Summary
We tonen aan dat de overexpressie van de epidermale groeifactor (EGFR) de beweeglijkheid van neurale stamcellen (NSCs) met behulp van een roman agarose gel op basis microfluïdische toestel verbetert. Deze technologie kan gemakkelijk aan te passen aan andere zoogdiercelsystemen waar mobiele bronnen zijn schaars, zoals menselijke neurale stamcellen, en de doorlooptijd is van cruciaal belang.
Abstract
Terwijl de microfluïdische technologie is het bereiken van een nieuw niveau van volwassenheid voor macromoleculaire assays, cel-gebaseerde testen zijn nog in een prille stadium 1. Dit is grotendeels te wijten aan de moeilijkheid waarmee men kan een cel-compatibele en gestage micro-omgeving met behulp van conventionele microfabricage technieken en materialen te creëren. We pakken dit probleem aan door de invoering van een roman microfabricage materiaal, agarose gel, als het basismateriaal voor de microfluïdische apparaat. Agarose gel is zeer buigzaam, en doorlaatbaar voor gas en voedingsstoffen die nodig zijn voor de overleving van de cel, en dus een ideaal materiaal voor cel-gebaseerde testen. We hebben eerder al aangetoond dat agarose gel gebaseerde apparaten succesvol zijn geweest in het bestuderen van bacteriën en neutrofielen celmigratie 2. In dit rapport worden drie parallelle microfluïdische kanalen patroon in een agarosegel membraan van ongeveer 1mm dikte. Constante stromen met media / buffer worden onderhouden in de twee nevengeulen met behulp van een peristaltische pomp. Cellen zijn aangehouden in het centrum kanaal voor observatie. Omdat de voedingsstoffen en chemicaliën in de zijgeleiders voortdurend verspreiden van de kant tot het centrum kanaal, de chemische omgeving van het centrum kanaal is eenvoudig te bedienen via de stroming langs de zijkant kanalen. Met behulp van dit apparaat, tonen we aan dat de beweging van neurale stamcellen kan optisch worden gecontroleerd met gemak onder verschillende chemische omstandigheden, en de experimentele resultaten tonen aan dat de overexpressie van de epidermale groeifactor (EGFR) de beweeglijkheid van neurale stamcellen verbetert. Beweeglijkheid van neurale stamcellen is een belangrijke biomarker voor de beoordeling van cellen agressiviteit, waardoor tumorigene factor 3. Het ontcijferen van het onderliggende mechanisme van NSC beweeglijkheid levert inzicht in beide stoornissen van neurale ontwikkeling en in de hersenen kankerstamcel invasie.
Protocol
Procedure
Coating dia's met fibronectine
Voorafgaand aan de montage van de microfluïdische apparaat, steriliseren glazen dia's met fibronectine. De vacht van de dia's in een biohood om de steriliteit te behouden. Breng een steriel PDMS spacer langs de randen van de dia en markeer de kant die is omhoog geconfronteerd met een permanent marker. Pipetteer 1 ml van een 5 ug / ml-oplossing van fibronectine (Sigma) in het PDMS spacer over het geheel van het glas dia. Laat de dia's ongestoord gedurende een uur, daarna drogen met behulp van een N-2 geweer. De dia's kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor latere experimenten.
Montage van het apparaat
Het gehele apparaat de montage-protocol wordt gedaan in een biohood onder steriele omstandigheden, met behulp van de volgende procedures:
- Reinig de silicium meester met de microkanalen patroon op door af te vegen naar beneden met 70% ethanol en drogen met de N 2 pistool. Plaats een steriel PDMS spacer van 1 mm hoogte met behulp van een tang om het reliëf kenmerken van de meester.
- Bereid de agarose gel wordt gebruikt in het apparaat door weging 0,3 g agarose poeder (Fisher Scientific) en 10 ml van de CO 2-onafhankelijke media (Invitrogen) in een 50 ml beker. Roer het mengsel met een spatel en warmte in een magnetron 20 seconden op HIGH. Als niet-opgeloste korrels aanwezig zijn, breng dit mengsel nog 10 seconden en draai het hete mengsel om zich te ontdoen van de laatst overgebleven korrels. Herhaal dit proces met een opwarmtijd van 8 seconden en 5 seconden.
- Snel giet de agarose oplossing op het silicium meester omringd door de PDMS spacer en onmiddellijk de agarose mengsel te bedekken met een steriele glazen dia. Breng een constante, zachte druk op de glijbaan voor ongeveer 2 minuten om ervoor te zorgen dat de agarose gel zal aan dezelfde constante 1 mm hoogte als de PDMS spacer.
- Na de agarose gels, haal het patroon agarose gel met de PDMS spacer van het silicium master en over te dragen aan een fibronectine gecoat glas dia met de microkanalen in de agarosegel met uitzicht op de dia. Gebruik een 16 gauge spuit tip om gaten in het reservoir gebieden van de microkanalen voor de inlaat en uitlaat toegangen. Voeg 500 ul van CO 2-onafhankelijke media om de patroon agarosegel op de dia om uitdrogen van de microkanalen te voorkomen.
- Was de acryl spruitstuk gebruikt in het toestel met 70% ethanol en spoel af met DI-water. Lijn de gaten in het spruitstuk met de gaatjes in de agarose gel met de microkanalen. Dan, lijn het spruitstuk met de gel, PDMS spacer, en de fibronectine dia met het metalen frame van het apparaat. Plaats schroeven in het apparaat en draai op het punt van weerstand met behulp van een schroevendraaier. Dit wordt gedaan om ervoor te zorgen dat het apparaat niet is over-verscherpt om de mate van vervorming van de microkanalen in de agarose. Draai de schroeven in een met de klok mee om ervoor te zorgen dat de gel in het apparaat niet verschuift. Test het apparaat op lekken en blokkades in de microkanalen met behulp van een 1 ml spuit. De spuit is voorzien van Tygon slang met een gel-loading pipetpunt aan het eind van de slang om de CO 2-onafhankelijke media te injecteren in de microkanalen. Een microkanalenplaat wordt geacht met succes gevormd wanneer de media wordt waargenomen om alleen af te sluiten van de uitlaat van de microchannel wanneer media wordt geïnjecteerd in de bijbehorende inlaat. Nu, het apparaat is klaar voor gebruik.
Het voorbereiden en zaaien van de cellen in het apparaat
Wanneer de cellen 70% confluentie (cel-dichtheid rond de 100.000 cellen / ml) te bereiken, zijn ze bereid te worden gezaaid in het apparaat.
Onder voorbehoud van de cellen twee DPBS (Invitrogen) wast. Voeg 200 ul van trypsine-EDTA (Invitrogen) om de cellen los te maken. Overdracht van de cellen om een 15 ml centrifugebuis met daarin 5 ml van de M2-medium met serum van de trypsine te inactiveren. De groei van media gecentrifugeerd met de cellen bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Aangezogen uit de bovendrijvende en resuspendeer de pellet van cellen 5 ml DPBS. Centrifugeer opnieuw de DPBS cellen onder dezelfde voorwaarden. Aangezogen uit de bovendrijvende weer, en resuspendeer de pellet van de cel in 500 pi van CO 2-onafhankelijke media.
Zaad van de resulterende suspensie van cellen in het midden microchannel van het toestel via de zwaartekracht-stroming. Voeg de inlaat en de uitlaat van het centrum microchannel met 60 ul van de celsuspensie en 20 ul van CO 2-onafhankelijk medium, respectievelijk. Let op het centrum microchannel onder een helderveld microscopie om te zoeken naar celadhesie. De cellen hechten meestal na 10 minuten. Nadat de cellen zich te houden aan het kanaal bodem op een goede dichtheid, pipet afgescheiden van de rest van celsuspensie in de inlaat en de media in het stopcontact. Plaats 60 ul van CO 2-onafhankelijke media in zowel de inlaat en uitlaat van het centrum kanaal. Plaats PDMS bestrijkt meer dan ee midden-en uitlaat om verdamping van media uit het middenkanaal te minimaliseren.
Beeldvorming van de cellen in het apparaat
Voorafgaand aan de montage van het apparaat, draad de steriele peristaltische slang door het weerstation van de microscoop (Olympus x81) en verbinden met de peristaltische pomp (Watson-Marlow 205U/CA). Spoel PBS via de slang met een snelheid van 4 RPM. Na de montage van het apparaat, voor te bereiden geschikte concentraties van epidermale groeifactor (EGF) (Sigma) oplossingen in de CO 2-onafhankelijke media in een 15 ml centrifugebuis. Vortex het EFG oplossingen voor 5 seconden en verbinding maken met de slang. Sluit de leidingen gemarkeerd met bijbehorende EGF-concentraties op het apparaat. Het duurt ongeveer een uur voor het EFG te diffunderen over het kanaal nok en zorgen voor een constante chemische gradiënt.
Een imaging software, Slidebook, wordt gebruikt om een reeks van beelden bij elke 10 minuten voor ongeveer 5 uur in een experimentele run te nemen. De xy geautomatiseerde stadium is zo geprogrammeerd dat twee sub-gebieden (elk met een oppervlakte van 400μm x400μm) van hetzelfde centrum kanaal en een totaal van drie center kanalen worden afgebeeld op een gegeven tijdstip. Cellen in verschillende center kanalen (meestal 3 in een run) hebben verschillende EGF concentraties, zoals aangegeven op de slang.
Materiaal en Uitrusting
Cellijnen: C17.2 cellen NSCs afgeleid van de externe germinale laag van postnatale muis cerebellum 6, 7. Met behulp van deze cellijn, hebben we twee andere muriene stamcellen met behulp van retrovirus transfectie methode. Deze twee stabiel getransfecteerde cellijnen zijn (1) wtEGFR - dat het menselijk wildtype EGFR over-uitdrukt, en (2) ΔEGFR - dat is een constitutief actieve EGFR mutant. Voor het gemak van detectie, retrovirussen dragen een backbone met het gen van belang, gevolgd door een interne site voor ribosomale binding (IRES) en het Green Fluorescent Protein (GFP).
Celcultuur: De muis C17.2 NSCs en hun varianten werden gekweekt in een 6-wells plaat in M2 media (DMEM (Invitrogen) met 10% foetaal bovine serum (FBS) (Invitrogen), 5% paard serum (HS) (Invitrogen ), en 1% penicilline / streptomycine (Invitrogen).) Cellen werden gehandhaafd bij 37 o C in 80% lucht en 5% CO 2.
Microfluïdische apparaat: Een plastic spruitstuk, een PDMS spacer, en een RVS kader voor het houden van het apparaat op zijn plaats.
Imaging
Een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (Olympus IX-81) wordt gebruikt, in verband met een geïntensiveerde CCD camera (Orca, Hamamatsu). De microfluïdische apparaat is gemonteerd op een geautomatiseerde xyz stadium, en het podium wordt omsloten door een milieu-kamer die een temperatuur van 37 ° C. onderhoudt Er zijn meestal 3-4 apparaten op dezelfde chip die zal gefilmd worden op hetzelfde tijdstip met behulp van de automatische xyz podium.
Flow behoud van
Een peristaltische pomp met acht parallelle lijnen (Watson-Marlow 205U/CA) auto wordt gebruikt om de stromen in alle van de wasbak en de bron-kanalen te behouden.
Fig. 1 Motiliteit van drie NSC stammen (ouders, wtEGFR, en D EGFR) in verschillende EGF concentraties Alle trajecten worden genomen van het bijhouden van een film van 5 uur (met uitzondering van wtEGF 100ng/ml, 4 uur), en de oorsprong van alle tracks zijn geherpositioneerd op (0,0) ter vergelijking doel.
Fig. 2 Correlatie van EGFR-expressie niveau en de beweeglijkheid (a) twee beelden van wtEGF NSCs op het oppervlak van een microfluïdische kanaal met 100ng/ml EGF. De linker afbeelding is een tl-imago, en het recht is een uitgezonden helder veld beeld. De schaal bar is 100 urn, en de Kanaalbreedte is 400 micrometer. Cellen worden gescheiden in twee populaties van de helderheid van uitdrukking de GFP. Cellen in de blauwe cirkels zijn dimmer, dus minder EGFR-expressie niveau, en cellen in de rode cirkels zijn brigher, hebben dus een hogere EGFR-expressie niveau. (B) Trajecten van cellen met lage en hoge EGFR-expressie niveau. Deze trajecten zijn afkomstig uit een vier uur durende film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fig. 1 toont trajecten van drie NSC stammen, de ouderlijke cellen, de wtEGFR en de ΔEGFR (controle). Elke set van trajecten werden verkregen uit een vijf uur lange film. Voor de ouderlijke cellen, celbeweeglijkheid bereikte een hoogtepunt toen EGF-concentratie werd ~ 10ng/ml, want wtEGFR cellen, celbeweeglijkheid piek verschoven naar 100ng/ml of hoger, voor ΔEGFR cellen, de cel beweeglijkheid was onafhankelijk van de EGF concentratie als verwacht.
De wtEGF cellen met 100ng/ml waren de meest beweeglijke cellen, verhuisden ze naar ongeveer 1,5 keer sneller dan de ouderlijke cellen met 10ng/ml. Dit geeft aan dat (1) over expressie van EGFR-cellen motiliteit verbetert, (2) het aantal van de EGF-receptor ligand afwachtende gebeurtenissen is een direct effect op de cel beweeglijkheid. ΔEGFR cellijn is een constitutief actieve EGFR mutant. Deze mutant wordt weergegeven in ~ 60% van de menselijke glioblastoom. Het heeft een afgebroken extracellulaire domein dat wordt een constitutieve actieve ligand-onafhankelijk kinase. De intensiteit van de autofosforylatie is klein (ongeveer 10%) in vergelijking met ligand geactiveerde wild-type EGFR (wtEGFR) 4. Dit ligt ten grondslag aan de waarneming dat ΔEGF cellen iets hoger dan de beweeglijkheid van de ouder-en wtEGFR (bij afwezigheid van EFG) hebben, maar de beweeglijkheid is gehouden een constante in de verschillende EGF concentraties.
Sinds de wtEGFR cellen vervoerd dezelfde exemplaren van GFP (groen fluorescerend eiwit) en EGFR, de fluorescentie-intensiteit van de wtEGFR cellen onthullen de EGFR-expressie niveaus. Dit stelt ons in staat om direct te correleren de EGFR-eiwit expressie niveau (groen fluorescentie-intensiteit), met de cel beweeglijkheid. Fig. 2 toont de trajecten van twee cel populatie, de cellen in rode cirkel zijn helderder, heeft dus een hogere EGFR-expressie niveau, en de cellen in de blauwe cirkel zijn het diner, heeft dus een lagere expressie van EGFR-niveau. De resultaten wederom laten zien dat hoe hoger het EGFR-expressie niveau, de meer beweeglijke deze cellen zijn.
Traditioneel is de beweeglijkheid van NSCs is bepaald met behulp van een Boyden kamer assay, waar het percentage van de cellen migreren via een membraan wordt geëvalueerd 5. Dit is een populatie gebaseerde test, waar de cel gedrag niet kan individueel worden beoordeeld. De microfluïdische apparaat hier getoond biedt een kans tot cel beweging studeren aan een enkele cel niveau, en in een goed gecontroleerde chemische omgeving. Het staat een, voor de eerste keer, om direct te correleren de EGFR-eiwit expressie niveau met de NSCs motiliteit fenotype in levende cellen. Het kleine formaat van het apparaat is vooral handig voor experimenten waarbij cellen bronnen zijn beperkt, zoals de menselijke stamcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de New York State Office of Science, Technology en Wetenschappelijk Onderzoek (NYSTAR) (in de vorm van een Center for Advanced Technology subsidie), en door subsidies van de Nanobiotechnologie Center (NBTC), een STC-programma van de Nationale Science Foundation onder arbeidsovereenkomst nr. ECS-9876771, en de Amerikaanse hersentumor Association en de New York Academy of Medicine (JAB).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1356-500 |
References
- Blow, N. Microfluidics: in search of a killer application. Nature Methods. 4, 665-670 (2007).
- Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).
- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
- Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis. J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).
- Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. Cell. 68, 33-51 (1992).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).
