5.7: 免疫荧光显微镜:石蜡内嵌组织部分的免疫荧光染色

1. 设置

1. 典型的染色协议涉及以下步骤:
   1. 使用一系列分级乙醇对幻灯片上的组织部分进行重新保湿。
   2. 用阻塞缓冲液孵育组织部分，这将有助于阻断抗体与组织的非特异性结合，并减少背景荧光。
   3. 去除阻塞缓冲液，在原抗体中孵育该部分，此时抗体将结合其肽靶点。
   4. 去除原抗体，在洗涤缓冲液中广泛清洗各部分。
   5. 如果原抗体没有直接标记有荧光团，并且需要二级抗体，则用二级抗体孵育部分，以便与原抗体结合。
   6. 将次级抗体从滑轨上洗掉。
   7. 在安装介质中安装幻灯片，使其在荧光显微镜可视化之前干燥。
2. 需要以下物品:滑动支架（玻璃或塑料）、罐、移液器、纸笔、潮湿室、盖玻片以及带 DAPI 的安装介质。
3. 二甲苯用于幻灯片的补液。二甲苯是危险的，应与适当的PPE一起使用，包括手套和实验室外套。
4. 缓冲剂、溶液和试剂的配方
   1. 分级乙醇
      乙醇 - 160 mL 200 防艾图和 40mL ddH₂O
      乙醇 - 140 mL 200 防艾图和 60mL ddH₂O
   2. 抗原检索解决方案
      10 mM 柠酸钠，pH 6.0
   3. 阻塞缓冲区
      来自宿主动物的100μL血清，从中产生二级抗体
      900 μL 1X PBS
      注意:这是 10 个部分的卷;根据需要调整每个截面约 100 μL 缓冲液的音量。
   4. 洗涤缓冲液 （1X PBS）

2. 议定书

1. 用二甲苯和乙醇补液
   1. 将幻灯片放入滑架中，然后将幻灯片浸入 100% 二甲苯等构体溶液中，确保幻灯片完全覆盖解决方案。
   2. 在100%二甲苯等体中孵育幻灯片3分钟，重复两次，共孵育3次。在转移到新解决方案之前，请务必用纸巾擦拭滑架，以尽量减少污染。
      注意:建议在三个单独的容器中进行这些孵育。
   3. 在 100% EtOH 中孵育幻灯片 2 分钟，重复两次，共孵育 3 次。
      注意:建议在三个单独的容器中进行这些孵育。
   4. 在 95% EtOH 中孵育幻灯片 2 分钟。
   5. 在 80% EtOH 中孵育幻灯片 2 分钟。
   6. 在 70% EtOH 中孵育幻灯片 2 分钟。
   7. 在 1X PBS 中孵育幻灯片 5 分钟。
2. （可选）抗原检索，以揭开由原抗体识别的表位
   注1:此过程高度依赖于所使用的抗体，建议执行初始优化程序以确定抗原检索的要求。
   注2:此过程未在下面显示的 F4/80 染色下执行。抗原检索的要求应结合每个新的抗体进行优化。
   1. 将滑轨放在耐热塑料或玻璃滑片支架中，并确保机架充满滑轨，以确保均匀地分配热量。如果机架中的样本少于插槽，可以使用空白幻灯片。
   2. 将机架放入 1000 mL 的抗原解合溶液中，放入 2L 烧杯 - 10 mL 抗原解掩蔽液，至 990mL 水中。
   3. 微波炉高20分钟，确保幻灯片仍然覆盖水。
   4. 在烧杯中冷却幻灯片 20 分钟。
   5. 在包含 ddH₂O 的滑轨支架中清洗滑动机架，每次 5 分钟。每次使用新鲜的ddH₂O对总共3次单独的孵育重复两次。每次清洗时，滑块可以在同一滑架上清洗。
   6. 在 1X PBS 中孵育幻灯片 5 分钟。
3. 用纸笔圈截面。这将允许使用覆盖组织部分所需的最小缓冲液。不要让组织部分干燥。
4. 向每个部分添加阻塞缓冲区。覆盖截面所需的缓冲量会因截面的大小而异，但范围可能为25-500 μL。
   注意:阻塞缓冲液的选择可能因所使用的抗体而异。例如，来自引发二级抗体的宿主动物的10%血清可用于减少二次抗体的非特异性结合（例如，如果在山羊中升起二级抗体，可以使用正常的山羊血清）。应针对每种主要抗体优化阻塞缓冲液。使用F4/80染色乳腺肿瘤部分，0.1ml10%正常山羊血清在PBS中使用。
5. 在室温下在加湿室中孵育块缓冲液1小时，或4°C至24小时。加湿室确保各部分不干燥。
6. 将阻塞缓冲区从幻灯片上排出，将其清除。或者，可以使用移液器移除阻塞缓冲器，但注意不要用移液器尖端触摸该部分。
7. 稀释阻塞缓冲液中的原抗体。
   注意:需要为每个抗体和样品类型确定正确的稀释。优化将包括执行一系列稀释，以确定最佳染色。为了用F4/80染色乳腺肿瘤部分，组织部分在4°C下孵育过夜，在0.1 mL大鼠抗F4/80抗体中稀释1:100在PBS中1%的正常山羊血清中。
8. 将原抗体添加到每个部分，并在4°C的加湿室中孵育长达16小时（过夜）。在无原抗体的阻断缓冲液中至少留出一个部分作为对照，这将有助于识别二级抗体的非特异性结合。
9. 将滑片放入滑架并放入带 1x PBS 的滑块支架中，将原抗体排空或阻塞该部分，用 PBS 清洗部分。每次洗3次10分钟。
10. 稀释二级抗体1:200在阻断缓冲液。稀释可以根据二级抗体进行优化。
11. 将次级抗体添加到所有部分（包括对照部分），并在防光室中孵育1小时。
12. 将二级抗体排干，并在PBS中每次洗涤3次，每次10分钟。
13. 在幻灯片中添加 2-3 滴含有 DAPI 的安装介质，并在样品上放置一个盖玻片。如果安装介质不是快速干燥类型的介质，则可能需要使用熔化的石蜡或指甲油密封滑道边缘，以防止泄漏并长期维护样品。
14. 让幻灯片在黑暗中过夜干燥，并使用荧光显微镜对部分进行成像。

3. 数据分析和结果

1. 使用荧光显微镜分析染色部分。图像捕获和分析的具体细节将取决于显微镜的规格和用于执行分析的软件。通常，图像可以作为单色图像拍摄并重叠以生成多色图像。正细胞百分比可以通过计算正染色细胞的数量并除以一节中DAPI染色细胞的总数来量化。对于乳腺肿瘤部分的F4/80染色，使用软件Leica应用套件，版本3.8，在获取选项卡和图像叠加采集模式下，都启用了DAPI和RFP。对暴露、增益和伽玛进行了调整（DAPI 分别为 20.0 ms、1.0x 和 1.53，RFP 分别为 944.2 ms、1.0x 和 1.08），但实验因实验而异。"获取叠加"按钮用于创建 DAPI 和 RFP 曝光的叠加图像。
2. 下图（图1）显示了一个沾有F4/80的肿瘤部分的免疫荧光图像，该图像检测巨噬细胞和其他骨髓细胞上的抗原。该部分使用包含 DAPI 的安装介质安装，原子核以蓝色显示。

蛋白质在细胞中的功能在很大程度上取决于其在细胞内的正确定位。免疫荧光显微镜是一种使用荧光染料在细胞内观察蛋白质的方法。荧光染料是一种荧光团，即通过称为激发的过程吸收特定波长的光能，然后立即释放不同波长的能量（称为发射）的分子。

荧光染料与靶标特异性抗体偶联，并通过免疫染色引入培养的细胞或组织中。当该一抗与目标蛋白结合时，该蛋白会用荧光染料标记。或者，荧光染料可以与二抗而不是一抗偶联，二抗与蛋白质一抗复合物结合以标记靶标。之后，将样品密封在抗淬灭封固剂中以保留荧光标记，然后准备在荧光显微镜上成像。

荧光显微镜配备了强大的光源。光束首先通过激发滤光片，该滤光片只允许激发波长的光通过。然后，激发光到达一个专门的镜子，称为二向色镜或分束镜，该镜子旨在选择性地将激发波长反射到物镜上。然后，镜头将光线聚焦到样品中的一个小区域。到达样品后，光激发荧光团，然后荧光团发射不同波长的光能。该光通过物镜透射回二向色镜。由于发射波长与激发波长不同，因此二向色镜允许发射光通过。然后，它通过第二个滤光片，称为发射滤光片，该滤光片消除了可能存在的任何其他波长的光。之后，光线现在到达目镜或相机，在那里它们呈现由特定荧光团发射的光创建的放大图像。该图像表示目标蛋白质在细胞内的位置。

DNA 结合荧光染料通常与免疫染色一起使用，以标记细胞核作为细胞内的参考点。具有不同激发发射波长的多个不同荧光基团可用于同一样品中的不同蛋白质，以比较蛋白质的定位。

该视频演示了对组织样品中目标蛋白质进行免疫荧光染色，然后在荧光显微镜上对样品进行成像的程序。

在开始染色过程之前，在包埋过程中脱水的切片需要再水化。为此，首先，将载玻片放入载玻片架中，然后将载玻片完全浸没在 100% Xlene 异构体中。让玻片孵育 3 分钟。然后，从容器中取出载玻片，用纸巾擦去多余的二甲苯，然后将它们放入新容器中的新二甲苯浴中，再放置三分钟。每次在装有新鲜二甲苯的新容器中重复此孵育，并在转移到新容器之前用纸巾擦拭载玻片，总共孵育三次。接下来，在一系列分级乙醇溶液中孵育切片，从 100% 乙醇开始孵育 2 分钟。用纸巾擦去玻片架，然后将玻片转移到装有 100% 乙醇的新容器中再放置 2 分钟。继续洗涤循环，用纸巾擦拭过量的乙醇，然后按照指定的乙醇浓度在指定时间内将载玻片转移到新的浴中。最后一次乙醇洗涤后，抖掉多余的溶液，并将玻片在 1X PBS 中孵育 5 分钟。

要开始染色过程，首先，用 PAP 笔圈出切片，以确定缓冲液需要覆盖的最小区域。在载玻片上清楚地标记切片后，向每张载玻片中添加 100 微升封闭缓冲液，确保覆盖整个切片表面。用封闭缓冲液覆盖组织后，将载玻片放入加湿室中。将玻片在室温下孵育 1 小时。

按照所需的孵育时间，将封闭缓冲液从玻片上排出，将其排出，以去除封闭缓冲液。接下来，在封闭缓冲液中稀释一抗。对于 1：100 稀释液，将 990 μL 封闭缓冲液添加到 1.5 mL离心管中，然后在同一管中加入 10 μL 一抗。将一张载玻片标记为对照，然后添加 100 微升封闭缓冲液。该对照将有助于识别二抗的任何非特异性结合。现在，向剩余的玻片中加入 100 μL 一抗缓冲液。将切片在 4 摄氏度的加湿室中，在黑暗中孵育过夜。

过夜孵育后，从腔室中取出切片，并排出每张载玻片上的一抗和对照中的封闭缓冲液。将玻片放入玻片架中，然后在 1X PBS 中洗涤 3 次，每次 10 分钟。当玻片在 1X PBS 中洗涤时，在封闭缓冲液中稀释二抗。对于 1：200 稀释液，将 995 μL 封闭缓冲液加入 1.5 mL 试管中，然后将 5 μL 二抗加入同一试管中。将二抗添加到所有切片中，包括对照，并在避光的加湿室中孵育 1 小时。当计时器响起时，从培养箱中取出玻片。从切片上排出二抗。去除二抗后，将玻片放入玻片架中，然后将玻片完全浸入 1X PBS 中 10 分钟，避光保存。重复此洗涤 3 次，每次洗涤使用新鲜的 1X PBS。洗涤后，向每张载玻片中加入 2 到 3 滴含有 DAPI 的封固剂，并在样品上放置玻璃盖玻片。让载玻片在黑暗处干燥过夜，然后使用荧光镜对切片进行成像。

在成像过程中，图像捕获的细节将取决于可用的特定显微镜和软件。但是，在这个特定示例中，软件 Leica Application Suite，版本 3。8 用于执行分析。使用此程序，单击 Acquire 选项卡，然后在 Image Overlay Acquisition 模式下启用 DAPI 和 RFP。接下来，调整 DAPI 和 RFP 的曝光、增益和 Gamma，方法是使用软件定义的默认设置进行初始初始化，然后通过修改曝光时间和增益来优化亮度，请记住，需要最低限度的最佳设置以避免样品的图像饱和和光漂白。可以修改 Gamma 以优化图像的较暗区域。

调整设置后，按 Acquire Overlay 按钮创建 DAPI 和 RFP 曝光的叠加图像。该示例图像使用演示技术捕获，显示了用抗体 F4/80 染色的小鼠乳腺肿瘤切片，该抗体可检测巨噬细胞和其他髓系细胞上的抗原，以红色表示。由于使用了含 DAPI 的封固剂，细胞核显示为蓝色。成像数据将提供有关组织切片内蛋白质强度和定位的信息。

例如，在用 F4/80 染色的肿瘤图像中，观察到该抗原的细胞表面染色。这些数据还可以提供有关组织切片内特定细胞群频率的信息。这可以通过计算阳性染色细胞的数量（此处以红色显示）并将其与总细胞群（以蓝色显示）进行比较，并使用以下公式计算频率来量化。