Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

CRISPR-Cas9 تحرير الجينوم لأجنة الفئران باستخدام الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) والتثقيب الكهربائي للأجنة 2 خلية

Published: March 15, 2024 doi: 10.3791/66069
Automatic Translation
1,2,4, 2, 3, 3, 3, 1,2,3,4
1Animal Modeling Core, University of Missouri, 2Comparative Medicine Program, University of Missouri, 3Rat Resource and Research Center, University of Missouri, 4Department of Veterinary Pathobiology, University of Missouri

Summary

يقدم هذا البروتوكول نهجا محسنا لإنتاج نماذج الفئران المعدلة وراثيا. يستخدم الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) لتقديم قالب إصلاح الحمض النووي ، ويستخدم التثقيب الكهربائي لتقديم كواشف CRISPR-Cas9 لإكمال عملية تحرير الجينوم في جنين 2-cell.

Abstract

تستخدم تقنية تحرير الجينوم على نطاق واسع لإنتاج المعدلة وراثيا ، بما في ذلك الفئران. يعد الحقن السيتوبلازمي أو النووي لقوالب إصلاح الحمض النووي وكواشف CRISPR-Cas أكثر طرق التوصيل شيوعا إلى الأجنة. ومع ذلك ، فإن هذا النوع من المعالجة الدقيقة يتطلب الوصول إلى معدات متخصصة ، وهو شاق ، ويتطلب مستوى معينا من المهارة التقنية. علاوة على ذلك ، غالبا ما تؤدي تقنيات الحقن المجهري إلى انخفاض بقاء الجنين بسبب الضغط الميكانيكي على الجنين. في هذا البروتوكول ، طورنا طريقة محسنة لتقديم قوالب كبيرة لإصلاح الحمض النووي للعمل جنبا إلى جنب مع تحرير جينوم CRISPR-Cas9 دون الحاجة إلى الحقن المجهري. يجمع هذا البروتوكول بين تسليم الحمض النووي بوساطة AAV لقوالب مانح الحمض النووي التي تقطعت بها السبل جنبا إلى جنب مع تسليم البروتين النووي الريبي CRISPR-Cas9 (RNP) عن طريق التثقيب الكهربائي لتعديل أجنة الخلية 2. باستخدام هذه الاستراتيجية الجديدة ، نجحنا في إنتاج نماذج فئران مستهدفة تحمل إدخال تسلسلات الحمض النووي من 1.2 إلى 3.0 كيلو بايت في الحجم بكفاءة تتراوح بين 42٪ و 90٪.

Introduction

أدى تطوير أدوات تحرير الجينوم القائمة على كريسبر إلى تسريع قدرتنا على توليد نماذج فئران جديدة وأكثر تطورا معدلة وراثيا بكفاءة. يتم الجمع بين الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه ، جنبا إلى جنب مع Cas9 nuclease ، لتشكيل مجمعات البروتين النووي الريبي (RNP) التي تستهدف تسلسلات الحمض النووي ذات الأهمية داخل الجينوم وتؤدي إلى فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل. نظرا لأن آليات إصلاح الحمض النووي الخلوي عرضة للخطأ ، يتم إدخال عمليات الإدراج والحذف (INDELs) أثناء عملية الإصلاح التي يمكن أن تعطل وظيفة الجين المستهدف. عندما يكون هناك تسليم مشترك لتسلسل الحمض النووي الهندسي المطلوب (قالب الإصلاح) جنبا إلى جنب مع كواشف تحرير الجينوم ، يحدث إدخال قالب الإصلاح في المنطقة التي تحتوي على كسر الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل من خلال عملية تسمى الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR). هذه استراتيجية فعالة لتوليد نماذج حيوانية مع إدخالات / بدائل الحمض النووي المستهدفة (الضربات القاضية). أحد القيود هو أن التسلسلات غير المباشرة غالبا ما تكون كبيرة الحجم ، والتي ثبت أنها تقلل من كفاءة تحرير الجينات ، مما يجعل إنشاء النموذج المطلوب أكثر صعوبة1. تضمنت استراتيجيات زيادة الكفاءة الخطية لكل من قوالب إصلاح الحمض النووي المزدوج (dsDNA) والحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA) والتعديل الكيميائي لقوالب إصلاح الحمض النووي2،3،4. بالإضافة إلى ذلك ، تمت تجربة الحقن المجهري النووي جنبا إلى جنب مع مركبات تحفيز HDR ، وتطبيق النبضات الكهربائية بالتزامن مع الحقن المجهري ، والحقن المجهري الموقوت في أجنة خلية 25،6،7. على الرغم من نجاح بعض هذه الأساليب ، فإن دمج تسلسلات الحمض النووي الأكبر من 1.0 كيلو بايت لا يزال يمثل تحديا تقنيا.

يوفر التثقيب الكهربائي ، وهو طريقة شائعة لإدخال الكواشف في خطوط الخلايا المستزرعة ، بديلا للحقن المجهري لتوصيل مكونات CRISPR-Cas9 إلى الأجنة. تم استخدام التثقيب الكهربائي للأجنة ، الذي تم إثباته لأول مرة في أجنة الفئران8 ، بنجاح كطريقة توصيل في الفئران9،10،11،12،13 ، والخنازير14،15 ، والكائنات الحية الحيوانية الأخرى16،17،18. يتم وضع الأجنة ، المعلقة في الوسط الذي يحتوي على كواشف CRISPR-Cas9 ، في كوفيت أو على شريحة زجاجية بين قطبين كهربائيين وتخضع لنبضات مباشرة من التيارات الكهربائية. وهذا يخلق فتحات عابرة في المنطقة الشفافة وغشاء بلازما الجنين الذي تدخل من خلاله مكونات كريسبر-كاس 9 إلى الأجنة. عادة ، يتم استخدام نبضات "بورينغ" كهربائية متوسطة المستوى لإنشاء فتحات مؤقتة تليها "نبضات نقل" كهربائية منخفضة المستوى تسهل حركة مكونات تحرير الجينوم سالبة الشحنة. التثقيب الكهربائي للجنين فعال ، وله إنتاجية عالية ، وسهل الأداء. ومع ذلك ، في حين ثبت أن التثقيب الكهربائي للجنين ناجح للغاية في إدخال قوالب إصلاح ssDNA صغيرة (<200 bp) ، إلا أن هناك تقارير قليلة عن نجاح التثقيب الكهربائي لقوالب إصلاح أكبر (>1.0 كيلو بايت)13,19. يمثل هذا التقييد في الحجم قيدا رئيسيا على التثقيب الكهربائي للأجنة لتوليد نماذج حيوانية غير مطروقة تتطلب إدخالات كبيرة.

في سياق العلاج الجيني ، لطالما استخدمت الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAVs) كمركبات لتوصيل المواد الوراثية بسبب كفاءتها في العدوى في الجسم الحي لكل من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة ، ونقص الإمراضية ، والتكامل الجينيالنادر 20,21. في الآونة الأخيرة ، جمعت المزيد من الدراسات بين AAVs وتقنية CRISPR-Cas9 لتقديم قوالب إصلاح الحمض النووي وكواشف CRISPR22،23،24. يسمح هذا النهج بتسليم قوالب أكبر لإصلاح الحمض النووي دون الحاجة إلى تقنيات الحقن المجهري.

يكون مسار HDR أكثر نشاطا في المراحل المتأخرة S و G2 من دورة الخلية25,26. في الدراسات التي أجريت في المختبر ، تم تحقيق زيادات كبيرة في كفاءة الضربة القاضية من خلال توصيل CRISPR-Cas9 RNPs وقوالب إصلاح الحمض النووي إلى خلايا متزامنة G2 أو عن طريق تقييد وجود بروتين Cas9 إلى المراحل المتأخرة S و G2 باستخدام بروتين اندماج Cas9-Geminin2. علاوة على ذلك ، هناك حدث تنشيط جينوم زيجوتي رئيسي (ZGA) يحدث خلال المرحلة G2 الممتدة من جنين المرحلة المكونة من خليتين ، وهذا يرتبط بحالة الكروماتين المفتوحة. يعتقد أن هذا يوفر ل CRISPR-Cas9 RNPs وقوالب الإصلاح إمكانية وصول أكبر إلى الحمض النووي الجينومي.

كان هدفنا هو البناء على كل هذه الملاحظات ، من خلال الجمع بين نهج AAV والتثقيب الكهربائي للأجنة لإدخال CRISPR-Cas9 RNPs في مرحلة 2-cell من تطور الجنين. تستفيد هذه الاستراتيجية من قدرة تسليم قالب إصلاح الحمض النووي الأكبر ل AAV ، والسهولة التقنية للتثقيب الكهربائي والنقطة الزمنية المثلى لخلية 2 للوصول الجينومي أثناء تطور الجنين لإنشاء طريقة فعالة للهندسة الوراثية المستهدفة لإدخال الحمض النووي. كما هو موضح في هذا البروتوكول ، تسمح طريقتنا المحسنة بإنتاج نماذج الفئران المستهدفة التي تحمل إدخالات تسلسل الحمض النووي من 1.2 إلى 3.0 كيلو بايت في الحجم دون الحاجة إلى تقنيات الحقن المجهري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة ميسوري (بروتوكول ACUC # 25580) وتم تنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في دليل استخدام ورعاية المختبر.

1. تسليم قالب إصلاح الحمض النووي بوساطة AAV

  1. صمم بنية الحمض النووي لاحتواء التسلسل المطلوب بين ذراعي التماثل. يبلغ طول ذراع التماثل النموذجي 300-500 نقطة أساس. تأكد من أن قالب إصلاح الحمض النووي بأكمله (أذرع التماثل + تسلسل الضربة القاضية المطلوب) محاط بتكرارات طرفية مقلوبة (ITR) عن طريق الاستنساخ في العمود الفقري البلازميد المناسب والتعبئة في SSAAV1 أو ssAAV6 المؤتلف (الأنماط المصلية 1 أو 6).
    ملاحظة: إذا كان تسلسل هدف sgRNA موجودا في قالب إصلاح الحمض النووي ، فمن المهم هندسة طفرات صامتة لتعطيل هذا التسلسل وبالتالي منع التحرير بوساطة CRISPR-Cas9 للأليل المستهدف بشكل صحيح.
    تنبيه: النواقل الفيروسية AAV المؤتلفة غير متكاملة وتصنف على أنها BSL-1. تستخدم تقنيات التعقيم القياسية لسحب الأجنة التي تعرضت للفيروس والتعامل معها.
  2. أضف ssAAV1 أو ssAAV6 المصمم هندسيا (معبأ بقالب إصلاح الحمض النووي) إلى 30 ميكرولتر من وسائط KSOM-R27,28 إلى تركيز نهائي يبلغ 3 × 10 7 نسخ جينوم (GC) / ميكرولتر تحت الزيت المعدني في طبق بتري 35 مم.
  3. ضع الزيجوت مع نوى البرونوى المرئية في وسائط KSOM-R التي تحتوي على ssAAV الهندسي.
    ملاحظة: باستخدام هذا البروتوكول ، ليست هناك حاجة لترقق المنطقة الشفافة لأن الأنماط المصلية AAV 1 و 6 قادرة على المرور بسهولة من أجل تسليم قالب إصلاح الحمض النووي بكفاءة.
  4. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 والرطوبة القصوى لمدة 18-20 ساعة للسماح بنقل فيروسي كاف.

2. إعداد التثقيب الكهربائي

  1. في اليوم التالي ، اصنع خليط التثقيب الكهربائي الذي يحتوي على 100 نانوغرام / ميكرولتر من sgRNA و 100 نانوغرام / ميكرولتر من بروتين Cas9 المخفف في وسائط Opti-MEM في أنبوب معقم خال من RNase. مزيج بلطف.
  2. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح لتشكيل RNP.
  3. أثناء وقت الحضانة ، قم بتشغيل جهاز الحفر الكهربائي وتوصيل الخيوط بقطب منزلق زجاجي بفجوة 1.5 مم.
  4. تعيين معلمات التثقيب الكهربائي كما هو موضح في الجدول 1.

3. 2-خلية الجنين التثقيب الكهربائي

  1. ماصة بلطف 5 ميكرولتر من خليط التثقيب الكهربائي كريسبر بين القطبين على الشريحة الزجاجية مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء إلى المحلول.
  2. قم بإزالة جنين المرحلة 2 خلية من محلول AAV. اصطف أجنة مرحلة 2 خلية في الخليط دون السماح لهم بلمس جوانب الأقطاب الكهربائية. يتم ذلك لتجنب التحلل.
  3. اضغط على زر أوم لقياس المقاومة. تحقق للتأكد من أن المقاومة تتراوح بين 0.100 و 0.300 كيلو أوم. سيغير حجم التفاعل المعاوقة (أضف حجما لتقليل المقاومة واطرح الحجم لزيادة المقاومة).
  4. اضغط على ابدأ. تستغرق العملية بضع ثوان حتى تكتمل.
  5. قم بإزالة الأجنة مباشرة بعد التثقيب الكهربائي واغسلها 3 مرات في قطرات جديدة سعة 30 ميكرولتر من وسائط KSOM-R.
  6. ضع الأجنة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 والرطوبة القصوى للزراعة في المختبر في 500 ميكرولتر من وسائط KSOM-R تحت الزيت المعدني. بدلا من ذلك ، قم بنقل الأجنة جراحيا إلى أنثى الفئران الحامل الكاذبة لمدة 1.5 يوم بعد الجماع (dpc) لإنتاج ذرية حية.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لتوصيل الحمض النووي بوساطة AAV وخط أنابيب التثقيب الكهربائي للجنين 2 خلية لتحرير الجينوم CRISPR-Cas9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد البروتوكول ، هناك تسليم فعال بوساطة AAV لقالب إصلاح الحمض النووي مما يسمح ب HDR عالي الكفاءة بعد أن يتم إلكتروبور أجنة الخلية 2 باستخدام CRISPR-Cas9 RNPs. كما هو موضح في الفيديو ، تؤدي عملية التثقيب الكهربائي الناجحة إلى تكوين فقاعات على كل قطب كهربائي (الشكل 2C) وتبقى المقاومة في نطاق 0.100 و 0.300 kΩ. بعد التثقيب الكهربائي ، ليس من غير المألوف أن تنتفخ الأجنة لملء الفراغ المحيطي داخل المنطقة الشفافة (الشكل 3). يجب أن يهدأ هذا التورم بعد بضع ساعات في الثقافة. كما أنه ليس من غير المألوف رؤية نسبة صغيرة (تصل إلى 20٪) من أحداث الاندماج الخلوي بعد إلكتروب أجنة الخلية 2 (الشكل 3). يمكن تجنب الاندماج الخلوي عن طريق محاذاة المحور الأفقي بعناية بدلا من محاذاة المحور الرأسي بين الأقطاب الكهربائية (الشكل 2B). ومع ذلك ، فإننا عادة ما نتخلص من أي أجنة ملتحمة بعد عملية التثقيب الكهربائي.

أثبتت تقنية توصيل الحمض النووي بوساطة AAV مع تقنية التثقيب الكهربائي CRISPR-Cas9 RNP للجنين 2 الخلية أنها فعالة للغاية في توليد نماذج الفئران مع الإدخالات المستهدفة. من خلال اختبار طريقتنا في أجنة الفئران وفحص الكيسات الأريمية المستزرعة لإدخال إنترون اصطناعي قصير مهندس يحتوي على مواقع loxP ، لاحظنا أن أكثر من 60٪ من الكيسات الأريمية تحتوي على أليل مستهدف بشكل صحيح بناء على تحليل تسلسل الجيل التالي (NGS) (الشكل 4). علاوة على ذلك ، اختبار طريقتنا لإنتاج الفئران الحية ، قمنا بتصميم مشروع لهندسة تسلسل ترميز Cre recombinase الذي يستهدف موقع بدء ATG لجين الفئران Drd2. يتكون قالب مانح الحمض النووي المعبأ AAV من تسلسلات ITR المطلوبة لتغليف AAV ، وذراع تماثل 5 بوصات (422 نقطة أساس في الطول) ، وتسلسل Cre-pA (طوله 1339 نقطة أساس) ، وذراع تماثل 3 بوصات (477 نقطة أساس في الطول) (الشكل 5 أ). من بين 11 نسلا ولدوا ، كانت 10 إيجابية عن طريق تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتسلسل Cre-pA الذي تم إدخاله بشكل صحيح في موقع بدء ATG للفئران Drd2 (الشكل 5B-D). تم تأكيد الإدراج المستهدف لاحقا من خلال تحليل تسلسل الحمض النووي. كملخص لأكثر من 7 مشاريع مختلفة ، حققنا متوسط معدل نجاح غير مباشر بنسبة 76٪ في المؤسسة كما هو محدد من خلال تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل عبر تقاطعات ذراع التماثل والتحقق من تسلسل الحمض النووي (الجدول 2).

الجهد [V] طول النبض [مللي ثانية] الفاصل الزمني للنبض [مللي ثانية] # من البقول معدل الاضمحلال [٪] قطبيه
نبض المسام 40 3.5 50 4 10 +
نقل النبض 5 50 50 5 40 +/-

الجدول 1: معلمات التثقيب الكهربائي. تأكد من أن الحد الحالي قيد التشغيل أثناء التثقيب الكهربائي.

Figure 2
الشكل 2: عملية التثقيب الكهربائي للجنين ثنائي الخلية. أ: قطب كهربائي منزلق زجاجي. (ب) الأجنة المعلقة في كواشف تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 وتحميلها في القطب الكهربائي المنزلق الزجاجي قبل التثقيب الكهربائي. ج: تكون فقاعات الهواء على كل قطب كهربائي أثناء التثقيب الكهربي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: ظهور الجنين بعد التثقيب الكهربائي. ويلاحظ الانصهار الخلوي في ما يصل إلى 20 ٪ من أجنة الخلية 2 بعد التثقيب الكهربائي. يمكن أن تنتفخ الخلايا الجنينية أيضا داخل المنطقة الشفافة التي تملأ الفراغ المحيطي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: توصيل الحمض النووي بوساطة AAV وكفاءة التثقيب الكهربائي للجنين 2 خلية في الكيسات الأريمية للفئران. البيانات المقدمة كنسبة مئوية من الكيسات الأريمية الإيجابية للكشف الصحيح عن الأليل عن طريق تسلسل الجيل التالي (NGS). N = 28 كيسة أريمية (مجموعة تحكم للثقافة فقط) ، N = 37 كيسة أريمية (مجموعة تحكم بالتثقيب الكهربائي (EP) فقط) ، و N = 35 كيسة أريمية (مجموعة AAV + EP). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: إنشاء نموذج فأر Drd2-Cre. أ: استهداف جين الفئران Drd2. تم تصميم مجمع RNP لاستهداف Exon 2 الذي يحتوي على موقع بدء منطقة الترميز. احتوى قالب مانح AAV على تسلسلات تكرار طرفية مقلوبة فيروسية (ITR) ، وأذرع تماثل الجينات Drd2 5 و 3 '(HA) وجين Cre مع تسلسل polyA. يؤدي التكامل الناجح لقالب المتبرع إلى طرق الجين Cre 3 'إلى موقع البداية داخل Exon 2. هذا يضع جين Cre تحت سيطرة مروج Drd2 بينما يطرد جين Drd2 في نفس الوقت. يشار إلى موقع بادئات PCR المستخدمة لتأكيد نجاح الضربة القاضية بواسطة أسهم أرجوانية. (ب) تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل للحيوانات التي يحتمل أن تكون محررة في الجينوم (Lanes B10-C8) مع مواد أولية تمتد عبر ذراع التماثل مقاس 5 بوصات. حارة C9: النوع البري (التحكم السلبي) ؛ حارة C10: لا يوجد قالب (تحكم سلبي). حجم amplicon المتوقع للحيوانات الإيجابية هو 601bp. (C) تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل للحيوانات التي يحتمل أن تكون محررة في الجينوم (Lanes D8-E6) مع الاشعال التي تمتد عبر ذراع التماثل 3 بوصات. حارة E7: نوع البرية. الحارة E8: لا يوجد عنصر تحكم في القالب. حجم amplicon المتوقع للحيوانات الإيجابية هو 676bp. (D) الكشف عن الجينات Cre. حجم amplicon المتوقع هو 381bp. الممرات C7-D5: المؤسسون المحتملون ؛ حارة D6: نوع البرية. الحارة D7: لا يوجد عنصر تحكم في القالب. تم تحليل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري مع علامات محاذاة 15bp-3kb (المشار إليها باللون الأخضر). تظهر علامة حجم QX DNA على يسار كل صورة بحجم الذروة المقابل لحجم amplicon PCR في أزواج القواعد (bp). تم تعديل هذا الرقم بإذن من المرجع24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وصف المشروع النسل إيجابي للضربة القاضية (٪)
Oprm1-P2A-Flp (إدراج 1.7 كيلوبايت) 5/5 (100%)
Drd2-Cre (إدراج 1.3 كيلوبايت) 10/11 (91%)
Triml2-P2A-Cre (إدخال 1.3 كيلوبايت) 9/16 (56%)
Cxcl15-iCre (إدراج 1.3 كيلوبايت) 6/6 (100%)
Opn4-P2A-Cre (إدراج 1.2 كيلوبايت) 6/8 (75%)
Vipr1-FLEX-EGFP (إدخال 1.4 كيلوبايت) 5/12 (42%)
Rosa26-فليكس-MTS-كيلر ريد (إدراج 3.1 كيلوبايت) 5/7 (71%)

الجدول 2: معدلات نجاح نموذج الضربة القاضية

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أحدث نظام تحرير الجينوم CRISPR-Cas ثورة في مجال الهندسة الوراثية من خلال السماح بالإنتاج الفعال لكل من التعديلات الجينية المباشرة والمعقدة والمخصصة في مجموعة متنوعة من الأنواع الحيوانية. التحسينات والتحسينات المتكررة في التقنيات المرتبطة بتحرير الجينوم تزيد من تنوعها. لقد وصفنا هنا نهجا جديدا باستخدام توصيل الحمض النووي بوساطة ssAAV جنبا إلى جنب مع التثقيب الكهربائي للجنين ثنائي الخلية لكواشف CRISPR-Cas9 في أجنة القوارض ثنائية الخلية. لقد أثبتنا أن هذه طريقة فعالة لإنتاج نماذج حيوانية مستهدفة.

الميزة الرئيسية لاستخدام AAV هي أنه يتيح تسليم قوالب إصلاح الحمض النووي الأكبر إلى الأجنة دون الحاجة إلى تقنيات الحقن المجهري. يساعد التسليم بوساطة AAV أيضا في التحايل إلى حد ما على قيود حجم قالب الحمض النووي للتثقيب الكهربائي وحده. ومع ذلك ، هناك بعض الاعتبارات المهمة عند استخدام AAV. تعمل المنطقة الشفافة ، مصفوفة البروتين السكري المتصلب المحيطة بالبويضة المخصبة ، كحاجز مادي غالبا ما يعقد توصيل الأحماض النووية. ترقق المنطقة الشفافة هو تقنية شائعة تستخدم لتحسين الوصول إلى الجنين. ومع ذلك ، فقد أفادت بعض الدراسات أن نمو الجنين يعوقه العدوى بجرعات أعلى (1 × 107 GC / μL إلى 1 × 109 GC / μL) AAV في الأجنة التي تم فيها ترقق المنطقة الشفافة قبل الإصابة ب AAV22. ومع ذلك ، هناك بعض الأنماط المصلية ل AAV التي يمكن أن تنتشر عبر المنطقة pellucida29. لا يتضمن بروتوكولنا ترقق المنطقة الشفافة ويستخدم AAV مع النمطين المصليين 1 و 6 بتركيز 3 × 107 GC / μl لتحقيق معدلات ضربة قاضية أعلى من التقارير المنشورة سابقا. لم نلاحظ انخفاض نمو الجنين في ظل هذه الظروف.

من المرجح أن تكون الكفاءة العالية التي تحققها التثقيب الكهربائي للأجنة المكونة من خليتين بسبب مرحلة G2 الممتدة في الأجنة في هذه المرحلة من التطور ، مما يجعل هذه مرحلة تطوير مثالية لإجراء التثقيب الكهربائي. ومع ذلك ، فإن أحد المضاعفات المحتملة هو الانصهار الخلوي الملحوظ الذي شوهد في بعض أجنة الخلايا 2 أثناء عملية التثقيب الكهربائي. هذه الملاحظة ليست مفاجئة بالنظر إلى أن إجراءات الصهر الكهربائي تستخدم بشكل شائع لدمج خلايا الثدييات ويمكن تجنب الاندماج عن طريق محاذاة المحور الأفقي بدلا من المحور الرأسي الدقيق بين الأقطاب الكهربائية30,31. علاوة على ذلك ، عندما يحدث تحرير الجينوم في مرحلة لاحقة من التطوير مثل خلية 2 بدلا من خلية واحدة ، هناك إمكانية أكبر لزيادة الفسيفساء. باستخدام نهج التثقيب الكهربائي للخلايا 2 ، لاحظنا زيادة طفيفة في الفسيفساء مقارنة بالحقن النووي (86٪ لنهج AAV و 67٪ لنهج PNI) في مرحلة خلية 1 ولكننا ما زلنا قادرين على تحقيق انتقال الخط الجرثومي للأليل المعدل في جميع المؤسسة التي تم اختبارها. مصدر قلق محتمل آخر هو إمكانية تكامل المتسلسل الترادفي لقوالب الحمض النووي المشتقة من AAV. على الرغم من أننا لم نقم بإجراء تسلسل طويل القراءة للنماذج الموضحة في هذا البروتوكول ، فقد أكدنا التكامل الفردي لقوالب الحمض النووي لجميع النماذج باستخدام اختلاف رقم نسخة PCR الرقمي (ddPCR).

أخيرا ، بينما تضمنت طريقتنا تسليم AAV لتسلسل الحمض النووي ذي الأهمية ، يجب أن يكون من الممكن استخدام طرق توصيل الحمض النووي الأخرى بوساطة فيروسية وغير فيروسية بالتزامن مع التثقيب الكهربائي للأجنة لمعالجة الأجنة وراثيا بنجاح. في الختام ، فإن الجمع بين توصيل الحمض النووي بوساطة ssAAV والتثقيب الكهربائي ل CRISPR-Cas9 RNPs في أجنة مرحلة 2 خلية هو طريقة فعالة وقابلة للتكيف بسهولة لتوليد نماذج الفئران بكفاءة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا نولان ديفيس على المساعدة في تصوير الفيديو وتحرير الفيديو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leads with alligator clips for electrodes NepaGene C117
Mineral oil MilliporeSigma M5310
NepaGene21 Super Electroporator  NepaGene NEPA21
Platinum plate electrodes on slide glass NepaGene CUY501P1-1.5
PURedit Cas9 Protein MilliporeSigma PECAS9
sgRNA (chemically-modified) Synthego N/A
ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template Vectorbuilder N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20 (2020).
  2. Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
  3. Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
  4. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
  5. Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).
  6. Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
  7. Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
  8. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382 (2014).
  9. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  10. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
  11. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  12. Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).
  13. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).
  14. Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).
  15. Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
  16. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069 (2020).
  17. Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482 (2021).
  18. Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
  19. Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
  20. Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
  21. Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
  22. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  23. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  24. Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).
  25. Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
  26. Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
  27. Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
  28. Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
  29. Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
  30. Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
  31. Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382 (2013).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 205 ، الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) ، تحرير الجينوم ، CRISPR-Cas ، التثقيب الكهربائي ، أجنة الخلية 2 ، ضربة قاضية ، نموذج الفئران
CRISPR-Cas9 تحرير الجينوم لأجنة الفئران باستخدام الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) والتثقيب الكهربائي للأجنة 2 خلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

J. Davis, D., McNew, J. F., Walls,… More

J. Davis, D., McNew, J. F., Walls, J. N., Bethune, C. E., Oswalt, P. S., Bryda, E. C. CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus (AAV) and 2-Cell Embryo Electroporation. J. Vis. Exp. (205), e66069, doi:10.3791/66069 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter