2.6: 社区从细菌菌落中提取 DNA

1.细菌群落 DNA 提取

1. 开始执行程序，称出筛土 100 克。将它添加到聚丙烯的船只，并添加 100 毫升的提取缓冲液组成的修正与 EDTA 促进释放细菌从土壤基质，然后用手抖三缓冲区。
2. 接下来，重 100 克的玻璃珠，并将它们添加到混合容器。鼓动样本 5 分钟使用珠打设备或机械的手腕动作振动筛 15 分钟添加 10 毫升 20%十二烷基硫酸钠，或 SDS，到混合物，然后鼓动额外的分钟。孵化在 60 分钟的 60-65 ° C 的高温。
3. 同样分发之间单独 50 毫升管，样品和离心机以离心 10 分钟 6,000 x g.转让上清液从管到单个的无菌容器。接下来，重复对土壤颗粒如上文所述，使用大量新鲜的提取缓冲液提取。
4. 接下来，添加填充到半卷 30%聚乙二醇和 1.6 M 氯化钠溶液清洁 50 毫升管加工上清液，约 200 毫升，总体积。反转瓶几次用手混合，和在室温下 2 h.孵育离心机样品在拥有 10 万 x g 20 分钟颗粒的 DNA。
5. 仔细去除上清液离心管，留下部分纯化的核酸颗粒。添加 20 毫升的 TE 缓冲和 1.5 毫升的 7.5 M 钾醋酸溶液，以悬小球，然后涡。放冰 5 分钟离心机在 16,000 x g 4 ° C，以沉淀蛋白质和多糖在 30 分钟的暂停。
6. 接下来，添加到样品的核糖核酸酶和蛋白酶 K、 手，轻轻地混合和让坐一会儿。添加了当量体积的酚: 氯仿: 异戊醇 （25:24:1 比混合物） 悬浮，提取，和混合轻轻用手。离心机 13,000 x g.10 分钟准备仔细从离心机等，并说明这两个图层中删除该船只。
7. 底部，重层组成的酚: 氯仿: 异戊醇提取碎片，和最上面一层是水和含有 DNA。将水相放入无菌容器、 添加了当量体积的异丙醇和反转轻轻启动 DNA 沉淀。孵化在室温下 2 h.纯化 DNA 颗粒悬浮在 16,000 x g 离心 30 分钟仔细删除上清丸粒化的 DNA 可能或可能不在容器的底部可见，然后重悬在 1 毫升的 TE 缓冲。
8. 利用分光光度计或 DNA/RNA 定量荧光计，测量从样本中提取 DNA 的水平。DNA 估计从 260 nm 阅读。1.0 的吸光度读数等于 50 微克的 DNA 每毫升的解决方案。如果浓度太高，读数准确，稀释悬浮 1 到 10 或 1 到 100 使用分子级水。
9. DNA 纯度估计的比例由阅读在 260 毫微米到那在 280 nm。一个值 > 1.7 指示相对较纯的 DNA。最大理论值为 2.0。

细菌群落 DNA 提取是在一次提取程序中从一个群落内的多种细菌物种中获得 DNA 的过程。

土壤中微生物群落的传统分析通常涉及培养测定，在不同的选择性培养基上使用稀释和电镀方法。然而，许多细菌在实验室条件或选定的特定生长培养基条件下生长不良，这意味着它们可能会被遗漏或严重不足。

最近，从土壤细菌样本中提取群落 DNA 可以对细菌群落进行更全面的采样。这种非基于文化的方法被认为比基于传统文化的方法更能代表实际存在的社区。

本视频将演示细菌群落 DNA 提取的非培养方法，如何检查提取的 DNA 的质量和数量，并探索如何利用这种 DNA 来研究细菌多样性。

从土壤中提取 DNA 可以通过以下两种方式之一进行。在分级分离方法中，在提取遗传物质之前，首先将细胞与土壤基质分离。然后对样品进行连续的混合和缓慢离心循环，以收集沉淀中的完整细胞。

然后将溶菌酶添加到细胞中，并孵育悬浮液。溶菌酶是分解细菌细胞壁的酶。一旦细胞壁结构受损，就可以释放 DNA 进行纯化。然而，第二种群落 DNA 提取方法，即原位法，已被证明可以产生更高的 DNA 浓度。

在这里，将大量土壤与等体积的 Tris-EDTA 提取缓冲液和玻璃珠混合，并积极混合以促进细胞与土壤颗粒的分离。然后添加去污剂，通常是十二烷基硫酸钠或 SDS，并进一步混合样品以促进细胞裂解和释放其内容物，包括 DNA。

然后在高温下孵育以裂解任何残留的细菌细胞。将样品离心，并在上清液上进行聚乙二醇提取和孵育，以沉淀 DNA，然后将其离心成沉淀。

将 DNA 重悬于 TE 缓冲液和乙酸钾中，以进一步洗涤蛋白质和多糖的 DNA，然后进行离心以沉淀这些不需要的组分。去除含有 DNA 的水性上清液，并进行苯酚-氯仿提取和异丙醇沉淀，以进一步清洁和浓缩 DNA。室温孵育 2 小时后，将 DNA 离心并重悬于 TE 缓冲液中储存直至分析。

现在我们已经熟悉了细菌群落 DNA 提取背后的概念和过程，让我们来看看它是如何在实验室中进行的。

要开始该程序，请称取 100 克过筛的土壤。将其添加到聚丙烯容器中，加入 100 mL 提取缓冲液，该缓冲液由经 EDTA 修饰的 Tris 缓冲液组成，以促进细菌从土壤基质中释放，然后用手摇晃。

接下来，称取 100 g 玻璃珠，并将其加入混合容器中。使用珠子打动装置或机械手腕式摇床搅拌样品 5 分钟。向混合物中加入 10 mL 20% 十二烷基硫酸钠 （SDS），然后再搅拌一分钟。在高温下孵育 60 分钟。

将样品均匀分配到单独的 50 mL 试管中，并以 6,000 x g 离心 10 分钟。将上清液从试管转移到单个无菌容器中。接下来，如前所述，使用新鲜体积的提取缓冲液在土壤颗粒上重复提取。

接下来，将处理后的上清液总体积加入到 30% 聚乙二醇和 1.6 M 氯化钠溶液中，填充至一半体积的干净 50 mL 试管中。用手将瓶子倒置数次以混合，并在室温下孵育 2 小时。将样品以 10,000 x g 离心 20 分钟以沉淀 DNA。

小心地从离心管中取出上清液，留下部分纯化的核酸沉淀。加入 20 mL TE 缓冲液和 1.5 mL 7.5 M 乙酸钾溶液以重悬沉淀，然后涡旋。将悬浮液置于冰上 5 分钟。在 4 ？C 沉淀蛋白质和多糖。

接下来，向样品中加入 RNAse 和蛋白酶 K，用手轻轻混合，静置片刻。在待提取的悬浮液中加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇，用手轻轻混匀。将制剂以 13,000 x g 离心 10 分钟。小心地从离心机中取出容器，并注意两层。

底部较重的层由苯酚：氯仿：异戊醇和提取的碎片组成，顶层是水性物质，包含 DNA。将水相放入无菌容器中，加入等体积的异丙醇，然后轻轻倒置以开始 DNA 沉淀。将悬浮液在室温下孵育 2 小时。通过以 16,000 x g 离心 30 分钟来沉淀纯化的 DNA。小心去除上清液，因为沉淀的 DNA 在容器底部可能可见也可能不可见，然后重悬于 1 mL TE 缓冲液中。

使用分光光度计或 DNA/RNA 定量荧光计，测量从样品中提取的 DNA 水平。DNA/RNA 荧光计将以纳克/毫升为单位输出 DNA 水平。如果浓度过高而无法准确读数，请使用分子级水将悬浮液稀释 1 至 10 或 1 至 100。

一旦从细菌群落获得 DNA，就可以以多种不同的方式利用。此处探讨了其中一些应用程序。

对从群落 DNA 中提取的 DNA 进行光谱摄影分析可以深入了解给定土壤样本中存在的细菌细胞数量。每 mL 溶液中 ng 的估计 DNA 量可以与溶液中提取的 DNA 总体积相关联，从而得出每 g 土壤的 DNA 总量。知道每个细胞的 DNA 理论值，就可以计算出每 g 土壤的细胞总数。

对于更具针对性的应用，可以从细菌群落中提取的 DNA 进行 PCR 以确定该群落中是否存在特定物种。例如，科学家可能想要确定土壤样品是否含有特定的病原体，例如产气荚膜梭菌或炭疽芽孢杆菌。

最后，为了更全面地了解群落中存在的细菌，DNA 样品可以进行"组学"和生物信息学表征，以便对样品中的原始细菌进行更深入的分析。?组学？介绍了一系列探索分子在生物体或群落中的作用、关系和作用的技术。这包括对基因及其功能的研究，或者 ？基因组学？和 ？蛋白质组学？，蛋白质及其作用的研究。例如，16S？样本中的 RNA 可以对群落内的特定物种进行宏基因组测定，从而更详细地估计多样性。这种方法可以让科学家更好地了解群落的物种构成，以及它们可能扮演的角色。

您刚刚观看了 JoVE 对细菌群落 DNA 提取的介绍。您现在应该了解如何从细菌群落中提取 DNA，如何检查该 DNA 的质量，以及如何将该 DNA 用于研究细菌群落组成。感谢观看！