effektiv måte har begrenset vår evne til å forstå nøytrofilenes rolle i helse og sykdommer. Vi beskriver en automatisert, sanntids, høy gjennomstrømningsmetode for å kvantifisere nøytrofiler som gjennomgår NET-dannelse ved hjelp av en levende cellebildeplattform kombinert med en membranpermeabilitetsavhengig dual-dye-tilnærming ved hjelp av to forskjellige DNA-fargestoffer for å avbilde intracellulært og ekstracellulært DNA. Denne metoden er i stand til å bidra til å vurdere nøytrofil fysiologi og teste molekyler som kan målrette NET-dannelse.
Introduction
Neutrofile ekstracellulære feller (NET) er nettlignende kromatinstrukturer ekstrudert fra nøytrofiler som respons på ulike inflammatoriske stimuli. NET er sammensatt av DNA, histoner og forskjellige antimikrobielle proteiner / peptider, som fanger og dreper smittsomme patogener og påkaller inflammatoriske responser1.
Mens NET er gunstig for vertsforsvar mot patogener, har de samlet oppmerksomhet som en potensiell driver for ulike autoimmune sykdommer2, trombose3, metabolske sykdommer4 og metastatisk vekst av kreft5. Som sådan er inhibering av NET-dannelse et potensielt terapeutisk alternativ for disse sykdommene. Til tross for noen lovende NET-målrettede molekyler i utvikling6, er det imidlertid fortsatt ingen godkjent terapi som spesifikt påvirker denne mekanismen. Dette er, i det minste delvis, på grunn av mangelen på objektive, objektive, reproduserbare og kvantifiseringsmetoder med høy gjennomstrømning for NET-dannelse.
Vi etablerte og rapporterte en ny metode ved hjelp av en dual-color live-cell imaging plattform 7,8. Time-lapse-bilder av nøytrofiler farget med membranpermeabelt kjernefysisk fargestoff og membran-ugjennomtrengelig DNA-fargestoff analyseres av programvaren, og antall pre- og post-NET-dannende nøytrofiler telles på flere tidspunkter. Siden integriteten til plasmamembranen går tapt under NET-dannelse ved regulering av PKCα-mediert Lamin B og CDK4/6-mediert Lamin A/C-demontering9, blir NET-dannende nøytrofiler farget av membranugjennomtrengelig DNA-fargestoff mens friske nøytrofiler ikke er det. Denne metoden overvinner problemene med tidligere rapporterte teknikker for å kvantifisere NET-dannelse og gir objektiv, høy gjennomstrømning, reproduserbar og nøyaktig NET-kvantifisering på en automatisert måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nøytrofiler fra friske mennesker ble oppnådd etter informert samtykke ble gitt under National Institutes of Health (NIH) Institutional Review Board (IRB) godkjent protokoll. Protokollen følger retningslinjer fra NIHs forskningsetiske komité.
1. Farging av nøytrofiler og fremstilling av analyseplate
- Ta perifert blod med passende skriftlig informert samtykke i henhold til retningslinjene for hvert institutt og isoler nøytrofiler ved hjelp av hvilken som helst ønsket metode. For eksempel er Ficoll-dextran-metoden 10,11 en vanlig metode for isolering av nøytrofiler fra humant perifert blod.
MERK: Selv om metoden diskutert her bruker humane nøytrofiler, kan musenøytrofiler også analyseres ved hjelp av en lignende protokoll. - Resuspendere nøytrofile granulocytter i Roswell Park Memorial Institute (RPMI; se materialfortegnelse) 1640 medium ved 2,0 x 106 nøytrofile granulocytter/ml og plasser nøytrofil suspensjon i 1,5 ml sentrifugerør.
MERK: Vi legger vanligvis ikke til føtalt bovint serum (FBS) til kulturmediet fordi albumin i FBS kan redusere NET-dannelse12 og varmestabil nuklease i FBS kan nedbryte NET13. - Tilsett membranpermeabelt rødt DNA-fargestoff (se materialfortegnelse) ved 1 μL per 1,5 ml nøytrofil suspensjon.
- Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter i mørket. Sentrifuge ved 2500 x g i 5 minutter ved romtemperatur og fjern supernatant.
- Resuspender nøytrofile granulocytter i 1 ml RPMI, sentrifuge deretter ved 2500 x g i 5 minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten. Gjenta 2x (vask totalt 3x).
- Resuspender nøytrofiler i 1 ml RPMI og telle ved hjelp av en celleteller. Fortynn nøytrofil suspensjon til 1,5 x 105 nøytrofiler/ml.
- Tilsett 4 μL 1:100-fortynnet membran-ugjennomtrengelig grønt DNA-fargestoff (se materialtabell) per 1 ml nøytrofil suspensjon.
- Sett 100 μL nøytrofil suspensjon per brønn i en klar vevskulturbehandlet 96-brønnplate (se materialtabell). Angi hver betingelse i tre eksemplarer.
MERK: Vi har tidligere vist7 at det ikke er noen forskjell i NET-dannelse og kvantifisering med denne metoden hvis nøytrofiler plasseres i plater med eller uten poly-L-lysinbelegg. Derfor er bruken av vevskulturbehandlet plate tilstrekkelig for denne metoden. - Tilsett 100 μL RPMI som inneholder stimulusreagenser med eller uten inhibitor, eller noe annet reagens av interesse i respektive brønner. Bruk alltid positive kontrollbrønner ved å tilsette 500 nM phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) eller 2,5 μM kalsiumionofor (A23187), 30 μM AKT-hemmer ble brukt her.
- Plasser platen i analysesystemet for levende celler (se materialtabell) som er plassert i en 5% CO2 -inkubator.
MERK: Det kan oppstå kondens på toppen og bunnen av platen noen minutter etter dette trinnet. Dette kan hemme riktig bildebehandling. Tørk av og fjern kondens grundig før skanningen starter. Plasser platen i maskinen, start programvaren, skriv inn skanneprotokollen, og tørk deretter platen like før den første skanningen.
2. Skanningsplate for å visualisere NET-dannende nøytrofiler
- Start programvaren (se Materialfortegnelse for programvaredetaljer). Start Legg til fartøy ved å trykke på + øverst til venstre.
- Velg Skann etter planen. Velg Ny.
MERK: Når dette er opprettet, kjører du den samme skanneprotokollen ved å velge Kopier forrige og velge lagret protokoll på neste skjermbilde. - Velg Standard. Angi skanneinnstillinger som: Celle-for-celle-alternativer: Ingen; Bildekanaler: Fase, Grønn (Anskaffelsestid: 200 ms), Rød (Anskaffelsestid: 400 ms); Mål: 20x.
- Velg platen som brukes fra listen. Velg fartøyets plassering, hvor platen skal settes på brettet i bildesystemet med levende celler.
- Velg brønner der det er prøver, og bestem hvor mange bilder som skal tas per brønn. Basert på antall bilder per brønn, generer en estimert skannevarighet for platen. Vanligvis er 4 bilder per brønn tilstrekkelig; Dette kan imidlertid variere avhengig av forholdene og hyppigheten av skanninger.
- Skriv inn informasjonen fra hver brønn (f.eks. celletype og forbindelse) ved å klikke Opprett platekart for å gi et navn til studien.
MERK: Platekartet kan forberedes og lagres på forhånd ved hjelp av platekarteditoren i programvaren. De lagrede platekartdataene kan importeres i løpet av dette trinnet. Om ønskelig kan du hoppe over og utføre informasjon om platekart senere. Data kan også fås uten å legge inn informasjon om plateoppsett. Det anbefales imidlertid å legge inn plateinformasjon for å gjøre den påfølgende analysen enklere. - I det neste skjermbildet velger du Basic Analyzer som analysetype, og velger Analysis Protocol fra rullegardinlisten, som viser tidligere brukte analysedefinisjoner (ikke skanneprotokoller). Spektral utblanding for både grønt og rødt kan etterlates ved 0,0 %.
MERK: Dette trinnet kan hoppes over, hvis ønskelig. - Planlegg skanning. For eksperimentet her, skann på hver 15-20 min i 8 timer . Angi starttidspunktet for skanningen ved å dra den hvite og grå linjen øverst på skjermen.
MERK: Unngå å skanne for ofte, ellers kan det hende at maskinen ikke fungerer bra på grunn av overoppheting. Tid for skanning bør ikke overstige 12 timer per 24 timer. Det kan hende du ser et varsel hvis skanningen er for hyppig. - Kontroller skanneinnstillingen på neste skjermbilde og trykk på Legg til i tidsplan for å starte skanningen. Vent til det første settet med bilder er skannet for å bekrefte om alt fungerer bra.
- Noen ganger kan det hende at celler ikke er riktig fokusert. I så fall må du kontrollere om det er kondens (og tørke deretter), platen er riktig satt på brettet, eller plasseringen av platen er riktig spesifisert, etc. Hvis cellene fortsatt flyter og ikke har slått seg ned til bunnen av brønnen, vent i ca. 5 minutter før du skanner.
3. Angi analysedefinisjonen for å kvantifisere NET
- Åpne studien (fartøyet) som skal analyseres på Vis-fanen. Trykk på Start analyse til venstre på skjermen. Velg Opprett ny analysedefinisjon.
- Hvis en analyse er utført tidligere, bruker du den samme analysedefinisjonen med mindre endringer ved å velge Kopier eksisterende analysedefinisjon. I dette tilfellet går du til trinn 3.3. Hvis du bruker analysen uten endringer, velger du Bruk eksisterende analysedefinisjon; Dette anbefales ikke fordi fluorescensnivået kan variere mellom analysene på forskjellige dager, og noen mindre korreksjoner er vanligvis nødvendige.
- Velg Grunnleggende analysator. Bruk alle bildekanaler: Fase, Grønn, Rød og Overlapp.
MERK: Selv om vi vanligvis bruker grønne og røde objektmasker for å telle NET, er overlappingsobjektmaske nyttig når rusk betyr noe. I slike tilfeller vil antall overlappende objekter bli brukt som teller i stedet for grønt objektantall (se trinn 3.9). Hvis overlappende objektantall brukes i stedet for grønt objektantall, må alle røde signaler telles riktig. Juster innstillingen for rødt signal for å telle alle røde objekter med lavt rødt signal i bilder tatt i senere tider, men ikke for å telle rusk. - Velg 6–8 representative eksempelbilder for opplæring. For eksperimentet her inkluderer du følgende bilder:
Bilder tatt mellom 0 og 20 minutter for å optimalisere innstillingen for grønt signal for å kompensere for subtile grønne signaler som kan genereres i nøytrofiler som ikke er NET-dannende
Bilder av maksimale NET med positiv kontroll, tatt mellom 3-6 timer (tiden varierer avhengig av stimuleringen som brukes) for å optimalisere den grønne signalinnstillingen for å definere NET-dannende nøytrofiler
Bilder tatt rundt 1 time for å telle antall totale celler (farget med rødt fargestoff) siden det kjernefysiske røde signalet er det sterkeste rundt 1 time (når alle cellene har lagt seg til bunnen av brønnen) og gradvis avtar på grunn av celledød.
Bilder som inneholder rusk, for å utelukke dem fra å bli talt. - Angi analysedefinisjonen. Røde objekter og grønne gjenstander korresponderer med kjerner av alle nøytrofiler og de som danner NET henholdsvis. Start med følgende eksempel på og trykk på Forhåndsvis gjeldende eller Forhåndsvis alle, og moduler hver parameter for å optimalisere resultatene:
For grønn: Segmentering- Bakgrunnssubtraksjon: Topphatt; Radius: 100 μM; Terskel: 0,3 GCU; Kantdeling: På; Kant følsomhet: -20; Opprydding -Hullfylling: 100 μm2; Juster størrelse 0 piksler; Filtre- Areal: min 20 μm2, maks 500 μm2; Eksentrisitet: maks 0,97; Gjennomsnittlig intensitet: min 1,00
For rød: Segmentering- Bakgrunn subtraksjon: Top-Hat; Radius: 10 μM; Terskel: 1,0 GCU; Kant delt: PÅ; Kant følsomhet: -50; Opprydding-hullfylling: 50 μm2; Juster størrelse 0 piksler; Filtre- Areal: min 20 μm2, maks 400 μm2; Gjennomsnittlig intensitet: min 1,5.- Hvis det vises for mye grønt signal i nøytrofiler som ikke skal danne NET (f.eks. ustimulerte nøytrofiler etter 0 minutter som har lobulerte kjerner), kan det skyldes overløp av det røde signalet som er oppdaget i den grønne kanalen. I så fall går du tilbake til trinn 3.1, åpner Bildelag til venstre på skjermen og fjerner de røde signalene fra den grønne kanalen ved å bruke spektral unmixing.
- Et annet alternativ er å sette en brønn for enkeltfarging med kjernefysisk rødt fargestoff for å avklare hvor mye av det røde signalet som skal fjernes fra grønn kanal. På den annen side påvirker vanligvis ikke grønt signal som blør inn i den røde kanalen analysene.
MERK: Det spiller ingen rolle om følsomheten for rødt signal er lav, og ikke alle røde signaler fanges opp i bildene som tas på senere tidspunkter (f.eks. 6 timer). Maksimalt antall røde objekter i hvert bilde regnes som totalt antall nøytrofiler i bildet og vil bli brukt som nevner i trinn 3.9. Vanligvis når kjernefysiske røde signaler rundt 1 time og reduseres gradvis på grunn av celledød (figur 1B). Juster derfor innstillingen for rødt signal for å telle røde objekter riktig i bildene med maksimale røde signaler.
- Velg skannetider og brønner som skal analyseres. Vanligvis bør alle tidspunkter og brønner analyseres. Angi en etikett til analysedefinisjonen.
- Sjekk sammendraget og start analysen. Det tar noen timer for ferdigstillelse av analysen (varigheten avhenger av antall tidspunkter og brønner). Når den er lansert, vil navnet på analysedefinisjonen vises under navnet på studien i Vis-fanen, og den fullstendige datoen vil bli vist når den er ferdig.
- Etter at den er fullført, åpner du den analyserte studien ved å dobbeltklikke på navnet på analysedefinisjonen. Åpne lag til venstre på skjermen og sjekk om hver celle er riktig merket. Hvis det ikke er riktig merket, går du tilbake til trinn 3.1 og gjentar de påfølgende trinnene.
- Klikk på Diagrammetrikk til venstre på skjermen for å eksportere dataene. Velg Grønt antall, rødt antall eller antall overlappinger (per bilde), og velg deretter tidspunktene og brønnene som skal eksporteres. For valgt gruppering velger du Platekart replikerer hvis alle brønnene er riktig angitt når skanningen er fullført.
- Eksporter dataene. Beregn prosentandelen av NET-forming celler for hver tilstand / tidspunkt ved hjelp av følgende ligning ved hjelp av en passende programvare.
MERK: Grunnen til at nevneren er maksimalt antall røde objekter er at antallet røde objekter topper seg på rundt 1 time og reduseres gradvis på grunn av celledød.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden gir fasekontrast, rødt fluorescerende (membranpermeabelt fargestoff) og grønt fluorescerende (membran-ugjennomtrengelig fargestoff) bilder tatt på hvert tidspunkt. Sammen med NET-dannende prosessen observeres morfologiske endringer i fasekontrast og røde fluorescerende bilder, og når membranen brytes, kan grønn fluorescens observeres (figur 1). I denne analysen er NET-dannende nøytrofiler generelt runde, i stedet for å danne nettlignende struktur. Dette skyldes at maskinens oppløsning ikke er høy nok til å fange fin nettlignende struktur og membran, ugjennomtrengelig grønt fargestoff, flekker kromatin før det frigjøres når membranen brytes. Vi har tidligere vist7 at NET kan visualiseres ved hjelp av konfokal avbildning i 96-brønnsplatene hentet etter 4 timers inkubasjon.
Når analysedefinisjonen er riktig innstilt, markeres alle nøytrofile i bildet som rødt objekt og nettdannende nøytrofiler markeres som grønt objekt (figur 2). Maskinen teller antall røde og grønne objekter på hvert tidspunkt. Tidsforløpet for NET-dannelse visualiseres ved å plotte prosentandelen av NET-dannende nøytrofiler ved hvert tidspunkt (figur 3). Potensielle molekyler som retter seg mot NET-dannelse (f.eks. AKT-hemmer) kan testes på en høy gjennomstrømningsmåte ved hjelp av denne metoden.
Figur 1: Morfologiske forandringer i nøytrofile granulocytter som gjennomgår NET-dannelse. (A) Humane perifere blodnøytrofiler som ble stimulert med 2,5 μM kalsiumionofor i 3 timer. (B) Representative enkeltcellevisninger av fasekontrastbilde, rød kanal (membranpermeabelt nukleært fargestoff), grønn kanal (membranugjennomtrengelig DNA-fargestoff) og sammenslått bilde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder som viser programvaregjenkjenning av nøytrofile granulocytter og NET. Nøytrofiler fra humane friske frivillige ble stimulert med 2,5 μM kalsiumionofor i 1 time. Overlappede bilder av fasekontrastavbildning og hvert signal eller maske vises. Kjerner ble farget med (A) membrangjennomtrengelig rødt fargestoff, og programvaren gjenkjente og telte (B) kjerner merket blått mens NET ble farget med (C) membran-ugjennomtrengelig grønt fargestoff og programvaren merket dem som (D) lilla. Hvis (E) oversensing eller (F) under sensing oppstår, kan det hende at parameteren må endres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Tidsforløp for prosentandel av nettdannende nøytrofiler. Nøytrofile granulocytter ble stimulert av 25 nM phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) eller 2,5 μM kalsiumionofor for å indusere NET eller venstre ustimulert i RPMI. Tillegg av 30 μM AKT-hemmer ble gjort for å blokkere NET-dannelse. Bilder ble oppnådd av programvaren hvert 20. minutt i 6 timer. Prosentandelen av NET-dannende celler ble beregnet ved å dele det grønne objektantallet (= antall NET-dannende celler) med det røde objektantallet (= antallet av alle nøytrofiler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nåværende metoder for å kvantifisere NET ex vivo har flere ulemper som begrenser vår evne til å studere nøytrofiler, NET og potensielle terapeutiske mål på en objektiv og høy gjennomstrømningsmåte10,14. For eksempel er direkte telling av NET-dannende celler etter immunfluorescerende farging, betraktet som gullstandarden for kvantifisering av NET, lav gjennomstrømning og avhengig av operatørens subjektive syn. En plateanalyse som påviser fluorescensen av membran-ugjennomtrengelig DNA-fargestoff kvantifiserer ekstracellulært DNA som en surrogatmarkør for NET på en objektiv og høy gjennomstrømningsmåte, men siden morfologisk informasjon ikke kan oppnås ved denne metoden, kan DNA-frigjøring ved andre typer celledød feilaktig betraktes som NET. På den annen side gir metoden høy gjennomstrømning og objektiv kvantifisering av NET7. Gitt at informasjon om morfologiske endringer av nøytrofiler og dets tidsforløp kan oppnås, blir NET nøyaktig diskriminert fra andre typer celledød. Nylige artikler har antydet at NET har en patogen rolle ved ulike sykdommer 2,3,4,5, og hemming av NET anses for tiden som et potensielt lovende behandlingsmål6. Metoden vil være gunstig for å utforske flere NET-målrettede molekyler på en rask og upartisk måte.
Det er flere viktige punkter for vellykket kvantifisering. Valg av membranpermeabelt DNA-bindende fargestoff er en svært viktig faktor for riktig avbildning. Noen fargestoffer er cytotoksiske, og andre fargestoffer tar tid å trenge inn i kjerner. Siden NET-dannelsen er relativt rask, må fargestoffet trenge raskt inn i kjernene. Vi valgte et kjernefysisk rødt fargestoff (se materialtabell) med tanke på disse faktorene. Antall celler i hver brønn er også viktig for nøyaktig telling. Hvis det er for overfylt, vil grønne og røde signaler fra hver nøytrofil overlappe hverandre, noe som gjør det vanskelig å telle hver nøytrofil separat.
Det er noen begrensninger for denne metoden. Selv om variabiliteten i intraanalysen er utmerket i denne analysen, er variasjonen mellom analysene uklar. Dette skyldes at nøytrofiler, selv når de er isolert fra samme donor med alle forhold holdt konsistente, virker annerledes på forskjellige dager, og det kan være noe variasjon mellom analyser utført på en annen dag. Derfor, hvis data fra forskjellige dager må kombineres, er det nødvendig å nøye utforme analysen: for eksempel å inkludere samme antall prøver fra sykdoms- og kontrollgrupper på hver dag. I tillegg, selv om evalueringen av NET-formasjon er objektiv når analysedefinisjonen er definert (trinn 3), avhenger selve definisjonen noe av det subjektive synet til hver operatør. Trinn 3.3 og 3.4 er de kritiske trinnene for å utelukke subjektive vurderinger og holde variasjonen mellom analysene så liten som mulig. Også en positiv kontroll (f.eks. nøytrofiler stimulert av 500 nM PMA eller 2,5 μM kalsiumionofor) må inkluderes hver gang for å sette riktig grenseverdi for å telle alle NET.
På den annen side må det bemerkes at andre typer celledød kan regnes som NET. Når cellemembranen brytes, eller DNA frigjøres til ekstracellulært rom, vil grønne signaler bli observert. Når celler gjennomgår nekrotisk celledød eller apoptotiske celler gjennomgår sekundær nekrose, vil deres DNA bli farget av grønt fargestoff7. For å unngå unøyaktig inklusjon av disse typene celledød, må tidsforløp og morfologiske endringer vurderes. Mens det vanligvis tar mer enn 8 timer for apoptotiske celler å utføre sekundær nekrose, topper NET-dannelsen mellom 3-6 timer etter stimulering15. Distinkte morfologiske endringer kan sees ved fasekontrastavbildning, noe som er gunstig for differensiering av type celledød7.
Samlet sett gjør metoden oss i stand til å kvantifisere NET nøyaktig på en høy gjennomstrømning og objektiv måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Light Imaging Section i Office of Science and Technology ved Nasjonalt institutt for leddgikt og muskuloskeletale og hudsykdommer i National Institutes of Health. Denne forskningen ble støttet av det intramurale forskningsprogrammet fra Nasjonalt institutt for leddgikt og muskuloskeletale og hudsykdommer ved National Institutes of Health (ZIA AR041199).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J.
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
