Summary
פרוטוקול זה מציג גישה אופטימלית לייצור מודלים של חולדות מהונדסות-גנטית. וירוס הקשור לאדנו (AAV) משמש להעברת תבנית תיקון DNA, ואלקטרופורציה משמשת להעברת ריאגנטים CRISPR-Cas9 כדי להשלים את תהליך עריכת הגנום בעובר בן 2 תאים.
Abstract
טכנולוגיית עריכת גנום נמצאת בשימוש נרחב לייצור בעלי חיים מהונדסים גנטית, כולל חולדות. הזרקה ציטופלזמית או פרו-גרעינית של תבניות תיקון DNA וריאגנטים CRISPR-Cas היא שיטת המסירה הנפוצה ביותר לעוברים. עם זאת, סוג זה של micromanipulation מחייב גישה לציוד מיוחד, הוא מייגע, ודורש רמה מסוימת של מיומנות טכנית. יתר על כן, טכניקות מיקרו-הזרקה לעיתים קרובות גורמות להישרדות נמוכה יותר של העובר בשל הלחץ המכני על העובר. בפרוטוקול זה, פיתחנו שיטה אופטימלית לספק תבניות גדולות לתיקון DNA שיעבדו בשילוב עם עריכת גנום CRISPR-Cas9 ללא צורך במיקרו-הזרקה. פרוטוקול זה משלב מסירת DNA בתיווך AAV של תבניות תורם DNA חד-גדילי יחד עם אספקת CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) על ידי אלקטרופורציה לשינוי עוברים דו-תאיים. באמצעות אסטרטגיה חדשנית זו, ייצרנו בהצלחה מודלים ממוקדים של חולדות נוקבות הנושאות החדרה של רצפי DNA בגודל של 1.2 עד 3.0 קילובייט עם יעילות של בין 42% ל -90%.
Introduction
הפיתוח של כלי עריכת גנום מבוססי קריספר האיץ את יכולתנו ליצור ביעילות מודלים חדשים ומתוחכמים יותר של חולדות מהונדסות-גנטית. רנ"א חד-מנחי, יחד עם נוקלאז Cas9, משולב ליצירת קומפלקסים של ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) המכוונים לרצפי דנ"א בעלי עניין בתוך הגנום וגורמים לשבירת DNA דו-גדילי. מכיוון שמנגנוני תיקון דנ"א תאי מועדים לשגיאות, החדרות ומחיקות (INDELs) מוכנסות במהלך תהליך התיקון שיכולות לשבש את תפקוד גן המטרה. כאשר יש העברה משותפת של רצף דנ"א מהונדס רצוי (תבנית תיקון) יחד עם ריאגנטים לעריכת גנום, החדרת תבנית התיקון באזור המכיל את שבירת הדנ"א הדו-גדילי מתרחשת בתהליך שנקרא תיקון מכוון הומולוגיה (HDR). זוהי אסטרטגיה יעילה ליצירת מודלים של בעלי חיים עם החדרות/החלפות ממוקדות של DNA (נוק-אין). מגבלה אחת היא שרצפי דפיקה הם לעתים קרובות גדולים בגודלם, מה שהוכח כמפחית את יעילות עריכת הגנים, ובכך מקשה על יצירת המודל הרצוי1. אסטרטגיות להגברת היעילות כללו ליניאריזציה של תבניות תיקון DNA דו-גדילי (dsDNA) ו-DNA חד-גדילי (ssDNA) ושינוי כימי של תבניות תיקון DNA 2,3,4. בנוסף, מיקרו-הזרקה פרו-גרעינית יחד עם תרכובות מעוררות HDR, יישום פולסים חשמליים בשילוב עם מיקרו-הזרקה, ומיקרו-הזרקה מתוזמנת לעוברים דו-תאיים נוסו כולם 5,6,7. למרות ההצלחה של כמה מגישות אלה, השילוב של רצפי DNA גדולים מ -1.0 קילובייט נותר מאתגר מבחינה טכנית.
אלקטרופורציה, שהיא שיטה נפוצה להחדרת ריאגנטים לקווי תאים בתרבית, מציעה חלופה למיקרו-הזרקה להעברת רכיבי CRISPR-Cas9 לעוברים. אלקטרופורציה עוברית, שהודגמה לראשונה בעוברי חולדות8, שימשה מאז בהצלחה כשיטת לידה בעכברים 9,10,11,12,13, חזירים 14,15 ואורגניזמים אחרים מודל של בעלי חיים 16,17,18. עוברים, המרחפים בתווך המכיל ריאגנטים מסוג CRISPR-Cas9, מוכנסים לקובט או למגלשת זכוכית בין שתי אלקטרודות ונתונים לפולסים ישירים של זרמים חשמליים. זה יוצר פתחים חולפים בזונה פלוצ'ידה ובקרום הפלזמה העוברית שדרכם רכיבי CRISPR-Cas9 נכנסים לעוברים. בדרך כלל, פולסי "נקבוביות" חשמליים ברמה בינונית משמשים ליצירת הפתחים הזמניים ולאחריהם "פולסי העברה" חשמליים ברמה נמוכה יותר המאפשרים תנועה של רכיבי עריכת הגנום הטעונים שלילית. אלקטרופורציה של עוברים היא יעילה, בעלת תפוקה גבוהה וקלה לביצוע. עם זאת, בעוד אלקטרופורציה של עוברים הוכחה כמוצלחת מאוד עבור הצגת תבניות תיקון ssDNA קטנות (<200 bp), ישנם דיווחים מעטים על אלקטרופורציה מוצלחת של תבניות תיקון גדולות יותר (>1.0 kb)13,19. מגבלת גודל זו מייצגת מגבלה גדולה של אלקטרופורציה של עוברים ליצירת מודלים של בעלי חיים הדורשים החדרות גדולות.
בהקשר של ריפוי גנטי, וירוסים הקשורים באדנו (AAVs) שימשו זה מכבר ככלי להעברת חומר גנטי בשל יעילותם בהדבקה in vivo של תאים מתחלקים ולא מתחלקים, חוסר פתוגניות, ואינטגרציה גנומית נדירה20,21. לאחרונה, מחקרים נוספים שילבו AAVs עם טכנולוגיית CRISPR-Cas9 כדי להציג תבניות תיקון DNA וריאגנטים CRISPR 22,23,24. גישה זו מאפשרת משלוח של תבניות תיקון DNA גדולות יותר ללא צורך בטכניקות מיקרו-הזרקה.
מסלול HDR פעיל יותר בשלבים המאוחרים של S ו- G2 של מחזור התא25,26. במחקרים שבוצעו במבחנה, עליות משמעותיות ביעילות הדפיקה הושגו על ידי העברת CRISPR-Cas9 RNPs ותבניות תיקון DNA לתאים מסונכרנים G2 או על ידי הגבלת נוכחות חלבון Cas9 לשלבים מאוחרים של S ו- G2 באמצעות חלבון היתוך Cas9-Geminin2. יתר על כן, יש אירוע גדול של הפעלת גנום זיגוטי (ZGA) המתרחש במהלך שלב G2 המורחב של העובר בשלב 2 תאים, וזה קשור למצב כרומטין פתוח. משערים כי הדבר מספק ל-CRISPR-Cas9 RNPs ולתבניות תיקון נגישות רבה יותר לדנ"א הגנומי.
מטרתנו הייתה להתבסס על כל התצפיות הללו, על ידי שילוב גישת AAV עם אלקטרופורציה של עוברים כדי להציג CRISPR-Cas9 RNPs בשלב 2 התאים של התפתחות העובר. אסטרטגיה זו מנצלת את יכולת המסירה הגדולה יותר של תבנית תיקון DNA של AAV, את הקלות הטכנית של אלקטרופורציה ואת נקודת הזמן האופטימלית יותר של 2 תאים לנגישות גנומית במהלך התפתחות העובר כדי ליצור שיטה יעילה להנדסה גנטית ממוקדת של החדרות DNA. כפי שמודגש בפרוטוקול זה, השיטה האופטימלית שלנו מאפשרת ייצור של מודלים ממוקדים של חולדות הנושאות החדרות של רצפי DNA בגודל של 1.2 עד 3.0 קילובייט ללא צורך בטכניקות מיקרו-הזרקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מיזורי (פרוטוקול ACUC #25580) ובוצעו בהתאם להנחיות המפורטות במדריך לשימוש וטיפול בחיות מעבדה.
1. מסירת תבנית תיקון DNA בתיווך AAV
- תכנן את מבנה הדנ"א כך שיכיל את רצף הדפיקה הרצוי בין שתי זרועות הומולוגיה. אורכי זרועות הומולוגיה טיפוסיים הם 300-500 bp אורך. ודא שכל תבנית תיקון הדנ"א (זרועות הומולוגיה + רצף דפיקה רצוי) מוקפת בחזרות מסוף הפוכות (ITR) על ידי שיבוט לתוך עמוד שדרה פלסמיד מתאים ואריזה לתוך ssAAV1 רקומביננטי או ssAAV6 (סרוטיפים 1 או 6).
הערה: אם רצף המטרה של sgRNA קיים בתבנית תיקון הדנ"א, חשוב להנדס מוטציות שקטות כדי לשבש רצף זה ובכך למנוע עריכה בתיווך CRISPR-Cas9 של האלל הממוקד נכון.
זהירות: וקטורים נגיפיים רקומביננטיים AAV אינם משולבים ומסווגים כ-BSL-1. טכניקות אספטיות סטנדרטיות משמשות לציפה וטיפול בעוברים שנחשפו לנגיף. - הוסף ssAAV1 מהונדס או ssAAV6 (ארוז עם תבנית תיקון DNA) ל- 30 μL של מדיהKSOM-R 27,28 לריכוז סופי של 3 × 107 עותקי גנום (GC)/μL תחת שמן מינרלי בצלחת פטרי 35 מ"מ.
- מקם זיגוטות עם גרעינים גלויים במדיה KSOM-R המכילה ssAAV מהונדס.
הערה: באמצעות פרוטוקול זה אין צורך לדלל את zona pellucida כמו סרוטיפים AAV 1 ו 6 מסוגלים לעבור בקלות עבור משלוח יעיל של תבנית תיקון DNA. - יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 ולחות מרבית למשך 18-20 שעות כדי לאפשר התמרה ויראלית מספקת.
2. הכנת אלקטרופורציה
- למחרת, הכינו תערובת אלקטרופורציה המכילה 100 ng/μL של sgRNA ו-100 ng/μL של חלבון Cas9 מדולל במדיה Opti-MEM בצינור סטרילי נטול RNase. מערבבים בעדינות.
- יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר היווצרות RNP.
- בזמן הדגירה, הפעל את האלקטרופורטור וחבר מוביל לאלקטרודת שקופיות זכוכית מרווח 1.5 מ"מ.
- הגדר פרמטרים של אלקטרופורציה כמתואר בטבלה 1.
3. אלקטרופורציה של עובר דו-תאי
- פיפטה עדינה 5 μL של תערובת אלקטרופורציה CRISPR בין שתי האלקטרודות על מגלשת הזכוכית, תוך הקפדה לא להכניס בועות אוויר לתמיסה.
- הסר את העובר בשלב 2 התאים מתמיסת AAV. סדרו את העוברים בשלב 2 התאים בתערובת מבלי לאפשר להם לגעת בצידי האלקטרודות. זה נעשה כדי למנוע ליזיס.
- לחץ על לחצן Ohm כדי למדוד את העכבה. בדוק כדי לוודא שהעכבה היא בין 0.100 ל- 0.300 kΩ. נפח התגובה ישנה את העכבה (הוסף נפח כדי להקטין את העכבה וחסר נפח כדי להגדיל את העכבה).
- לחץ על התחל. התהליך אורך מספר שניות.
- הסר עוברים מיד לאחר האלקטרופורציה ושטוף 3 פעמים בטיפות טריות של 30 μL של מדיה KSOM-R.
- החזירו את העוברים לאינקובטור של 37°C עם 5%CO2 ולחות מרבית לתרבית חוץ גופית בטיפות של 500 μL של מדיה KSOM-R תחת שמן מינרלי. לחלופין, העבר עוברים בניתוח לחולדה מדומה מדומה בהריון לאחר 1.5 יום (dpc) כדי להעמיד צאצאים חיים.
איור 1: סכמטי של מסירת דנ"א בתיווך AAV וצינור אלקטרופורציה של עוברים דו-תאיים עבור עריכת גנום CRISPR-Cas9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות הפרוטוקול, קיימת העברה יעילה בתיווך AAV של תבנית תיקון הדנ"א המאפשרת HDR יעיל ביותר לאחר שעוברים בעלי 2 תאים עוברים אלקטרופורציה עם CRISPR-Cas9 RNPs. כפי שניתן לראות בווידיאו, תהליך אלקטרופורציה מוצלח גורם להיווצרות בועות על כל אלקטרודה (איור 2C) והעכבה נשארת בטווח של 0.100 ו-0.300 kΩ. לאחר אלקטרופורציה, אין זה נדיר שעוברים מתנפחים וממלאים את החלל הפריביטלי בתוך הזונה פלוצ'ידה (איור 3). נפיחות זו אמורה לשכך לאחר מספר שעות בתרבית. זה גם לא נדיר לראות אחוז קטן (עד 20%) של אירועי איחוי תאי לאחר אלקטרופורציה של עוברים דו-תאיים (איור 3). איחוי תאי יכול להימנע באופן פוטנציאלי על-ידי יישור זהיר של ציר אופקי במקום יישור ציר אנכי בין האלקטרודות (איור 2B). עם זאת, בדרך כלל אנו פשוט משליכים את כל העוברים המאוחים לאחר תהליך האלקטרופורציה.
מסירת הדנ"א בתיווך AAV שלנו עם עובר דו-תאי בטכניקת אלקטרופורציה CRISPR-Cas9 RNP הוכחה כיעילה ביותר ליצירת מודלים של חולדות עם החדרות ממוקדות. כשבחנו את השיטה שלנו בעוברי חולדות וסקרנו בלסטוציסטים בתרבית לצורך החדרה של אינטרון מלאכותי קצר מהונדס המכיל אתרי loxP, שמנו לב שיותר מ-60% מהבלסטוציסטים הכילו את האלל הממוקד כהלכה בהתבסס על ניתוח רצף הדור הבא (NGS) (איור 4). יתר על כן, בבדיקת השיטה שלנו לייצר חולדות חיות, תכננו פרויקט להנדס רצף קידוד של Cre recombinase המיועד לאתר ההתחלה ATG של הגן Drd2 של החולדה. תבנית תורם הדנ"א הארוזה של AAV כללה רצפי ITR הדרושים לאריזת AAV, זרוע הומולוגיה בגודל 5 אינץ' (422bp אורך), רצף Cre-pA (1,339bp אורך) וזרוע הומולוגיה 3' (477bp אורך) (איור 5A). מתוך 11 הצאצאים שנולדו, 10 היו חיוביים באמצעות ניתוח PCR עבור רצף Cre-pA שהוכנס כראוי לאתר ההתחלה ATG של חולדה Drd2 (איור 5B-D). ההחדרה הממוקדת אושרה מאוחר יותר על ידי ניתוח רצף DNA. לסיכום על פני 7 פרויקטים שונים, השגנו שיעור הצלחה ממוצע של 76% בבעלי חיים מייסדים, כפי שנקבע על ידי ניתוח PCR בצמתי זרועות הומולוגיה ואימות רצף DNA (טבלה 2).
| מתח [V] | אורך פולס [msec] | מרווח דופק [msec] | # של פולסים | קצב ריקבון [%] | קוטביות | |
| דופק נקבובי | 40 | 3.5 | 50 | 4 | 10 | + |
| דופק העברה | 5 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
טבלה 1: פרמטרים של אלקטרופורציה. ודא שמגבלת הזרם מופעלת במהלך ההתחשמלות.
איור 2: תהליך אלקטרופורציה של עובר דו-תאי. (A) אלקטרודת שקופיות זכוכית. (B) עוברים התלויים בריאגנטים לעריכת גנום CRISPR-Cas9 וטעונים לתוך אלקטרודת שקופית הזכוכית לפני ההתחשמלות. (C) היווצרות בועות אוויר על כל אלקטרודה במהלך התחשמלות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הופעת העובר לאחר התחשמלות. איחוי תאי נרשם בעד 20% מהעוברים הדו-תאיים לאחר אלקטרופורציה. תאים עובריים יכולים גם להתנפח בתוך הזונה פלוצ'ידה ולמלא את החלל הפריביטליני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מסירת דנ"א בתיווך AAV ואלקטרופורציה של עוברים דו-תאיים בבלסטוציסטים של חולדות תרבית. הנתונים מוצגים כאחוז הבלסטוציסטים החיוביים לזיהוי אלל נוק-אין נכון על ידי ריצוף הדור הבא (NGS). N=28 בלסטוציסטים (קבוצת ביקורת לתרבית בלבד), N=37 בלסטוציסטים (קבוצת ביקורת אלקטרופורציה (EP) בלבד), ו-N=35 בלסטוציסטים (קבוצת AAV+EP). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: יצירת מודל של חולדה מסוג Drd2-Cre. (A) מיקוד של הגן Drd2 של החולדה. מתחם RNP תוכנן להתמקד באקסון 2 המכיל את אתר ההתחלה של אזור הקידוד. תבנית תורם AAV הכילה רצפים חוזרים טרמינליים הפוכים נגיפיים (ITR), זרועות הומולוגיה גנטית Drd2 5' ו-3' (HA) וגן Cre עם רצף polyA. שילוב מוצלח של תבנית התורם דופק את הגן Cre 3' לאתר ההתחלה בתוך אקסון 2. זה שם את הגן Cre תחת שליטה של מקדם Drd2 ובו זמנית לדפוק את הגן Drd2. המיקום של פריימרים PCR המשמשים לאישור דפיקה מוצלחת מסומנים על ידי חצים סגולים. (B) ניתוח PCR של בעלי חיים ערוכים פוטנציאלית לגנום (Lanes B10-C8) עם פריימרים המשתרעים על פני זרוע ההומולוגיה של 5 אינץ'. נתיב C9: סוג פראי (שליטה שלילית); נתיב C10: ללא תבנית (שליטה שלילית). גודל האמפליקון הצפוי עבור בעלי חיים חיוביים הוא 601bp. (C) ניתוח PCR של בעלי חיים ערוכים פוטנציאליים לגנום (Lanes D8-E6) עם פריימרים המשתרעים על פני זרוע ההומולוגיה של 3 אינץ'. נתיב E7: סוג פראי; נתיב E8: ללא בקרת תבנית. גודל האמפליקון הצפוי עבור בעלי חיים חיוביים הוא 676bp. (D) זיהוי גן Cre. גודל האמפליקון הצפוי הוא 381bp. נתיבים C7-D5: מייסדים פוטנציאליים; נתיב D6: סוג פראי; נתיב D7: ללא בקרת תבנית. תגובות PCR נותחו על ידי אלקטרופורזה נימית עם סמני יישור של 15bp-3kb (מסומנים בירוק). סמן גודל הדנ"א QX מוצג משמאל לכל תמונה עם גודל שיא המתאים לגודל אמפליקון PCR בזוגות בסיסים (bp). נתון זה שונה באישור הפניה24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| תיאור הפרויקט | צאצאים חיוביים לדפיקות (%) |
| Oprm1-P2A-Flp (הכנסה של 1.7 KB) | 5/5 (100%) |
| Drd2-Cre (הכנסה של 1.3 קילו-בתים) | 10/11 (91%) |
| Triml2-P2A-Cre (הכנסה של 1.3 קילו-בתים) | 9/16 (56%) |
| Cxcl15-iCre (הכנסה של 1.3 קילו-בתים) | 6/6 (100%) |
| Opn4-P2A-Cre (הכנסה של 1.2 קילו-בתים) | 6/8 (75%) |
| Vipr1-FLEX-EGFP (הכנסה של 1.4 קילו-בתים) | 5/12 (42%) |
| Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed (הכנסה של 3.1 קילו-בתים) | 5/7 (71%) |
טבלה 2: שיעורי הצלחה של מודל נוק-אין
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת עריכת הגנום CRISPR-Cas חוללה מהפכה בתחום ההנדסה הגנטית בכך שאפשרה ייצור יעיל של שינויים גנטיים פשוטים ומורכבים בהתאמה אישית במגוון מיני בעלי חיים. שכלולים תכופים ושיפורים בטכניקות הקשורות לעריכת גנום מגבירים את הרבגוניות שלו. כאן תיארנו גישה חדשה המשתמשת בהעברת DNA בתיווך ssAAV יחד עם אלקטרופורציה של עוברים דו-תאיים של ריאגנטים CRISPR-Cas9 לעוברי מכרסמים דו-תאיים. הוכחנו שזו דרך יעילה לייצר מודלים ממוקדים של בעלי חיים.
יתרון מרכזי בשימוש ב- AAV הוא שהוא מאפשר משלוח של תבניות תיקון DNA גדולות יותר לעוברים ללא צורך בטכניקות מיקרו-הזרקה. משלוח בתיווך AAV גם עוזר לעקוף במידת מה את מגבלות גודל תבנית ה- DNA של אלקטרופורציה בלבד. עם זאת, ישנם כמה שיקולים חשובים בעת שימוש ב- AAV. הזונה פלוסידה, מטריצת הגליקופרוטאינים הקשוחה המקיפה את הביצית המופרית משמשת כמחסום פיזי שלעתים קרובות מסבך את העברת חומצות הגרעין. דילול הזונה פלוצ'ידה היא טכניקה נפוצה המשמשת לגישה טובה יותר לעובר. עם זאת, כמה מחקרים דיווחו כי התפתחות העובר מעוכבת על ידי זיהום עם מינונים גבוהים יותר (1 × 107 GC / μL ל 1 × 109 GC / μL) AAV בעוברים שבהם pellucida היה דליל לפני זיהום AAV22. יש, עם זאת, כמה סרוטיפים של AAV שיכולים להתפזר על פני zona pellucida29. הפרוטוקול שלנו אינו כולל דילול של zona pellucida ומשתמש AAV עם סרוטיפים 1 ו 6 בריכוז של 3 × 107 GC / μl כדי להשיג שיעורי דפיקה גבוהים יותר מאשר דוחות שפורסמו בעבר. לא ציינו ירידה בהתפתחות העובר בתנאים אלה.
יעילות הפגיעה הגבוהה המושגת על ידי אלקטרופורציה של עוברים דו-תאיים נובעת ככל הנראה משלב G2 המורחב בעוברים בשלב זה של ההתפתחות, מה שהופך אותו לשלב התפתחות אופטימלי לביצוע אלקטרופורציה. עם זאת, סיבוך פוטנציאלי אחד הוא האיחוי התאי שנצפה בחלק מהעוברים הדו-תאיים במהלך תהליך האלקטרופורציה. תצפית זו אינה מפתיעה בהתחשב בכך שהליכי היתוך חשמליים משמשים בדרך כלל לאיחוי תאי יונקים וניתן להימנע מאיחוי על ידי יישור ציר אופקי ולא אנכי זהיר בין האלקטרודות30,31. יתר על כן, כאשר עריכת גנום מתרחשת בשלב מאוחר יותר בהתפתחות כגון 2 תאים ולא 1 תא, יש פוטנציאל גדול יותר לפסיפס מוגבר. באמצעות גישת האלקטרופורציה הדו-תאית שלנו, ראינו עלייה קלה בפסיפס בהשוואה להזרקה פרו-גרעינית (86% בגישת AAV ו-67% בגישת PNI) בשלב של תא אחד, אך עדיין הצלחנו להשיג העברת קו נבט של האלל המעובד בכל בעלי החיים המייסדים שנבדקו. חשש פוטנציאלי נוסף הוא האפשרות של שילוב שרשור טנדם של תבניות DNA שמקורן ב-AAV. אמנם לא ביצענו ריצוף בקריאה ארוכה עבור המודלים המתוארים בפרוטוקול זה, אך אישרנו אינטגרציה יחידה של תבניות הדנ"א עבור כל המודלים באמצעות וריאציה של מספר העתק PCR דיגיטלי טיפתי (ddPCR).
לבסוף, בעוד שהשיטה שלנו כללה מסירת AAV של רצפי DNA מעניינים, זה אמור להיות אפשרי להשתמש בגישות אחרות של העברת DNA בתיווך נגיפיים ולא נגיפיים בשילוב עם אלקטרופורציה של עוברים כדי לבצע מניפולציה גנטית מוצלחת בעוברים. לסיכום, שילוב העברת DNA בתיווך ssAAV ואלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 RNPs לעוברים בעלי שני תאים בשלב הוא שיטה יעילה וקלה להתאמה ליצירת מודלים יעילים של חולדות נוקבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לנולאן דייוויס על הסיוע בצילום וידאו ובעריכת וידאו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
References
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20 (2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
- Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
- Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).
- Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
- Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382 (2014).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).
- Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).
- Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069 (2020).
- Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482 (2021).
- Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
- Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).
- Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
- Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
- Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
- Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
- Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382 (2013).
