Summary
本视频演示了如何利用互补的方法，研究线虫，线虫突触功能的神经兴奋剂，涕灭威和戊四氮（PTZ），。这种互补的方法也可能被用来阐明调节神经元的同步进化上保守的机制和癫痫和癫痫发作的影响。
Abstract
线虫，线虫，已成为研究神经递质的权宜之计模型。线虫在动物模型中是独一无二的，解剖学和神经系统的连接已经从电子显微镜确定和完善了药理实验。在这段视频中，我们描述了如何两个互补的神经兴奋剂，涕灭威，乙酰胆碱酯酶抑制剂，和伽马氨基丁酸（GABA）受体拮抗剂，戊四氮（PTZ），可受聘具体特征线虫神经肌肉接头的信号（NMJs），方便我们对立的神经回路的了解。
302线虫的神经元，十九电机D型GABA能神经元支配体壁肌肉（BWMs），而GABA能神经元，称为RMEs，头部肌肉的支配。相反，三十九个运动神经元表达的兴奋性神经递质，乙酰胆碱（ACH），拮抗GABA的传输在BWMs协调运动。 GABA能和胆碱能运动神经元在体壁NMJs的对立性质最初由激光烧蚀和后来挟着涕灭威曝光。涕灭威在野生型蠕虫当然时间或剂量反应瘫痪急性暴露的结果。然而，兴奋胆碱传输损失抗性涕灭威，蠕虫NMJs少乙酰胆碱的积累，导致少BWMs刺激。与乙酰胆碱的特定或一般的突触功能的突变体，可观察到涕灭威的电阻。与对立的传输γ-氨基丁酸和乙酰胆碱，GABA的传输损失，或失败负调节乙酰胆碱的释放一致，赋予过敏涕灭威。虽然涕灭威曝光导致的许多蠕虫病毒的神经递质基因同源的隔离，涕灭威曝光单独不能有效地判断当时的角色线虫在特定的运动神经元的基因和途径。为此，我们引入了一个互补的实验方法，它使用云台。
神经传递突变体显示清晰的表型，有别于涕灭威，引起瘫痪，到PTZ。野生型蠕虫病毒，以及与乙酰胆碱的释放或接收的具体无能的突变体，并没有显示明显的敏感性云台。然而，氨基丁酸的突变体，以及一般的突触功能的突变体，显示在时间的课程或剂量反应的方式，前抽搐。到BWMs突变体不能负调控一般神经递质的释放，因此，分泌过量的乙酰胆碱，成为云台瘫痪。离散突变类的PTZ诱导的表型表明，涕灭威和线虫的PTZ曝光范式互补的做法，可能会加速我们的神经传递的理解。此外，视频演示了如何进行药理实验，应建立对线虫的研究相一致方法。
Protocol
涕灭威曝光范式
- 在第一天，确保至少30个年轻的成年阶段各基因型和每个复制的蠕虫将于第二天，涕灭威的检测。这是最好的，如果实验者选择了50多个L4阶段到新鲜NGM板蠕虫（最好没有制霉菌素），其中含有大肠杆菌作为食物来源的大肠杆菌 （最好OP50），并成长为12-24小时，他们在一个一致的和宽松的温度（20 ° C至22 ° C是最好的，虽然25℃是好的）。
- 第二天，用70％乙醇（酒精）和30％DDH 2 O的100毫米的涕灭威原液传播到定义的卷NGM减去制霉菌素片适量，涕灭威，达到了预期的涕灭威的浓度。我们坚持用电镀0.5毫米涕灭威100毫米涕灭威的37.5微升到7.5毫升NGM板。允许的涕灭威牌干在室温下大约30-60分钟。这是没有必要打击的盖子。另外，涕灭威，可以添加到NGM，并储存在4 ° C一个星期。
- E.干燥，板卷一致后大肠杆菌 （最好OP50）到每个涕灭威盘的中心和干燥，在室温30-60分钟。我们一贯板25μL的OP50，创建一个足够规模的食品草坪保持不集中在一个小点的蠕虫人满为患。
- 当食物草坪干燥，人们可以进行涕灭威的检测。由于涕灭威的检测的主观性质，它是强烈建议，实验进行“盲目”。主实验者的同事可以重新标签与被检测的蠕虫的原板。同样，同事可能会转移蠕虫立即从原来的板块，以加密形式涕灭威板之前启动一个计时器。如果实验者预计特定菌株的蠕虫病毒特征的表型，如uncoordination，化验，然后还必须是一个类似的表型，以减少偏差的控制。此外，它是最好的，如果实验者实验平行利于规范实验的一个野生型菌株，以及一个耐药菌株和过敏应变，。实验者应努力去分析每一个复制的蠕虫一致。我们一贯分析30单基因型为每个复制的蠕虫。我们也执行至少有三个，每个实验重复。一个有经验的实验者应能分析时间至少有6株。
- 计数以一致的方式催促每一个铂丝蠕虫瘫痪的蠕虫病毒的数量。我们一贯的头部和产品的两倍，两次共三个小时，每30分钟的尾巴的蠕虫病毒。咽抽水停止，也可能被用来定义瘫痪，但只有当实验者采用瘫痪，所有检测的一致的定义。此外，这是值得注意的，一些蠕虫，尤其是那些耐涕灭威，可能会尝试抓取板。在这种情况下，实验者可以传播一致的棕榈酸，蠕虫运动的一种物理性屏障，周围的涕灭威板。我们传播25μL棕榈酸10毫克/毫升乙醇。
云台曝光范式
- 在第一天，确保至少30个年轻的成年阶段各基因型和每个复制的蠕虫将于第二天云台检测。这是最好的，如果实验者选择了50多个L4阶段到新鲜NGM板蠕虫（最好没有制霉菌素），其中含有大肠杆菌作为食物来源的大肠杆菌 （最好OP50），并成长为12-24小时，他们在一个一致的和宽松的温度（20 ° C至22 ° C是最好的，虽然25℃是好的）。
- 第二天，0.5克云台/ mL的DDH云台2 O的原液。传播到NGM减去制霉菌素板定义的卷云台适量，达到理想的云台浓度。因为我们喜欢为PTZ剂量反应分析，我们到7.5毫升NGM板的板不同云台的金额。例如，一个可能板云台原液的37.5微升到7.5毫升NGM板，使5毫克云台/ mL的溶液。允许云台板，约60-120分钟在室温下干燥。这是没有必要打击的盖子。另外，云台可直接添加到NGM的，但应立即固化后用于检测。云台的稳定性大大高于涕少。因此，年纪较大的云台板的分析是不可靠的。云台干燥器，干燥剂在使用前应存放在-20 ° C。我们宁愿放弃后开放，以确保稳定的PTZ约两个月。
- E.干燥，板卷一致后大肠杆菌 （最好OP50）到中心的每个云台板和干燥，在室温30-60分钟。我们一贯板25μL的OP50，创建一个足够规模的食品草坪保持不集中在一个小点的蠕虫人满为患。
- 当食物的草坪是干的，可进行云台检测。虽然云台检测不到涕灭威分析主观，仍强烈建议，实验进行“盲目”。主实验者的同事可以重新标签与被检测的蠕虫的原板。同样，同事可能会转移蠕虫立即从原来的板块，以加密形式云台板之前启动一个计时器。如果实验者预计特定菌株的蠕虫病毒特征的表型，如uncoordination，化验，然后还必须是一个类似的表型，以减少偏差的控制。此外，它是最好的，如果实验者检测野生型菌株，以及前或全身抽搐株并行，帮助规范实验，。实验者应努力去分析每一个复制的蠕虫一致。我们一贯分析30单基因型为每个复制的蠕虫。我们也执行至少有三个，每个实验重复。一个有经验的实验者应能分析时间至少3株。然而，云台诱发惊厥高峰期通常在15-30分钟之间，然后的频率和强度减弱蠕虫瘫痪，或在某些情况下，适应环境的药物。
- 计数“癫痫样”抽搐蠕虫每隔30分钟一小时的总人数。这是最好的得分与前抽搐，我们称之为“头乙”的蠕虫病毒的数量，分别从蠕虫全身抽搐，全身瘫痪，我们称其为“补药”，或组合前抽搐BWM瘫痪，我们称之为“强直阵挛性”。大多数蠕虫的一个单一的基因型，表现出只有一种惊厥。然而，强直阵挛性蠕虫往往成为完全补品，所以应该继续过去30分钟的检测，即使所有的蠕虫已经展出抽搐。此外，这是值得注意的，一些蠕虫病毒可能会试图抓取板。在这种情况下，实验者可能蔓延的云台板周围的棕榈酸。我们传播25μL棕榈酸10毫克/毫升乙醇。
涕灭威和云台的选择线虫突触传递的突变体的行为反应
| 突变体的名称 | 突触的作用 | 行为无药物 | 行为反应的涕灭威（野生型N2相比） | 到云台的行为反应 |
|---|---|---|---|---|
| TOM - 1（ok188） | 抑制性突触传递 | 不协调 | 加强瘫痪率 | 没有区别，从野生型 |
| UNC - 43（n498n1186） | 复杂 | 不协调 | 加强瘫痪率 | 全身惊厥 |
| UNC - 25（e156） | 促进GABA的传输 | 不协调 | 加强瘫痪率 | 前抽搐，全身瘫痪 |
| SNB - 1（md247） | 促进突触传递 | 不协调 | 减按瘫痪 | 前抽搐 |
| UNC - 4（E120） | 促进乙酰胆碱的传输 | 不协调 | 减按瘫痪 | 没有区别，从野生型 |
神经兴奋剂，涕灭威，乙酰胆碱酯酶抑制剂，和GABA受体拮抗剂，戊四氮（PTZ），可用于在互补的方式来表征线虫突触传递的突变体。过剩的兴奋性乙酰胆碱（ACH）在乙酰胆碱传输的负调控因子的有害突变累积的蠕虫体壁神经肌肉接头（NMJs）（如TOM - 1和UNC - 43）积极的监管机构或抑制GABA的传输（例如，UNC - 25）。相反，蠕虫NMJs兴奋胆碱水平都在积极的监管机构一般突触传递（例如，SNB - 1）或ACH -特定的传输基因（如UNC - 4）减少有害突变。当相比，野生型N2蠕虫，NMJs升高兴奋胆碱传输的突变蠕虫展览涕灭威，引起的瘫痪率增强，而降低兴奋性乙酰胆碱传输突变蠕虫表明，涕灭威引起的瘫痪率降低。虽然云台破坏线虫体壁肌肉的神经元同步，不像涕灭威，云台也拮抗GABA的抑制线虫头部肌肉。因此，涕灭威的敏感性不能准确地预测云台灵敏度。阴性或阳性regul的具体缺陷的突变蠕虫乙酰胆碱传输ATION云台存在野生型N2蠕虫是无法区分的，而突变蠕虫与一般的突触传递特定缺陷或抑制GABA的传输表现出强大的云台诱导前抽搐的正调控的缺陷。此外，UNC - 43丧失功能的突变体显示在云台存在全身抽搐，并可能有更多的突触传递异常，从而有助于其独特的药物反应。
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Discussion
当前的协议与 C涕灭威曝光线虫不允许实验者区分与特定的赤字乙酰胆碱在突触传递中的广义赤字的传输和突变体的突变体，突变体的两个类表现出耐涕灭威。同样，涕灭威不能用来确定突变GABA的传输或广义故障的具体赤字负调节乙酰胆碱的传输，因为这两个类的突变体表现出过敏到涕灭威。我们云台暴露实验，涕灭威暴露实验结果相结合，结果使研究人员能够更好地表征突触传递的突变体。
线虫突触传递的突变体可分为直截了当地互补涕灭威和云台曝光范式。涕灭威PTZ诱导前抽搐的耐药突变可能缺乏一般的突触功能。相反，没有PTZ诱导前抽搐的涕灭威的耐药突变可能特别缺乏乙酰胆碱传输。涕灭威过敏，不表现出云台诱导前抽搐的突变体，很可能会失败负调控乙酰胆碱传输。最后，涕灭威过敏的突变体，展览云台诱导前抽搐，可能GABA的缺乏。
涕灭威曝光的工具也削弱了其主体性，不同的实验者往往有不同程度的瘫痪的定义。一个单一的实验者的技术还可以上下浮动。另外，涕灭威暴露蠕虫移动不同的反应多样势力的怂恿。一个瘫痪的蠕虫和一个负责任的蠕虫之间的区别，可以作为一个轻微的头部或尾部抽搐微妙。此外，为更好地表征的C补充涕灭威的检测线虫突触传递的突变体，云台也可能被用来隔离过敏涕灭威突触传递的突变体，尤其是那些突变体。实验者，利用云台曝光，可能简单地看，前抽搐，而不是涕灭威引起的瘫痪细微的差别。>
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Acknowledgments
我们要感谢考德威尔实验室所有成员的合作精神。 March of Dimes的职业生涯从美国国家科学基金会奖，以海关总署从一个罗勒奥康纳学者奖，以及来自霍华德休斯医学研究所的阿拉巴马大学本科生科研的科学项目资助，资助的神经元的兴奋和癫痫研究中的考德威尔实验室。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Aldicarb | Reagent | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | Purchasable from Sigma |
| Pentylenetetrazole | Reagent | Sigma-Aldrich | P6500 |
References
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
