免疫荧光显微技术：石蜡包埋组织切片的免疫荧光染色

1. 准备

1. 典型的染色流程包括以下步骤：
   1. 使用梯度乙醇对载玻片上的组织切片进行复水。
   2. 将组织切片与封闭缓冲液孵育，以阻断抗体与组织的非特异性结合，降低背景荧光。
   3. 去除封闭缓冲液，加入一抗孵育，使抗体与其靶向的肽段结合。
   4. 去除一抗，并用洗涤缓冲液对切片进行充分洗涤。
   5. 若一抗未直接标记荧光染料且需要使用二抗，则加入二抗孵育，使其与一抗结合。
   6. 洗去载玻片上的二抗。
   7. 将切片用含DAPI的封片剂封片，并在荧光显微镜观察前使其充分干燥。
2. 所需物品包括：载玻片架（玻璃或塑料）、玻璃瓶、移液器、疏水笔、湿盒、盖玻片以及含DAPI的封片剂。
3. 二甲苯用于载玻片的复水。二甲苯具有危害性，应在通风橱中使用，并佩戴适当个人防护装备（PPE），包括手套和实验服。
4. 缓冲液、溶液和试剂的配制方法
   1. 梯度乙醇
      乙醇 - 160 mL 200 proof EtOH 和 40 mL ddH₂O
      乙醇 - 140 mL 200 proof EtOH 和 60 mL ddH₂O
   2. 抗原修复液
      10 mM 柠檬酸钠，pH 6.0
   3. 封闭缓冲液
      100 µL 来自制备二抗所用宿主动物的血清
      900 µL 1X PBS
      注意： 此体积适用于10个组织切片；根据需要调整体积，每张切片约需100 µL缓冲液。
   4. 洗涤缓冲液（1X PBS）

2. 实验方案

1. 二甲苯和乙醇复水
   1. 将切片放入切片架中，然后将切片完全浸入100%二甲苯异构体溶液中，确保切片被溶液完全覆盖。
   2. 在100%二甲苯异构体中孵育切片3分钟。重复两次，共进行三次独立孵育。转移至新溶液前，务必用纸巾擦净切片架，以尽量减少污染。
      注意：建议在三个独立的容器中分别进行这些孵育步骤。
   3. 在100%乙醇（EtOH）中孵育切片2分钟。重复两次，共进行三次独立孵育。
      注意：建议在三个独立的容器中分别进行这些孵育步骤。
   4. 在95%乙醇（EtOH）中孵育切片2分钟。
   5. 在80%乙醇（EtOH）中孵育切片2分钟。
   6. 在70%乙醇（EtOH）中孵育切片2分钟。
   7. 在1×PBS中孵育切片5分钟。
2. （可选）抗原修复以暴露被一抗识别的表位
   注意1：该步骤高度依赖所使用的一抗，建议进行初步优化实验，以确定是否需要进行抗原修复。
   注意2：下文所示的F4/80染色未进行此步骤。每种新抗体均应优化抗原修复的必要性。
   1. 将切片放入耐热的塑料或玻璃切片架中，并确保切片架被填满，以保证受热均匀。若样本数量少于切片架槽位，可用空白切片填充。
   2. 将切片架放入盛有1000 mL抗原修复液的2 L烧杯中——每990 mL水中加入10 mL抗原修复液原液。
   3. 高火微波加热共20分钟，确保切片始终被水覆盖。
   4. 在烧杯中冷却切片20分钟。
   5. 将切片架在盛有ddH₂O的容器中清洗，每次5分钟。每次使用新鲜ddH₂O，重复两次，共进行三次独立清洗。每次清洗可在同一切片架中进行。
   6. 在1×PBS中孵育切片5分钟。
3. 用疏水笔圈出组织切片区域。这有助于使用最小体积的缓冲液覆盖组织切片。注意防止组织切片干燥。
4. 向每个切片区域加入封闭缓冲液。所需缓冲液体积取决于切片大小，通常为25–500 µL。应加入足够量的缓冲液，使其形成液滴并完全覆盖整个切片表面（包括边缘）。
   注意：封闭缓冲液的选择可能因所用抗体而异。例如，可使用与二抗宿主动物相同的10%血清，以减少二抗的非特异性结合（例如，若二抗来源于山羊，则可使用正常山羊血清）。每种一抗均应优化封闭缓冲液条件。在使用F4/80染色乳腺肿瘤切片时，使用了0.1 mL含10%正常山羊血清的PBS缓冲液。
5. 将切片置于湿盒中，在室温下孵育1小时，或在4°C孵育最长24小时。湿盒可防止切片干燥。
6. 通过倾倒方式去除封闭缓冲液。也可使用移液器吸除，但注意避免移液器枪头接触切片区域。
7. 用封闭缓冲液稀释一抗。
   注意：每种抗体和样本类型所需的最佳稀释度需单独确定。优化过程应包括一系列稀释梯度实验，以确定最佳染色效果。在使用F4/80染色乳腺肿瘤切片时，将0.1 mL大鼠抗F4/80抗体以1:100比例稀释于含1%正常山羊血清的PBS中，并在4°C孵育过夜。
8. 将一抗加入各切片区域，在湿盒中于4°C孵育最长16小时（过夜）。至少保留一个切片仅加入封闭缓冲液而不加一抗，作为对照，用于识别二抗的非特异性结合。
9. 倾去一抗或封闭缓冲液，将切片放入切片架并置于含1×PBS的切片盒中进行PBS洗涤。共洗涤3次，每次10分钟。
10. 用封闭缓冲液以1:200比例稀释二抗。可根据具体二抗进一步优化稀释比例。
11. 向所有切片（包括对照）加入二抗，在湿盒中避光孵育1小时。
12. 倾去二抗，用PBS洗涤3次，每次10分钟。
13. 向切片滴加2–3滴含DAPI的封片剂，并盖上盖玻片。若封片剂非快速干燥型，则可能需要用熔化的石蜡或指甲油密封切片边缘，以防止液体泄漏并长期保存样本。
14. 将切片在避光条件下过夜干燥，并使用荧光显微镜观察切片。

3. 数据分析与结果

1. 使用荧光显微镜分析染色切片。图像采集与分析的具体细节将取决于所用显微镜及其分析软件的规格。通常可先获取单色图像，再叠加生成多色图像。阳性细胞百分比可通过计数切片中阳性染色的细胞数量，并除以同一区域内DAPI染色的细胞总数来定量。对于乳腺肿瘤切片的F4/80染色，使用Leica Application Suite软件（版本3.8），在“Acquire”选项卡下的“Image Overlay”采集模式中，同时启用DAPI和RFP通道。曝光时间、增益和伽马值经过调整（DAPI分别为20.0 ms、1.0x和1.53；RFP分别为944.2 ms、1.0x和1.08），但这些参数在不同实验间可能有所变化。点击“Acquire Overlay”按钮生成DAPI与RFP曝光图像的叠加图。
2. 下图（图1）展示了一个经F4/80染色的肿瘤切片的免疫荧光图像示例，F4/80可检测巨噬细胞及其他髓系细胞表面的抗原。该切片使用含DAPI的封片介质封片，细胞核显示为蓝色。