プロテアーゼ活性を測定するためにプロテアーゼ蛍光検出キットの使用

このプロトコールは、インキュベーションバッファー、FXIカゼイン溶液、および目的のプロテアーゼを含むサンプルをマイクロ遠心チューブに加え、暗所で37°Cで60分間穏やかに混合してインキュベートすることから始まります。インキュベーション期間の終わりにタンパク質分解反応を停止するには、TCA溶液を穏やかに混合し、再び37°Cで暗所で30分間インキュベートします。このステップにより、非反応性基質が沈殿します。

サンプルを10分間遠心分離します。10, 000 Gsで、酸可溶性FXI標識フラグメントを含む上清を取り除きます。上清をアッセイバッファーで希釈した獣医またはマルチウェルプレートに移し、蛍光計でサンプルを読み取ります。

こんにちは、私はキャリーカップヴィンヤードで、ミズーリ州セントルイスにあるシグマオルドリッジデカルブ施設の科学者です。今日は、蛍光測定法によるプロテアーゼ活性測定の手順をお見せします。品質管理ラボでは、この手順を使用して、低いプロテアーゼ活性を測定しています。

では、インキュベーションバッファー、アッセイバッファー、および0.6の正常トリクロロ酢酸またはTCA溶液がすぐに使用できる溶液として提供されます。Cainとラベル付けされたファイトの溶液を少量に分注し、摂氏マイナス20度で保存します。琥珀色のバイアルを使用するか、透明なチューブをホイルアリで包んで、光から保護するようにしてください。

ファイトCain基質を引用すると、凍結融解サイクルの繰り返し、凍結融解サイクルの繰り返し、またはファイトCainの激しい振とうまたは混合の必要性が最小限に抑えられ、Cainからファイトが分離され、バックグラウンドが高くなる可能性があります。蛍光計を校正する場合、またはfit e信号の線形範囲を決定する場合は、fit制御溶液を準備します。アッセイバッファーで適切な濃度に再溶解することにより、溶液を新鮮にします。

準備ができたら、溶液を光から保護します。最後に、凍結乾燥トリプシンのバイアルに1ミリモル塩酸の100マイクロリットルを添加し、トリプシンが溶解していることを確認するために短時間混合することにより、トリプシンプロテアーゼ制御を調製します。トリプシンを酸性条件下で保存すると、その安定性が向上します。

Tripsin制御溶液は温度に敏感であり、低濃度では安定しないことに注意してください。次に、テストサンプルとコントロール、アッセイ全体のブランクを含むすべてのアッセイサンプルの調製を開始します。各テストサンプルのサンプルを光から保護してください。

マイクロ遠心チューブ、20マイクロリットルのインキュベーションバッファー、20マイクロリットルのフィットcキアン基質、および10マイクロリットルの試験サンプルに組み合わせます。透明なマイクロ遠心分離機は、サンプルが暗闇でインキュベートされている限り使用できます。また、プロテアーゼ活性が高い試験サンプルは希釈する必要があることにも注意してください。

トリプシンコントロールサンプルは、アッセイが検出限界を決定するために適切に実行しているポジティブコントロールとして使用され、トリプシンコントロールを準備し、1部の酸性化トリプシンを9部のインキュベーションバッファーまたはテストサンプルに使用されるバッファーに組み合わせてよく混合します。トリプシンの最終使用濃度はミリリットルあたり20マイクログラムです。異なる特異的プロテアーゼを使用する場合は、その特異的プロテアーゼと適切なバッファーを使用してコントロール溶液を調製します。

遠心チューブに20マイクロリットルのインキュベーションバッファー、20マイクロリットルのfzカイン基質、および10マイクロリットルのトリプシンコントロールを組み合わせて、コントロールサンプルを調製し続けます。各アッセイで5ナノグラムのトリプシンのコントロールサンプルを少なくとも1つ実行するか、段階希釈を使用することをお勧めします。最後のサンプルはブランクで、20マイクロリットルのインキュベーションバッファー、20マイクロリットルのフィッツケイン基質、および10マイクロリットルの超純水をマイクロ遠心チューブに組み合わせて調製します。

3種類のサンプルの準備ができたら、各チューブを穏やかに混合し、暗所で摂氏37度で60分間インキュベートします。過度の乱流は高い蛍光バックグラウンドを引き起こし、アッセイの感度を低下させる可能性があるため、激しく混合しすぎないように注意してください。感度を高めるために最大24時間インキュベートできますが、FXIカゼインが分解し始める可能性があるため、より長いインキュベーションはお勧めしません。

ここでも、インキュベーションが完了したときに高い蛍光バックグラウンドが得られるため、適切な保護装置を使用して、各マイクロ遠心チューブに150マイクロリットルのTCA溶液を追加します。TCAとインキュベートすると、チューブ内に存在する白い霞が観察されます。これは沈殿した未消化で不溶性のカイン混合物であり、穏やかに含み、暗所で摂氏37度で30分間インキュベートします。TCA溶液とのインキュベーションの終わりに、室温で10, 000Gsで10分間チューブを遠心分離します。

上清には、蛍光測定ピペットに使用される酸可溶性ファイト標識Cainフラグメントがチューブの上部から穏やかに含まれているため、ペレット中の沈殿物がピペットチップに引き込まれることはありません。これにより、チューブ内のTCA上清10マイクロリットルとアッセイバッファー1ミリリットルを組み合わせた蛍光計を使用してプロテアーゼ活性を測定するための次の蛍光検出中に偽陽性の読み出しが発生しますそして穏やかに混ぜます。さらに、1ミリリットルのアッセイバッファーに10マイクロリットルのFEを添加して、分析用のFE標準を希釈します。FEコントロールとTripsin標準試料は、サンプルがTCの溶液を超えてはならないという蛍光レベルを提供します。上清およびアッセイバッファーは、蛍光を測定する前に、摂氏2〜8度の暗所で最大24時間保存できます。

ベテを使用して測定する場合は、溶液の1ミリリットルを適切なベテトに移し、多数のサンプルを実行する場合は、96ウェルプレートと蛍光プレートリーダーを使用してフルオロメトリックデータを取得できます。このアッセイでは、フルオレセインイソチオシアネートが可能な機器キャリブレーションのコントロールとして提供されます。ここに示されているのは、説明した手順に従ったFS e信号の代表的な直線性範囲です。

このキットを最初のインキュベーションステップに30分のインキュベーション時間で使用すると、トリプシンおよびコントロールサンプルのこの典型的な標準曲線は1.5ナノグラムから25ナノグラムの範囲になります。蛍光測定は、マルチウェルプレートで行いました。アッセイの検出限界は、ブランクサンプルで得られた値を超える有意な蛍光測定値を生成するプロテアーゼの量です。

本日は、Sigma Aldridgeプロテアーゼ測定キットを使用して、生体サンプル中のFluorメトリックプロテアーゼ活性を検出する方法をお見せしました。このキットはお客様の用途に合わせて最適化されていますが、特定のプロテアーゼにはわずかな変更が必要な場合があることを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。