Paradigmi per la caratterizzazione farmacologica di C. elegans Mutanti trasmissione sinaptica

Summary

Questo video dimostra come utilizzare due stimolanti neurali, aldicarb e pentylenetetrazole (PTZ), in modo complementare per studiare la funzione sinaptica nel nematode, C. elegans. Questo approccio complementare può essere utilizzato anche per far luce sui meccanismi evolutivamente conservata per modulare la sincronia dei neuroni e ha implicazioni per l'epilessia e convulsioni.

Abstract

Il nematode, Caenorhabditis elegans, è diventato un modello utile per lo studio di neurotrasmissione. C. elegans è unico tra i modelli animali, come l'anatomia e la connettività del suo sistema nervoso è stata determinata dal microscopio elettronico e raffinato da saggi farmacologici. In questo video viene descritto come due stimolanti complementari neurali, un inibitore dell'acetilcolinesterasi, chiamato aldicarb, e un acido gamma-aminobutirrico (GABA), antagonista dei recettori, chiamati pentylenetetrazole (PTZ), possono essere impiegate per caratterizzare specificamente segnalazione a C. elegans giunzioni neuromuscolari (NMJs) e facilitare la nostra comprensione di antagoniste circuiti neurali.

C. elegans di 302 neuroni, diciannove GABAergici di tipo D motoneuroni innervano i muscoli del corpo a parete (BWMs), mentre quattro neuroni GABAergici, chiamato RMEs, testa innervano i muscoli. Al contrario, 39 motoneuroni esprimere il neurotrasmettitore eccitatorio, l'acetilcolina (ACh), e antagonizzano la trasmissione GABA a BWMs per coordinare locomozione. La natura antagonista dei neuroni colinergici e GABAergici motore a corpo NMJs muro è stato inizialmente determinato da ablazione laser e poi sostenuta da esposizione aldicarb. Di esposizione acuta risultati aldicarb in una paralisi tempo portate o dose-risposta in wild-type vermi. Tuttavia, la perdita di trasmissione eccitatoria ACh conferisce resistenza agli aldicarb, come meno ACh si accumula a NMJs verme, portando a meno di stimolazione BWMs. Resistenza alla aldicarb può essere osservata con ACh-specifico o generale mutanti funzione sinaptica. Coerentemente con antagonisti GABA e ACh trasmissione, perdita di trasmissione GABA, o la mancata regolare negativamente ACh rilascio, conferisce ipersensibilità al aldicarb. Sebbene l'esposizione aldicarb ha portato all'isolamento di omologhi verme numerosi geni neurotrasmissione, l'esposizione aldicarb da sola non può determinare in modo efficiente ruoli prevalente per i geni e sulle vie di specifiche C. elegans motoneuroni. A questo scopo, abbiamo introdotto un approccio complementare sperimentale, che utilizza PTZ.

Mutanti neurotrasmissione visualizzare fenotipi chiaro, distinto da aldicarb indotta paralisi, in risposta alle PTZ. Wild-type worm, così come mutanti con specifiche incapacità di rilasciare o ricevere ACh, non mostrano sensibilità apparente PTZ. Tuttavia, mutanti GABA, così come generale mutanti funzione sinaptica, display convulsioni anteriore in modo tempo-corso o dose-risposta. Mutanti che non possono negativamente regolano il rilascio dei neurotrasmettitori generale e, quindi, secernono quantità eccessive di ACh su BWMs, diventano paralizzati su PTZ. Il PTZ-indotta fenotipi di discrete classi mutanti indicano che un approccio complementare con aldicarb e paradigmi esposizione PTZ in C. elegans possono accelerare la nostra comprensione della neurotrasmissione. Inoltre, i video che dimostrano come si eseguono i test farmacologici dovrebbero stabilire metodi coerenti per la ricerca C. elegans.

Protocol

Aldicarb esposizione Paradigm

1. Il primo giorno, in modo che almeno trenta giovani vermi adulti fase di ogni genotipo e di ogni replica sarà disponibile per saggi aldicarb il secondo giorno. E 'meglio se uno sperimentatore seleziona cinquanta o più vermi stadio L4 su piastre NGM fresco (meglio senza nistatina), che contengono E. coli (preferibilmente OP50) come fonte di cibo, e farle crescere per 12-24 ore ad una temperatura costante e permissiva (20 ° C a 22 ° C è meglio, anche se 25 ° C va bene).
   
   
2. Il secondo giorno, fare un 100 soluzione madre mM di aldicarb con il 70% di etanolo (EtOH) e il 30% DDH ₂ O. Diffondere la giusta quantità di aldicarb su piastre NGM meno nistatina con volumi definiti per raggiungere le concentrazioni aldicarb desiderato. Siamo costantemente uso aldicarb 0,5 mm con placcatura 37,5 ml di 100 mM aldicarb su piastre NGM 7,5 ml. Lasciare le piastre aldicarb ad asciugare per circa 30-60 minuti a temperatura ambiente. Non è necessario rompere i coperchi. In alternativa, aldicarb possono essere aggiunti al NGM e conservato a 4 ° C per una settimana.
    
3. Dopo l'essiccazione dei volumi, piastra coerente di E. coli (preferibilmente OP50) sul centro di ogni piatto aldicarb e asciutta per altri 30-60 minuti a temperatura ambiente. Siamo costantemente piatto 25 ml di OP50, che crea un prato di dimensioni abbastanza cibo per mantenere i vermi concentrata in una piccola macchia, senza sovraffollamento.
    
4. Quando il prato cibo è secco, si può procedere con test aldicarb. A causa della natura soggettiva del test aldicarb, è altamente raccomandato che gli esperimenti devono essere eseguiti "alla cieca". Un collega dello sperimentatore principale potrebbe ri-etichettare le tavole originali con i vermi da dosare. Allo stesso modo, il collega potrebbe trasferire i vermi dalle lastre originali di piatti aldicarb cifrati immediatamente prima di iniziare un timer. Se lo sperimentatore anticipa dosaggio un particolare ceppo di worm con un fenotipo caratteristico, come incoordinazione, allora ci deve essere anche un controllo con un fenotipo simile a ridurre i pregiudizi. Inoltre, è meglio se lo sperimentatore saggi uno ceppo selvatico, così come un ceppo resistente e un ceppo ipersensibile, in parallelo per standardizzare esperimenti. Lo sperimentatore dovrebbe sforzarsi di analizzare un numero consistente di vermi per ogni replica. Siamo costantemente analizzare thirty worm di un genotipo unico per ogni replica. Abbiamo anche eseguire almeno tre repliche per ogni esperimento. Uno sperimentatore esperto dovrebbe essere in grado di analizzare almeno sei ceppi alla volta.
    
5. Contare il numero di worm paralizzati da sollecitazione in modo coerente ogni vite senza fine con un filo di platino. Siamo costantemente i nostri prodotti vermi due volte sulla testa e due volte sulla coda ogni 30 minuti per un totale di tre ore. Cessazione di pompaggio faringea può anche essere utilizzato per definire la paralisi, ma solo se lo sperimentatore utilizza una definizione coerente di paralisi su tutti i test. Inoltre, vale la pena notare che alcuni worm, in particolare quelli che sono resistenti a aldicarb, può tentare di strisciare fuori dal piatto. In questo caso, lo sperimentatore può diffondere una quantità consistente di acido palmitico, una barriera fisica di locomozione vite senza fine, intorno le piastre aldicarb. Noi diffusione 25 ml di 10 mg di acido palmitico / ml EtOH.

PTZ esposizione Paradigm

1. Il primo giorno, in modo che almeno trenta giovani vermi adulti fase di ogni genotipo e di ogni replica sarà disponibile per saggi PTZ il secondo giorno. E 'meglio se uno sperimentatore seleziona cinquanta o più vermi stadio L4 su piastre NGM fresco (meglio senza nistatina), che contengono E. coli (preferibilmente OP50) come fonte di cibo, e farle crescere per 12-24 ore ad una temperatura costante e permissiva (20 ° C a 22 ° C è meglio, anche se 25 ° C va bene).
   
   
2. Il secondo giorno, fare una PTZ 0,5 g / ml soluzione madre DDH ₂ O di PTZ. Diffondere la giusta quantità di PTZ su piastre NGM meno nistatina con volumi definiti per raggiungere le concentrazioni PTZ desiderato. Perché noi preferiamo dose-risposta test per PTZ, abbiamo piatto quantità variabili di PTZ su piastre NGM 7,5 ml. Per esempio, si può piatto 37,5 ml di soluzione madre PTZ su una lastra di 7,5 ml NGM fare una PTZ 5 mg / ml soluzione. Lasciare le piastre PTZ ad asciugare per circa 60-120 minuti a temperatura ambiente. Non è necessario rompere i coperchi. In alternativa, PTZ possono essere aggiunti direttamente al NGM, ma dovrebbe essere immediatamente utilizzate per le analisi dopo la solidificazione. La stabilità di PTZ è notevolmente inferiore a quella di aldicarb. Pertanto, le analisi con i piatti PTZ sono meno affidabili. PTZ devono essere conservati a -20 ° C in un essiccatore con un agente di asciugatura prima dell'utilizzo. Noi preferiamo ignorare PTZ circa due mesi dopo l'apertura per garantire la stabilità.
   
   
3. Dopo l'essiccazione dei volumi, piastra coerente di E. coli (preferibilmente OP50)sul centro di ogni piatto PTZ e asciutta per altri 30-60 minuti a temperatura ambiente. Siamo costantemente piatto 25 ml di OP50, che crea un prato di dimensioni abbastanza cibo per mantenere i vermi concentrata in una piccola macchia, senza sovraffollamento.
    
4. Quando il prato cibo è secco, si può procedere con test PTZ. Anche se i test PTZ sono meno soggettivi test aldicarb, è comunque altamente raccomandato che gli esperimenti devono essere eseguiti "alla cieca". Un collega dello sperimentatore principale potrebbe ri-etichettare le tavole originali con i vermi da dosare. Allo stesso modo, il collega potrebbe trasferire i vermi dalle lastre originali di piatti PTZ cifrati immediatamente prima di iniziare un timer. Se lo sperimentatore anticipa dosaggio un particolare ceppo di worm con un fenotipo caratteristico, come incoordinazione, allora ci deve essere anche un controllo con un fenotipo simile a ridurre i pregiudizi. Inoltre, è meglio se lo sperimentatore saggi uno ceppo selvatico, oltre a ceppi con anteriore o full-body convulsioni, in parallelo per standardizzare esperimenti. Lo sperimentatore dovrebbe sforzarsi di analizzare un numero consistente di vermi per ogni replica. Siamo costantemente analizzare thirty worm di un genotipo unico per ogni replica. Abbiamo anche eseguire almeno tre repliche per ogni esperimento. Uno sperimentatore esperto dovrebbe essere in grado di analizzare almeno tre ceppi alla volta. Tuttavia, la frequenza e l'intensità delle convulsioni di solito picco tra i 15-30 minuti di esposizione PTZ-indotta, e quindi attenuare come vermi diventano paralizzati o, in alcuni casi, abituare al farmaco.
   
   
5. Contare il numero di "simil-epilettico" convulsioni vermi ogni 30 minuti per un totale di un'ora. E 'meglio di segnare il numero di worm con convulsioni anteriore, che noi chiamiamo "testa-bob", separata dal numero di worm con tutto il corpo convulsioni, paralisi di tutto il corpo, che noi chiamiamo "tonico", o una combinazione di convulsioni anteriore con paralisi BWM, che noi chiamiamo "tonico-cloniche". La maggior parte dei worm di un singolo genotipo mostra solo un tipo di convulsioni. Tuttavia, tonico-cloniche worm spesso diventano completamente tonico, così si deve continuare il test negli ultimi 30 minuti, anche se tutti i worm hanno già esposto convulsioni. Inoltre, vale la pena notare che alcuni worm può tentare di strisciare fuori dal piatto. In questo caso, lo sperimentatore può diffondere una quantità consistente di acido palmitico attorno i piatti PTZ. Noi diffusione 25 ml di 10 mg di acido palmitico / ml EtOH.

Le risposte comportamentali dei mutanti selezionati C. elegans trasmissione sinaptica a Aldicarb e PTZ

Nome mutante	Ruolo Synaptic	Comportamento senza droga	Risposta comportamentale alla Aldicarb (rispetto al wild-type N2)	Risposta comportamentale di PTZ
tom-1 (ok188)	inibisce la trasmissione sinaptica	scoordinata	tasso maggiore di paralisi	indistinguibile da wild-type
unc-43 (n498n1186)	complesso	scoordinata	tasso maggiore di paralisi	tutto il corpo convulsioni
unc-25 (e156)	promuove la trasmissione GABA	scoordinata	tasso maggiore di paralisi	anteriore convulsioni, paralisi di tutto il corpo
BNS-1 (md247)	promuove la trasmissione sinaptica	scoordinata	aliquota ridotta di paralisi	convulsioni anteriore
unc-4 (E120)	promuove ACh trasmissione	scoordinata	aliquota ridotta di paralisi	indistinguibile da wild-type

Due stimolanti neurale, un inibitore dell'acetilcolinesterasi, chiamato aldicarb, e un antagonista del recettore GABA, chiamato pentylenetetrazole (PTZ), possono essere utilizzati in modo complementare a caratterizzare mutanti trasmissione sinaptica C. elegans. Eccesso di acetilcolina eccitatorio (ACh) si accumula a vite senza fine corpo muro giunzioni neuromuscolari (NMJs) da mutazioni deleterie in regolatori negativi di ACh trasmissione (ad esempio tom-1 e unc-43) o regolatori positivi di inibitori trasmissione GABA (ad esempio, unc-25). Al contrario, i livelli di ACh eccitatorio a NMJs verme sono diminuiti da mutazioni deleterie nei regolatori positivi della trasmissione sinaptica generale (ad esempio, BNS-1) o ACh geni specifici di trasmissione (ad esempio unc-4). Rispetto ai wild-type worm N2, worm mutante con elevata trasmissione eccitatoria ACh a NMJs mostra maggiorazioni aldicarb paralisi indotta, mentre i vermi mutanti con abbassato trasmissione eccitatoria ACh dimostrare aliquote ridotte dell'imposta sul aldicarb indotta paralisi. Anche se PTZ interrompe la sincronia dei neuroni a muscoli del corpo C. elegans muro e non, a differenza di aldicarb, PTZ antagonizza anche inibitorio GABA in C. elegans muscoli della testa. Di conseguenza, la sensibilità aldicarb non può prevedere con precisione la sensibilità PTZ. Vermi mutanti con difetti specifici nel regul negativa o positivazione della trasmissione ACh sono indistinguibili da wild-type vermi N2 in presenza di PTZ, mentre i vermi mutanti con difetti nella regolazione positiva del generale trasmissione sinaptica o difetti specifici inibitori mostra trasmissione GABA robusta convulsioni anteriore PTZ-indotta. Inoltre, unc-43 con perdita di funzione di mutanti visualizzare tutto il corpo convulsioni in presenza di PTZ e probabilmente ulteriori anomalie trasmissione sinaptica, che contribuiscono alla loro risposta ai farmaci unico.

Discussion

Attuali protocolli per l'esposizione aldicarb con C. elegans sperimentatori non permettono di distinguere tra mutanti con deficit specifici nella trasmissione ACh e mutanti con un deficit generalizzato nella trasmissione sinaptica, in quanto entrambe le classi di mutanti mostrano resistenza al aldicarb. Allo stesso modo, aldicarb non può essere utilizzata per determinare se i mutanti hanno deficit specifici nella trasmissione GABA o fallimenti generalizzati di regolare negativamente ACh trasmissione, in quanto entrambe le classi di mutanti presentano ipersensibilità al aldicarb. Risultati dei nostri test esposizione PTZ, se combinati con i risultati di test esposizione aldicarb, permette ai ricercatori di meglio caratterizzare mutanti trasmissione sinaptica.

C. elegans mutanti trasmissione sinaptica può essere classificato in modo diretto da parte complementari aldicarb e paradigmi esposizione PTZ. Aldicarb mutanti resistenti con PTZ-indotta convulsioni anteriore sono probabilmente carente in generale funzione sinaptica. Viceversa, mutanti resistenti aldicarb senza PTZ-indotta convulsioni anteriori sono specificamente probabile carenza di ACh trasmissione. Mutanti con aldicarb ipersensibilità, che non presentano convulsioni anteriore PTZ-indotta, probabilmente non riescono a regolare negativamente la trasmissione ACh. Infine, i mutanti con aldicarb ipersensibilità, che si presentano convulsioni anteriore PTZ-indotta, è probabile GABA carenti.

L'utilità di esposizione aldicarb è anche indebolito dalla sua soggettività, come sperimentatori diversi hanno spesso diverse definizioni di paralisi. Tecnica di un singolo sperimentatore può anche variare. Worm inoltre, aldicarb esposti muoversi in modo diverso in risposta alle diverse forze di sollecitazione. La distinzione tra un verme paralizzato e un verme reattivo può essere sottile come una testa leggera o contrazione coda. Oltre a completare i test aldicarb per una migliore caratterizzazione di C. mutanti elegans trasmissione sinaptica, PTZ può essere utilizzata anche per isolare i mutanti trasmissione sinaptica, specialmente quelli mutanti con ipersensibilità al aldicarb. Sperimentatori, che utilizzano l'esposizione PTZ, può semplicemente cercare convulsioni anteriore, invece di sottili differenze di aldicarb indotta paralisi.>

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Aldicarb	Reagent	Supelco, Sigma-Aldrich	PS734	Purchasable from Sigma
Pentylenetetrazole	Reagent	Sigma-Aldrich	P6500