Summary
이 프로토콜은 유전자 변형 쥐 모델을 생산하기 위한 최적화된 접근 방식을 제시합니다. 아데노 관련 바이러스(AAV)는 DNA 복구 템플릿을 전달하는 데 사용되며, 전기천공법은 CRISPR-Cas9 시약을 전달하여 2세포 배아에서 게놈 편집 과정을 완료하는 데 사용됩니다.
Abstract
게놈 편집 기술은 쥐를 포함한 유전자 변형 동물을 생산하는 데 널리 사용됩니다. DNA 복구 템플릿과 CRISPR-Cas 시약의 세포질 또는 전핵 주입은 배아에 전달하는 가장 일반적인 방법입니다. 그러나 이러한 유형의 미세 조작은 특수 장비에 대한 접근이 필요하고 힘들며 일정 수준의 기술이 필요합니다. 더욱이, 미세주입 기술은 종종 배아에 가해지는 기계적 스트레스로 인해 배아 생존율을 낮춥니다. 이 프로토콜에서는 미세주입 없이 CRISPR-Cas9 게놈 편집과 함께 작동하는 대규모 DNA 복구 템플릿을 제공하는 최적화된 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 단일 가닥 DNA 공여 템플릿의 AAV 매개 DNA 전달과 전기천공에 의한 CRISPR-Cas9 리보핵단백질(RNP) 전달을 결합하여 2세포 배아를 변형합니다. 이 새로운 전략을 사용하여 42%에서 90% 사이의 효율로 1.2-3.0kb 크기의 DNA 염기서열을 삽입하는 표적 knock-in rat 모델을 성공적으로 생산했습니다.
Introduction
CRISPR 기반 게놈 편집 도구의 개발은 새롭고 더 정교한 유전자 조작 쥐 모델을 효율적으로 생성하는 능력을 가속화했습니다. 단일 가이드 RNA는 Cas9 뉴클레아제와 함께 결합되어 게놈 내에서 관심 있는 DNA 염기서열을 표적으로 하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성하고 이중 가닥 DNA 절단을 초래합니다. 세포 DNA 복구 메커니즘은 오류가 발생하기 쉽기 때문에 복구 과정에서 삽입 및 결실(INDEL)이 도입되어 표적 유전자의 기능을 방해할 수 있습니다. 게놈 편집 시약과 함께 원하는 조작된 DNA 염기서열(복구 템플릿)의 동시 전달이 있는 경우, 이중 가닥 DNA 절단을 포함하는 영역에 복구 템플릿의 삽입은 상동성 유도 복구(HDR)라는 프로세스를 통해 발생합니다. 이는 표적 DNA 삽입/치환(knock-in)을 통해 동물 모델을 생성하는 데 효과적인 전략입니다. 한 가지 한계는 knock-in 염기서열의 크기가 큰 경우가 많아 유전자 편집 효율이 감소하여 원하는 모델을 생성하기가 더 어려워진다는 것입니다1. knock-in 효율을 높이기 위한 전략에는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 및 단일 가닥 DNA(ssDNA) 복구 템플릿의 선형화와 DNA 복구 템플릿의 화학적 변형이 포함됩니다 2,3,4. 또한, HDR 자극 화합물과 함께 전핵 미세주입, 미세주입과 함께 전기 펄스의 적용, 2세포 배아에 대한 시간 미세주입이 모두 시도되었습니다 5,6,7. 이러한 접근 방식 중 일부의 성공에도 불구하고 1.0kb보다 큰 DNA 서열의 통합은 기술적으로 어려운 과제로 남아 있습니다.
배양된 세포주에 시약을 도입하는 일반적인 방법인 전기천공법은 CRISPR-Cas9 성분을 배아에 전달하기 위한 미세주입의 대안을 제공합니다. 쥐 배아(rat embryo)8에서 처음 증명된 배아 전기천공법(embryo electroporation)은 이후 마우스(9,10,11,12,13), 돼지(14,15) 및 기타 동물 모델 유기체(16,17,18)에서 전달 방법으로 성공적으로 사용되었다 . CRISPR-Cas9 시약이 포함된 배지에 현탁된 배아는 큐벳 또는 두 전극 사이의 유리 슬라이드에 배치되고 직접 전류 펄스를 받습니다. 이로 인해 CRISPR-Cas9 구성 요소가 배아로 들어가는 zona pellucida 및 배아 원형질막에 일시적인 구멍이 생깁니다. 전형적으로, 중간 수준의 전기 "포링" 펄스는 음전하를 띤 게놈 편집 성분의 이동을 용이하게 하는 낮은 수준의 전기 "전달 펄스"에 이어 임시 개구부를 생성하는 데 사용됩니다. 배아 전기천공법은 효율적이고, 처리량이 높으며, 수행하기 쉽습니다. 그러나, 배아 전기천공법은 작은(<200 bp) ssDNA 복구 주형의 도입에 대해 매우 성공적인 것으로 나타났지만, 더 큰(>1.0 kb) 복구 주형의 성공적인 전기천공법에 대한 보고는 거의 없다13,19. 이러한 크기 제한은 큰 삽입이 필요한 knock-in 동물 모델을 생성하기 위한 배아 전기천공법의 주요 한계를 나타냅니다.
유전자 치료의 맥락에서 아데노 관련 바이러스(AAV)는 분열 및 비분열 세포 모두의 효율적인 생체 내 감염성, 병원성 부족 및 희귀 게놈 통합으로 인해 유전 물질을 전달하는 매개체로 오랫동안 사용되어 왔습니다20,21. 최근에는 AAV와 CRISPR-Cas9 기술을 결합하여 DNA 복구 템플릿과 CRISPR 시약을 도입하는 연구가 더 많아지고있습니다 22,23,24. 이 접근법을 사용하면 미세주입 기술 없이 더 큰 DNA 복구 템플릿을 전달할 수 있습니다.
HDR 경로는 세포주기의 후기 S 및 G2 단계에서 더 활성화됩니다25,26. in vitro에서 수행된 연구에서 CRISPR-Cas9 RNP 및 DNA 복구 템플릿을 G2 동기화 세포에 전달하거나 Cas9-Geminin 융합 단백질2을 사용하여 Cas9 단백질의 존재를 후기 S 및 G2 단계로 제한함으로써 knock-in 효율이 크게 증가했습니다. 또한, 2세포 단계 배아의 확장된 G2 단계에서 발생하는 주요 접합 게놈 활성화(ZGA) 이벤트가 있으며, 이는 개방 염색질 상태와 관련이 있습니다. 이를 통해 CRISPR-Cas9 RNP와 복구 템플릿에 게놈 DNA에 대한 접근성을 높일 수 있을 것으로 추측됩니다.
우리의 목표는 AAV 접근법과 배아 전기천공법을 결합하여 배아 발달의 2세포 단계에서 CRISPR-Cas9 RNP를 도입함으로써 이러한 모든 관찰을 기반으로 하는 것이었습니다. 이 전략은 AAV의 더 큰 DNA 복구 템플릿 전달 용량, 전기천공법의 기술적 용이성 및 배아 발달 중 게놈 접근성을 위한 보다 최적의 2세포 시점을 활용하여 DNA 삽입의 표적 유전 공학을 위한 효율적인 방법을 만듭니다. 이 프로토콜에서 강조된 바와 같이, 당사의 최적화된 방법을 사용하면 미세주입 기술 없이 1.2-3.0kb 크기의 DNA 염기서열을 삽입하는 표적 knock-in rat 모델을 생산할 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 미주리 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(ACUC 프로토콜 #25580)의 승인을 받았으며 실험실 동물의 사용 및 관리 가이드에 명시된 지침에 따라 수행되었습니다.
1. AAV 매개 DNA 복구 템플릿 전달
- 두 상동성 암 사이에 원하는 knock-in 시퀀스를 포함하도록 DNA 구조를 설계합니다. 일반적인 상동성 암 길이는 300-500bp입니다. 적절한 플라스미드 백본으로 클로닝하고 재조합 ssAAV1 또는 ssAAV6(혈청형 1 또는 6)으로 패키징하여 전체 DNA 복구 템플릿(homology arm + desired knock-in sequence)이 반전 말단 반복(ITR)에 의해 측면에 있는지 확인합니다.
참고: sgRNA 표적 염기서열이 DNA 복구 템플릿에 존재하는 경우, 이 염기서열을 방해하는 침묵의 돌연변이를 설계하여 올바르게 표적화된 대립유전자의 CRISPR-Cas9 매개 편집을 방지하는 것이 중요합니다.
주의: 재조합 AAV 바이러스 벡터는 비통합적이며 BSL-1로 분류됩니다. 표준 무균 기술은 바이러스에 노출된 배아를 피펫팅하고 처리하는 데 사용됩니다. - 엔지니어링된 ssAAV1 또는 ssAAV6(DNA 복구 템플릿과 함께 패키지)을 30μL의 KSOM-R 배지27,28에 추가하여 35mm 페트리 접시의 미네랄 오일 아래에 3 × 107 게놈 사본(GC)/μL의 최종 농도가 되도록 합니다.
- 눈에 보이는 전핵이 있는 접합체를 엔지니어링된 ssAAV가 포함된 KSOM-R 배지에 넣습니다.
참고: 이 프로토콜을 사용하면 AAV 혈청형 1 및 6이 효율적인 DNA 복구 템플릿 전달을 위해 쉽게 통과할 수 있으므로 zona pellucida를 얇게 할 필요가 없습니다. - 37 ° C에서 5 % CO2 및 최대 습도로 18-20 시간 동안 배양하여 충분한 바이러스 transduction을 허용합니다.
2. 전기천공법 준비
- 다음 날, 멸균 RNase-free 튜브에서 Opti-MEM 배지에 희석한 100ng/μL의 sgRNA와 100ng/μL의 Cas9 단백질을 포함하는 전기천공법 혼합물을 만듭니다. 부드럽게 섞는다.
- RNP 형성을 위해 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- 배양 시간 동안 electroporator를 켜고 리드를 1.5mm 간격의 유리 슬라이드 전극에 연결합니다.
- 표 1에 설명된 대로 electroporation 매개변수를 설정합니다.
3. 2세포 배아 전기천공법
- 용액에 기포가 유입되지 않도록 주의하면서 유리 슬라이드의 두 전극 사이에 CRISPR 전기천공법 혼합물 5μL를 부드럽게 피펫팅합니다.
- AAV 용액에서 2세포 단계 배아를 제거합니다. 2세포 단계 배아가 전극의 측면에 닿지 않도록 혼합물에 정렬합니다. 이것은 용해를 피하기 위해 수행됩니다.
- Ohm 버튼을 눌러 임피던스를 측정합니다. 임피던스가 0.100에서 0.300kΩ 사이인지 확인하십시오. 반응 볼륨은 임피던스를 변경합니다(임피던스를 줄이려면 볼륨을 추가하고 임피던스를 높이려면 볼륨을 뺍니다).
- 보도자료 스타트. 프로세스를 완료하는 데 몇 초 정도 걸립니다.
- 전기천공법 직후 배아를 제거하고 신선한 30μL 방울의 KSOM-R 배지로 3회 세척합니다.
- 배아를 5%CO2 및 최대 습도를 유지한 37°C 인큐베이터에 다시 넣고 미네랄 오일 아래 KSOM-R 배지 500μL 방울에 넣어 체외 배양을 합니다. 또는 배아를 1.5일 후 성교(dpc) 유사 임신 암컷 쥐에게 외과적으로 이식하여 살아있는 자손을 생산합니다.
그림 1: CRISPR-Cas9 게놈 편집을 위한 AAV 매개 DNA 전달 및 2세포 배아 전기천공법 파이프라인의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
프로토콜에 따라 DNA 복구 템플릿의 효과적인 AAV 매개 전달이 있어 2세포 배아를 CRISPR-Cas9 RNP로 전기천공한 후 매우 효율적인 HDR을 수행할 수 있습니다. 비디오에서 볼 수 있듯이 성공적인 electroporation 공정은 각 전극에 기포를 형성하고(그림 2C) 임피던스가 0.100 및 0.300kΩ 범위 내에서 유지되는 결과를 낳습니다. 전기천공법 후 배아가 부풀어 올라 조나 펠루시다(zona pellucida) 내부의 유리관 주변 공간을 채우는 것은 드문 일이 아닙니다(그림 3). 이 붓기는 배양에서 몇 시간 후에 가라앉아야 합니다. 또한 2세포 배아를 전기포킹한 후 세포 융합 사건의 작은 비율(최대 20%)을 보는 것도 드문 일이 아닙니다(그림 3). 세포 융합은 전극 사이의 수직 축 정렬보다는 신중한 수평축 정렬을 통해 잠재적으로 피할 수 있습니다(그림 2B). 그러나 일반적으로 전기천공법 과정 후에 융합된 배아를 폐기합니다.
2세포 배아 CRISPR-Cas9 RNP 전기천공법 기법을 사용한 AAV 매개 DNA 전달은 표적 삽입으로 knock-in rat 모델을 생성하는 데 매우 효과적인 것으로 입증되었습니다. 쥐 배아에서 분석법을 테스트하고 loxP 부위를 포함하는 조작된 짧은 인공 인트론을 삽입하기 위해 배양된 배반포를 스크리닝한 결과, 차세대 염기서열(NGS) 분석을 기반으로 배반포의 60% 이상이 올바르게 표적화된 knock-in 대립유전자를 포함하고 있음을 확인했습니다(그림 4). 또한, 살아있는 knock-in 쥐를 생산하는 방법을 테스트하면서 쥐 Drd2 유전자의 ATG 시작 부위를 표적으로 하는 Cre 재조합효소 코딩 서열을 설계하는 프로젝트를 설계했습니다. AAV 패키징된 DNA donor 템플릿은 AAV 패키징에 필요한 ITR 서열, 5' 상동성 암(길이 422bp), Cre-pA 염기서열(길이 1,339bp) 및 3' 상동성 암(길이 477bp)으로 구성되었습니다(그림 5A). 태어난 11마리의 새끼 중 10마리는 쥐 Drd2의 ATG 시작 부위에 정확하게 삽입된 Cre-pA 서열에 대한 PCR 분석에서 양성이었습니다(그림 5B-D). 표적 삽입은 나중에 DNA 서열 분석에 의해 확인되었습니다. 7개의 서로 다른 프로젝트를 요약하자면, 상동성 암 접합 및 DNA 염기서열 검증에 대한 PCR 분석으로 결정된 창건 동물에서 평균 76%의 knock-in 성공률을 달성했습니다(표 2).
| 전압 [V] | 펄스 길이 [msec] | 펄스 간격 [msec] | # 펄스 수 | 감쇠율 [%] | 극성 | |
| 포링 펄스 | 40 | 3.5 | 50 | 4 | 10 | + |
| 전송 펄스 | 5 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
표 1: 전기천공법 매개변수. electroporation 중에 Current Limit가 ON인지 확인하십시오.
그림 2: 2세포 배아 전기천공법 공정. (A) 유리 슬라이드 전극. (B) CRISPR-Cas9 게놈 편집 시약에 현탁하고 전기천공법 전에 유리 슬라이드 전극에 로드된 배아. (C) electroporation 도중 각 전극에 기포 형성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 전기천공법 후의 배아 모양. 세포 융합은 전기천공법 후 2세포 배아의 최대 20%에서 관찰됩니다. 배아 세포는 또한 조나 펠루시다(zona pellucida) 내부로 팽창하여 비텔린 주변 공간을 채울 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 배양 쥐 배반포에서 AAV 매개 DNA 전달 및 2세포 배아 전기천공법 knock-in 효율. NGS(Next Generation Sequencing)에 의한 정확한 knock-in 대립유전자 검출에 대해 양성인 배반포의 백분율로 제시된 데이터. N=28 배반포(배양 전용 대조군), N=37 배반포(전기천공법(EP) 전용 대조군) 및 N=35 배반포(AAV+EP 그룹). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: Drd2-Cre knock-in rat 모델 생성. (A) 쥐 Drd2 유전자의 표적화. RNP 복합체는 코딩 영역 시작 부위를 포함하는 엑손 2를 표적으로 하도록 설계되었습니다. AAV donor template에는 바이러스 반전 말단 반복 서열(ITR), 5' 및 3' Drd2 유전자 상동성 암(HA) 및 polyA 서열이 있는 Cre 유전자가 포함되어 있습니다. 공여체 템플릿의 성공적인 통합은 Cre 유전자 3'을 Exon 2 내의 시작 부위에 노크합니다. 이것은 Cre 유전자를 Drd2 프로모터의 제어 하에 두는 동시에 Drd2 유전자를 녹아웃시킵니다. 성공적인 knock-in을 확인하는 데 사용되는 PCR 프라이머의 위치는 보라색 화살표로 표시됩니다. (B) 5' 상동성 암에 걸쳐 프라이머를 사용하여 잠재적으로 게놈 편집 동물(레인 B10-C8)의 PCR 분석. 레인 C9: 야생형(음성 대조군); 레인 C10: 템플릿 없음(네거티브 컨트롤). knock-in 양성 동물에 대한 예상 앰플리콘 크기는 601bp입니다. (C) 3' 상동성 군에 걸쳐 있는 프라이머를 사용한 잠재적으로 게놈 편집 동물(Lanes D8-E6)의 PCR 분석. 레인 E7: 와일드 타입; 레인 E8: 템플릿 컨트롤이 없습니다. knock-in 양성 동물에 대한 예상 앰플리콘 크기는 676bp입니다. (D) Cre 유전자 검출. 예상 앰플리콘 크기는 381bp입니다. 레인 C7-D5: 잠재적 설립자; 차선 D6: 야생형; 차선 D7: 템플릿 제어가 없습니다. PCR 반응은 15bp-3kb 정렬 마커(녹색으로 표시)를 사용하여 모세관 전기영동으로 분석했습니다. QX DNA 크기 마커는 염기쌍(bp)의 PCR 앰플리콘 크기에 해당하는 피크 크기와 함께 각 이미지의 왼쪽에 표시됩니다. 이 그림은 참조24의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 프로젝트 설명 | knock-in에 양성 자손(%) |
| Oprm1-P2A-Flp(1.7kb 삽입) | 5/5 (100%) |
| Drd2-Cre(1.3kb 삽입) | 10/11 (91%) |
| Triml2-P2A-Cre(1.3kb 삽입) | 9/16 (56%) |
| Cxcl15-iCre(1.3kb 삽입) | 6/6 (100%) |
| Opn4-P2A-Cre(1.2kb 삽입) | 6/8 (75%) |
| Vipr1-FLEX-EGFP(1.4kb 삽입) | 5/12 (42%) |
| Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed(3.1kb 삽입) | 5/7 (71%) |
표 2: Knock-in 모델 성공률
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Discussion
CRISPR-Cas 게놈 편집 시스템은 다양한 동물 종에서 간단하고 복잡한 맞춤형 유전자 변형을 효율적으로 생산할 수 있도록 함으로써 유전 공학 분야에 혁명을 일으켰습니다. 게놈 편집과 관련된 기술의 빈번한 개선과 개선은 그 다양성을 더욱 강화합니다. 여기서는 CRISPR-Cas9 시약을 2세포 설치류 배아에 주입하는 2세포 배아 전기천공법과 함께 ssAAV 매개 DNA 전달을 사용하는 새로운 접근법을 설명했습니다. 우리는 이것이 표적 knock-in 동물 모델을 생산하는 효과적인 방법임을 입증했습니다.
AAV 사용의 주요 이점은 미세 주입 기술 없이 더 큰 DNA 복구 템플릿을 배아에 전달할 수 있다는 것입니다. AAV 매개 전달은 또한 전기천공법 단독의 DNA 템플릿 크기 제한을 다소 우회하는 데 도움이 됩니다. 그러나 AAV를 사용할 때 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 수정란을 둘러싸고 있는 경화된 당단백질 매트릭스인 조나 펠루시다(zona pellucida)는 종종 핵산 전달을 복잡하게 만드는 물리적 장벽 역할을 합니다. zona pellucida의 솎아내는 것은 배아에 더 잘 접근하기 위해 사용되는 일반적인 기술입니다. 그러나 일부 연구에서는 AAV 감염 이전에 zona pellucida가 얇아진 배아에서 고용량(1 × 107 GC/μL - 1 ×10 9 GC/μL) AAV에 의한 감염에 의해 배아 발달이 방해를 받는다고 보고했다22. 그러나 zona pellucida29 전체에 걸쳐 확산될 수 있는 AAV의 일부 혈청형이 있습니다. 당사의 프로토콜은 zona pellucida의 희석을 포함하지 않으며 3 × 107 GC/μl의 농도에서 혈청형 1 및 6의 AAV를 사용하여 이전에 발표된 보고서보다 더 높은 knock-in 비율을 달성합니다. 우리는 이러한 조건 하에서 배아 발달의 감소를 발견하지 못했다.
2세포 배아의 전기천공법에 의해 달성되는 높은 knock-in 효율은 이 발달 단계에서 배아의 확장된 G2 단계 때문일 가능성이 높으며, 이는 전기천공법을 수행하기 위한 최적의 발달 단계입니다. 그러나 한 가지 잠재적인 합병증은 전기천공법 과정 동안 일부 2세포 배아에서 관찰된 세포 융합입니다. 이러한 관찰은 전기융합 절차가 포유류 세포를 융합시키기 위해 통상적으로 사용되고, 융합은 전극(30,31) 사이의 수직축 정렬이 아닌 신중한 수평축 정렬에 의해 잠재적으로 회피될 수 있다는 점을 감안할 때 놀라운 일이 아니다. 더욱이, 게놈 편집이 1-세포가 아닌 2-세포와 같이 발달의 후기 단계에서 발생하는 경우, 모자이크화가 증가할 가능성이 더 큽니다. 2세포 전기천공법 접근법을 사용하여 1세포 단계에서 전핵 주입(AAV 접근법의 경우 86%, PNI 접근법의 경우 67%)에 비해 모자이크가 약간 증가하는 것을 관찰했지만 여전히 테스트된 모든 기초 동물에서 변형된 대립유전자의 생식세포 전달을 달성할 수 있었습니다. 또 다른 잠재적인 우려 사항은 AAV 유래 DNA 템플릿의 탠덤 연결체 통합 가능성입니다. 이 프로토콜에 설명된 모델에 대해 긴 판독 염기서열 분석을 수행하지는 않았지만 액적-디지털 PCR(ddPCR) 복제 수 변이를 사용하여 모든 모델에 대한 DNA 템플릿의 단일 통합을 확인했습니다.
마지막으로, 우리의 방법은 관심 DNA 염기서열의 AAV 전달을 포함하지만, 배아를 성공적으로 유전적으로 조작하기 위해 배아 전기천공법과 함께 다른 바이러스 및 비바이러스 매개 DNA 전달 접근법을 사용할 수 있어야 합니다. 결론적으로, ssAAV 매개 DNA 전달과 CRISPR-Cas9 RNP의 전기천공법을 2세포 단계 배아에 결합하는 것은 knock-in rat 모델을 효율적으로 생성하기 위한 효율적이고 쉽게 적용할 수 있는 방법입니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 비디오 촬영 및 비디오 편집에 도움을 준 Nolan Davis에게 감사의 뜻을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
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