从细菌菌落中提取群落DNA

1. 细菌群落DNA提取

1. 开始实验前，称取100 g过筛土壤，加入聚丙烯容器中，再加入100 mL提取缓冲液（Tris缓冲液中添加EDTA以促进细菌从土壤基质中释放），手动振荡混匀。
2. 接着称取100 g玻璃珠，加入混合容器中。使用珠磨仪或机械手腕式摇床震荡样品5分钟，或震荡15分钟。向混合物中加入10 mL 20%十二烷基硫酸钠（SDS），再震荡1分钟。在60–65 °C高温下孵育60分钟。
3. 将样品均分至若干个50 mL离心管中，在6,000 × g条件下离心10分钟。将各管中的上清液转移至一个无菌容器中。随后，对土壤沉淀物重复上述提取步骤，使用新鲜的提取缓冲液体积进行操作。
4. 接下来，将处理后的上清液总体积（约200 mL）加入一个洁净的50 mL离心管中，该管预先装有半管体积的30%聚乙二醇和1.6 M氯化钠溶液。手动反复倒置混匀数次，在室温下孵育2小时。在10,000 × g条件下离心20分钟，使DNA形成沉淀。
5. 小心移除离心管中的上清液，保留部分纯化的核酸沉淀。加入20 mL TE缓冲液和1.5 mL 7.5 M乙酸钾溶液以重悬沉淀，涡旋混匀。将悬液置于冰上5分钟。在4 °C、16,000 × g条件下离心30分钟，使蛋白质和多糖沉淀。
6. 随后向样品中加入RNA酶和蛋白酶K，手动轻轻混匀，静置片刻。向待提取的悬液中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（比例为25:24:1）混合液，手动轻轻混匀。在13,000 × g条件下离心10分钟。小心将离心管从离心机中取出，观察两相分层情况。
7. 下层较重的相由苯酚:氯仿:异戊醇及提取出的杂质组成，上层为水相，含有DNA。将水相转移至无菌容器中，加入等体积异丙醇，轻轻倒置以启动DNA沉淀。在室温下孵育2小时。在16,000 × g条件下离心30分钟，使纯化后的DNA沉淀。小心移除上清液（沉淀在管底可能不可见），然后用1 mL TE缓冲液重悬DNA沉淀。
8. 使用分光光度计或DNA/RNA定量荧光计测定样品中提取的DNA含量。DNA量根据260 nm处的读数估算。吸光度值为1.0时相当于每毫升溶液中含有50 µg DNA。若浓度过高影响准确测量，可用分子生物学级水将悬液稀释10倍或100倍后再测定。
9. DNA纯度通过260 nm与280 nm处吸光度读数的比值进行评估。比值>1.7表明DNA相对纯净。最大理论值为2.0。