Name: 细菌细胞的电子Cryotomography (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 了解电子冷冻断层扫描技术用于细菌细胞超微结构成像的方法。该方案涵盖 plunge freezing 和高压冷冻样品制备流程，实现近天然状态下的高分辨率三维重建，为细胞生物学研究提供详细的实验指南。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院基金（R01 AI067548、R01 GM081520、R01 GM086200、R01 AI049194 和 P01 GM066521）对 GJJ 的资助，以及霍华德·休斯医学研究所、加州理工学院贝克曼研究所、戈登与贝蒂·摩尔基金会和阿戈龙研究所向加州理工学院提供的捐赠支持。MSL 由美国国立卫生研究院基金 2R37-A1041239-06A1（授予 Pamela S. Björkman）资助。Leica Microsystems 公司慷慨提供了冷冻切片收集过程的视频内容。代表性的密螺旋体 Primitia（Treponema primitia）实验结果由 Gavin E. Murphy 收集和处理，并发表于《分子微生物学》期刊，文章标题为“密螺旋体 Primitia 的新型超微结构及其对运动性的启示”（Murphy, G. 等, Mol. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008）。

一、细菌细胞培养物的制备
<ol>
 <li>在几毫升液体培养基中将细菌细胞培养至其正常生长所需的阶段。若需要更高浓度，可采用离心后重悬于新鲜培养基的方法，但需注意此过程有时会引发细胞结构的改变。</li>
 <li>在光学显微镜下检查，确保培养物无污染且细胞密度适当。</li>
 <li>某些细菌细胞可能粘附甚至在透射电镜（EM）载网上生长。当在载网上培养细胞时，通常使用镀有碳膜的金载网，以避免对细胞产生毒性。载网应先进行辉光放电处理2分钟，再在紫外线下灭菌15分钟，然后直接放入液体培养基中。粘附性细胞会自然粘附于载网上，而对于非粘附性细胞，可先用0.1%的多聚-L-赖氨酸包被载网，以促进其粘附。在冷冻前，应先在光学显微镜下检查载网，确保细胞浓度适宜。</li>
</ol>
II. 冷冻薄层细胞
对于较薄的细菌细胞，可将完整细胞悬液在透射电镜载网上进行浸入式冷冻。该过程可保存细菌细胞的超微结构，并防止后续电镜高真空环境中的水分蒸发。此操作既可使用自制的浸入式冷冻装置完成，也可如本文所示，采用商用自动浸入式冷冻仪 FEI Vitrobot MKIII4 来实现。
<ol>
 <li>对镀有碳膜的电镜载网进行2-4分钟的辉光放电处理。此步骤可使载网表面具有亲水性，从而有助于样品均匀地铺展在整个载网上。</li>
 <li>将100 μl胶体金溶液（粒径10 nm）与25 μl 5%浓度的BSA溶液混合。BSA可包覆在金颗粒表面，防止其发生聚集。</li>
 <li>将BSA与金颗粒的混合液在18000g条件下离心15分钟。去除上清后，将剩余的金颗粒沉淀与20 μl细胞溶液混合。经BSA处理的金颗粒不与细胞发生反应，但可作为重建断层图像所需的定位标记物（fiducial markers）。</li>
 <li>在Vitrobot中，于100%湿度条件下，将4 μl细胞与金颗粒混合液滴加至经辉光放电处理的电镜载网上。随后，使用1号滤纸从两侧自动进行滤纸吸除操作，以去除多余液体，仅保留一层含细胞培养基的薄层。接着，迅速将载网浸入由液氮冷却至约77 K的乙烷与丙烷混合液中。在此过程中，样品被极速冷冻，从而在厚度小于&lt; 1 μm的薄层中避免冰晶形成。</li>
 <li>小心地将载网从乙烷/丙烷混合液中取出，并迅速转移至盛放在液氮中的载网储存盒内。</li>
</ol>
III. 较厚细胞的高压冷冻与冷冻切片
对于较厚的细胞，高压冷冻可减少冰晶形成，随后进行的冷冻超薄切片能使样品足够薄，适用于透射电子显微镜成像。5, 6, 7 高压冷冻有多种不同的样品载具可供选择，具体选用取决于样品类型、所用冷冻设备的型号或选定的研究应用。本文中我们使用的是Leica Microsystems公司的Bal-Tec HPM 010高压冷冻仪以及UC6/FC6型冷冻超薄切片机。
<ol>
 <li>对于细菌，从 37°C 培养箱中直接取出光密度 OD &gt;0.5 的 15 ml 摇瓶培养物，以 1000 rpm 离心 3 分钟。去除上清液后，将剩余菌体沉淀与 0.5 ml 20% 右旋糖酐冷冻保护剂混合，再以 13000 rpm 离心 15 秒。</li>
 <li>去除上清液后，用移液器吸取 0.1 ml 超沉淀糊状物加入已装有 0.2 ml 20% 右旋糖酐冷冻保护剂（分子量 40000）的热封毛细移液管尖端中。将混合物在毛细管尖端内以 13000 rpm 离心 30 秒，然后去除上清液。在密封端可见一个 5–10 μl 的紧密沉淀。</li>
 <li>将已安装在高压冷冻仪冷台臂上的“聚四氟乙烯”涂层黄铜穹顶载片，接收糊状样品于其半球形凹面中，并用配套的平面黄铜帽盖紧密封。</li>
 <li>随后立即将该组件插入已预冷的高压冷冻仪中，准备进行冷冻。</li>
 <li>在 2100 bar 压力下，含有细胞的黄铜载片组件通过高压液氮射流迅速冷却；立即取出冷台臂组件并浸入液氮浴中，以防止载片升温。</li>
 <li>载片组件储存于液氮中，直至进行冷冻切片时取出使用。</li>
 <li>为暴露深冻的细胞穹顶以供切片，需在液氮环境中小心分离两个黄铜载片。</li>
 <li>理想冷冻状态的细胞穹顶呈透明玻璃样外观，无裂纹及冰晶成核裂隙。</li>
 <li>将此载片转移至预冷至 -170°C 的冷冻室中，并牢固安装于冷冻超薄切片机的卡盘夹具上。</li>
 <li>冷却的冷冻切片机内配备切片所需的关键工具，包括：低角度冷冻金刚石刀、金刚石修块工具、压平平台、载网储存盒、防静电喷雾装置以及载网固定装置。</li>
 <li>为成功获得连续切片带，首先使用金刚石修块工具将外周穹顶区域修整为 &lt;0.2 mm 的方形区域，同时保持约 200 μm 深度的良好冷冻边缘，并采用较快的切片速度。</li>
 <li>在将防静电喷雾对准低角度金刚石刀及邻近的铜支持载网的同时，小心推进金刚石刀至已完成抛光的样品块表面，准备切片。</li>
 <li>选择切片参数，如设定切片厚度为 50 至 350 nm，切削速度约为 0.4 mm/sec，并设置较窄的切削窗口。需控制防静电喷雾的范围与强度，以维持局部区域的低湿度环境。</li>
 <li>当开始产生切片时，用手或显微操作器操控一根细睫毛状转移工具，勾取从低角度金刚石刀刃滑落的初始切片。</li>
 <li>当切片带被推出刀面时，用睫毛探针轻柔支撑，并引导其跨越附近的铜支持载网。</li>
 <li>为使切片牢固附着，将负载切片带的载网用冷却的抛光银探针用力压平；部分切片静电较强，可借助最新的防静电设备辅助其粘附过程。</li>
 <li>载网盒长期储存于液氮冷却的干式运输罐中，直至电镜准备就绪再进行载网转移。</li>
</ol>
IV. 使用冷冻光镜观察细胞
可以使用冷冻光学显微镜（cryoLM）对载网上的细菌细胞进行成像。此处使用的显微镜为定制的尼康Ti E/B倒置显微镜，配备超长工作距离（ELWD）60倍空气物镜。成像过程中，载网置于冷冻载物台上，该载物台为经改装的FEI冷冻光学显微镜专用载物台。通过使用定位载网，可在载网方格中定位细胞，并将冷冻光学显微镜图像与冷冻电镜断层图进行关联。
<ol>
 <li>在冷冻电镜站上将载网装入样品盒。这些样品盒由我们用于FEI TF30H-polara的标准电镜样品盒定制改装而成，载网由铜制卡环固定。装好后，将样品盒置于液氮中的试管内，以备转移。</li>
 <li>将冷冻载台冷却至液氮温度（-190°C）。</li>
 <li>将样品盒装入冷冻载台，并将载网移至观察窗口。该载台最多可容纳两个定制改装的样品盒。</li>
 <li>降下聚光镜，并将60倍物镜聚焦到载网上。</li>
 <li>寻找细胞并采集图像。对于荧光显微镜（LM）与电镜（EM）关联研究，需在细胞所在区域周围扫描载网，以便后续在电镜中定位细胞。</li>
 <li>完成成像后，将样品盒重新放回试管中，并保持试管置于液氮中，直至准备进行电镜成像。</li>
</ol>
V. 在冷冻透射电镜中采集倾斜系列图像
为了获得细菌细胞的三维断层图像，需在冷冻透射电镜中对样品沿一个或两个轴逐步倾斜，同时采集一系列投影图像。根据倾斜角度及其他实验参数，已有多种不同的软件可用于自动采集倾斜系列图像。我们在 FEI TF30H-polara 冷冻透射电镜上使用 Leginon 软件，该软件可自动采集预先选定细胞的倾斜系列图像。8
<ol>
 <li>将样品盒装入预冷的冷冻站上的多选样品架（MSH）中。MSH 最多可容纳 6 个样品盒。</li>
 <li>将 MSH 连接到 TF30H-polara，选择一个样品盒并将其插入电镜镜筒中。</li>
 <li>在电镜计算机上启动 Leginon-client，并在另一台工作站上启动 Leginon 主程序。</li>
 <li>为 Leginon 会话设置预设参数（成像条件）。关键参数包括放大倍数、欠焦值、电子剂量以及倾转系列的角度设置，包括起始角度、终止角度和倾转增量。</li>
 <li>从最低放大倍数的图像开始选取目标区域，并将其发送至下一步更高倍数的成像阶段。</li>
 <li>将所有目标区域排队以进行倾转系列数据采集，并全部提交至最终的“断层扫描”步骤。</li>
 <li>可通过本地工作站的网络工具监控数据采集过程。</li>
 <li>实验数据采集完成后，将完成的倾转系列下载至本地工作站以进行重构。</li>
</ol>
六、生物安全注意事项
我们所处理的大多数生物样品均无致病性，来源于土壤、自来水或昆虫肠道。处理此类样品时，采用基本的无菌技术即可。而操作病原体则需要采取额外的安全措施；对于极高风险的情况，一些实验室已将整台冷冻电镜安装在生物安全三级（BSL-3）实验室中。以下是我们在实验室中降低病原体操作风险的一些方法。
<ol>
 <li>样本的致病性可通过化学或遗传方法减弱。许多进行病毒冷冻电镜研究的实验室在样品浸入冷冻前，已使用化学固定剂对其进行灭活。另一种替代方法是引入关键突变，使样品失去感染能力，例如在某些酶中引入失活点突变，或敲除受体。</li>
 <li>应穿戴个人防护装备，如手套、实验服和护目镜。</li>
 <li>可在生物安全柜（BSC）中操作具有危害性的样品。细菌培养物可在生物安全柜内培养、浓缩，甚至直接在电镜载网上进行浸入冷冻。我们配备了一台较小的手动浸入式冷冻装置，可放入BSC中使用。若需要自动冷冻装置所提供的更高一致性，可将此类设备置入BSC内；或者更简便地，在某些情况下，我们曾用铝箔包裹Vitrobot的吸水纸垫，以防止设备污染。在使用BSC时，所有进出柜体的工具和材料应尽可能使用70%乙醇进行消毒。制备载网时，我们仅使用少量细菌或病毒培养物（通常为4 µL），其中大部分液体被Whatman滤纸吸除。使用过的滤纸、移液器吸头以及剩余培养物均应作为生物危害废物处理。所有工具及暴露表面须依次用稀释漂白剂、95%乙醇和水进行消毒。</li>
 <li>载网冷冻后，在整个储存和数据采集过程中均需保持在液氮温度下。已有研究表明，某些细胞可在冷冻和解冻后仍存活，因此我们在储存和数据采集期间仍将其视为具有危害性的样品。数据采集结束后，含有冷冻载网的样品盒从冷冻透射电镜中取出，并直接浸入70%乙醇中。尽管极为罕见，但需注意有时载网可能在镜筒内“脱落”，对此类事件的后果应针对每种危害性样品进行评估。显微镜大部分区域处于室温，因此脱落载网上的样品可能在镜筒内解冻，并在电镜的超高真空中完全干燥。这显然会使某些生物样品失活，但可能无法完全灭活结构稳定的病毒，且干燥后的样品残留物可能在下次打开镜筒进行维护时以气溶胶形式释放。</li>
</ol>
VII. 断层图像重建
细菌细胞的断层图像通过软件进行重构。目前有多种软件可用于此项工作。我们使用 Raptor 进行自动重构及断层图筛选9。由于自动倾转系列图像的对齐及后续重构是一项复杂任务，Raptor 目前尚无法达到 100% 的成功率。在 Raptor 重构失败或需要高质量重构的情况下，我们采用 IMOD 断层成像软件包中的 eTomo 进行手动图像对齐和重构10, 11。
<ol>
 <li>从本地 Leginon 网络服务器下载每个独立的倾斜系列图像，并将它们保存在一个易于查找的目录中。</li>
 <li>使用 IMOD 的 3dmod 查看器手动检查倾斜系列图像，若 Leginon 未能成功追踪目标或生成有效的倾斜系列，则将其剔除。</li>
 <li>我们通过 Peach（一种基于 Perl 的网络任务分发系统）在实验室的 Linux 机器上分布式运行 Raptor。在命令行中指定标记物尺寸（即胶体金颗粒）、用于重建的标记物数量、像素尺寸、期望的重建厚度、二倍下采样因子以及一系列基本设置（如输入/输出路径和输出格式），然后启动运行；通常对于一个包含 122 张图像（2k × 2k）的数据集，耗时约为 20 分钟至 2 小时。如果对重建结果满意，本节后续步骤可跳过。</li>
 <li>当需要手动重建时，将文件扩展名从 ".mrc" 重命名为 ".st"，然后将各个倾斜系列加载到 IMOD 断层重建套件中的 eTomo 图形用户界面（GUI）中。</li>
 <li>设定倾斜系列的旋转轴类型（单轴或双轴），并输入样品制备中使用的标记物尺寸。扫描文件头以确定像素尺寸，然后点击“Create Com scripts”继续。</li>
 <li>按照 eTomo 图形界面中每个标签页的步骤，从倾斜系列重建断层图像。每完成一步后检查并验证结果；若不满意，可随时返回任意先前步骤重新处理。“预处理”用于执行初步处理，并去除由 X 射线引起的异常高亮度像素。“粗略对齐”通过互相关方法，使倾斜系列中每一张后续投影图像相对于前一张进行对齐。在“标记模型生成”中定义使用哪些金颗粒作为标记物，程序将追踪每张投影图像中的标记物，并建立“精细对齐”。“断层图定位”允许在 Z 方向上裁剪断层图像。“最终对齐堆栈”通过线性插值生成，可选择性地应用 CTF 校正、去金颗粒（Gold-Eraser）和二维滤波等功能。“生成断层图”通过傅里叶空间中的加权反投影计算断层图像。“后处理”可用于将断层图像裁剪至感兴趣的 XY 区域，并调节对比度以突出目标结构的显示范围，“清理”步骤则删除中间文件以释放磁盘空间。</li>
</ol>
八、断层图像的数据库存储
我们使用基于网络的内部数据库来组织、存储、检索和分发断层扫描数据。对于每个倾斜系列，我们可以记录样品详情、显微镜采集参数、原始倾斜系列数据以及相关的三维重构结果和其他处理文件。主浏览页面为每个断层图提供缩略图和类似“YouTube”的特色视频，条目可按下载频率、创建者、样本类型或日期进行排序。用户可通过输入关键词或特定特征来搜索数据库。目前，数据库中已存入超过 4,500 个断层扫描倾斜系列，涵盖近 60 种物种/样本类型，相关文件总数超过 11,000 个。
IX. 断层图像的分析与分割
<ol>
 <li>可通过带有图像处理工具的不同软件查看和分析断层图像的结构细节，例如使用 IMOD 中的 3dmod 查看器及其 ZAP、XYZ 和 Slicer 窗口。</li>
 <li>下一步是对三维图像（断层图像）进行分割。分割过程为三维图像中的每个体素（体积像素）分配一个标签，用以描述该体素所属的区域或物质，例如膜结构或细胞骨架。我们使用的软件工具包括 IMOD 中的 3dmod 和 Amira（Visage Imaging）。</li>
 <li>尽管一些软件工具提供自动分割模块（例如阈值分割），但它们通常仅适用于高对比度的图像。由低剂量电子冷冻断层扫描获得的三维图像对比度极低，因此在大多数情况下，我们必须手动为每个体素分配标签。</li>
 <li>分割结果存储在独立的数据文件中，可用于生成表面模型，其中每个区域以不同颜色显示，并可在三维中进行可视化。</li>
 <li>断层图像还可用于其他分析。例如，模板匹配及后续计算可获得核糖体等大分子复合物的统计信息；子体积对齐与平均化则能提高对比度，揭示更精细的结构细节。</li>
</ol>
X. 基于断层图像制作动画
我们制作影片以总结每个项目，并对我们的断层扫描图像进行直观展示。
<ol>
 <li>编写脚本，明确需要在数据中展示的特征以及这些特征的呈现方式。例如，在典型的全细胞断层成像项目的影片中，我们首先展示一组代表性的倾斜系列数据，随后逐层显示重建后的断层图像。接着，展示细胞内关键大分子复合物的分割结果，例如鞭毛马达、趋化受体复合物或胞质丝状结构。最后，以一个理想化模型作为结尾，展示对所研究大分子结构的解释性构象。</li>
 <li>使用Amira或Chimera等图形可视化软件，对影片中的各个静态画面进行渲染。通常，我们会将影片拆分为较短的片段进行制作，以便于对每个片段进行独立修改。</li>
 <li>使用Adobe Premiere等商业视频编辑软件，将静态图像合成为视频片段，并进一步将各视频片段整合为最终的完整影片。</li>
 <li>我们已开始为影片添加配音解说轨道。该解说起到“影片图注”的作用，使观众在观看影片的同时，能够专注于所展示的数据内容。</li>
</ol>
十一、动画
视觉叙事无需依赖特定科学领域的复杂术语即可传递知识。当抽象概念辅以视觉演示时，便变得易于理解。用卡通形式图解生物学概念的做法由来已久，但直到最近十年，专业的 3D 内容创作工具才被广泛应用于科学动画的制作。目前已有数十位研究人员致力于将生物系统转化为动态的 3D 动画。许多精美的动画作品可在 <a href="http://MolecularMovies.org">http://MolecularMovies.org</a> 上浏览。该网站还提供教程，并免费发布一套用于在 Autodesk Maya 中操作分子结构的工具包。开源的 3D 内容套件 Blender 也包含多个由用户开发的 PDB 文件导入插件。
制作三维动画的过程通常包括三个步骤：
<ol>
 <li>建模：我们使用图形表示软件将表面导出为可导入 Maya 的格式。这些表面要么是来自重构断层图的分割结果，例如膜、颗粒或丝状结构，要么是分子表面的表示。断层图的分割在 Amira 中完成；分子表面在 Chimera 或 VMD 中生成。分子的原子级表示可通过 PDB 文件直接导入 Maya。模型导入 Maya 后，可根据需要进行修改、复制和定位。</li>
 <li>动画制作：传统上，动画通过手工构建，艺术家需手动移动物体并记录一系列关键帧。当前三维图形软件的新进展允许通过内置模块和脚本 API 以程序化方式生成动态效果。</li>
 <li>渲染：程序化动态可生成对动态生物过程（如结构自组装）具有说服力的动画。然而，由于真实模拟生物系统存在困难，大多数三维动画仍采用传统关键帧技术构建。在动态设置完成后，可添加视觉注释、纹理和光照效果。最后，确定摄像机路径，并将完成的动画渲染为视频。</li>
</ol>

<ol><li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Li, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography%3A+a+new+view+into+microbial+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+biological+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of biological complexity.</a> J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).</li>
<li>Iancu, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protocols. 1, 2813-2819 (2007).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285-294 (2001).</li>
<li>Ladinsky, M. S., Pierson, J., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+cryosectioning+of+cells%2C+facilitated+by+a+micromanipulator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Vitreous cryosectioning of cells, facilitated by a micromanipulator.</a> J. Microsc. 224, 129-134 (2006).</li>
<li>Pierson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography%3A+Electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> J. Struct. Biol. 169, (2009).</li>
<li>Suloway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167, 11-18 (2009).</li>
<li>Fernando, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+tomography%3A+an+approach+with+alignment+methods+that+preserve+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution.</a> J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本视频文章展示了如何对细菌细胞进行电子断层扫描（ECT）。由于篇幅和时间限制，本文仅介绍通用实验方案。更多详细信息可参考相关研究论文、设备制造商和软件开发者提供的在线资料或其他信息，以及ECT研究团队发布的资源。根据所研究的细菌种类、所使用的设备以及对细胞结构的关注重点不同，实验方案和参数需要经过测试和优化。

<table><tbody><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>0.1% 溶液</td></tr><tr><td>MKIII Vitrobot</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶体金溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1527-25ml</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Invitrogen</td><td>P2489</td><td>10%</td></tr><tr><td>Nr 1 滤纸</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001 055</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31389</td><td>15-25%，分子量 39000</td></tr><tr><td>黄铜圆头压片</td><td>Swiss Precision Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal-Tec HPm 010 高压冷冻仪</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo-ultra 超薄切片机 UC6/FC6</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>45° 金刚石冷冻修块刀</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Static line II 离子发生器</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CX100 干式液氮运输罐</td><td>Taylor-Wharton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSH 上样站</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti E/B 倒置显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>冷冻荧光显微镜载台</td><td>FEI</td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>TF30-polara</td><td>FEI</td><td></td><td>配备 Gatan 的 UltraCam</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

细菌细胞的电子冷冻断层扫描技术

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

尽管目前对细菌细胞的基本代谢已有较多了解，但仍有许多基本问题尚未得到解答，例如细菌如何产生并维持特定的细胞形态、建立细胞极性、分离基因组以及进行分裂。要理解这些现象，需要借助能够填补荧光光学显微镜与X射线晶体学、核磁共振波谱等高分辨率技术之间分辨率差距的成像技术。
电子冷冻断层扫描技术（ECT）正是一种能够实现上述目标的新兴技术，它可以在接近天然的状态下，以三维（3D）形式、“大分子”级分辨率（约4 nm）对细胞的超微结构进行可视化。1, 2 在 ECT 中，细胞以玻璃态、“冷冻水合”状态在低温（&lt; -180°C）下通过冷冻透射电子显微镜（cryoTEM）成像。对于较细长的细胞（厚度可达约500 nm3），可将完整细胞在乙烷或乙烷/丙烷混合物等冷冻介质中快速浸没冷冻，并置于电镜载网上。较厚的细胞和生物膜也可通过先进行“高压冷冻”，再进行“冷冻切片”，从而以玻璃态进行成像。随后，在样品沿一个或两个轴逐步倾斜的过程中，采集一系列二维投影图像，进而可由这些图像计算重建出三维结构，即“断层图”（tomogram）。尽管 ECT 需要昂贵的仪器设备，但近年来已在少数实验室中被用于揭示多种外部附属结构、不同类型细胞包膜的结构、细胞骨架丝的定位与构象，以及诸如鞭毛马达、细胞内区室和化学感受器阵列等大型大分子复合物的位置与架构。1, 2
在本视频文章中，我们展示了如何使用电子计算机断层扫描（ECT）对细胞进行成像，包括样品制备、数据采集、断层图重建，以及通过分割技术对结果进行解释，在某些情况下还结合了光学显微镜的相关分析。

本文展示了如何利用电子冷冻断层扫描技术（ECT）在接近天然的状态下研究细菌细胞的超微结构，分辨率可达“大分子”级别（约4 nm）。

尽管关于细菌细胞基本代谢的研究已有诸多成果，但仍有许多基础性问题尚未得到解答，包括……

在本视频中，通过电子冷冻断层扫描技术获得了接近天然状态的细菌细胞在分子分辨率下的三维图像。该过程首先将完整的细胞进行浸入式冷冻，或 alternatively 采用高压冷冻并对细胞沉淀物进行冷冻切片。随后获取一系列 M 投影图像，并用于生成三维重建图像，即 Tom Graham，再对重建图像进行分割及进一步的计算分析。大家好，我是来自加州理工学院生物系的Grant Jensen，这位是组织我们本次演示的Sonya Chen。今天我们将向大家展示如何对细菌细胞进行冷冻电子断层扫描。通常情况下，整个实验流程由单个研究人员独立完成，但由于我们的实验方案是在团队协作和经验共享的基础上发展而来的，因此我们会将目前在实验室工作的所有成员都包括进来。除了视频中的索尼娅和我之外，您还将看到梅根·多布罗、阿里安娜、布里、米格尔、阿利斯泰尔·麦克道尔、马克·罗丁斯基和珍。其他实验室成员制作了计算机屏幕截图，并协助准备了随附的书面实验方案，包括摩根·贝贝、马丁·皮勒、简·丁、乔·李、卢·甘、阿莉扎·托娃和迪伦·莫里斯。阿里安娜将首先为您演示我们如何对细菌细胞进行液氮冷冻。对于较薄的细菌细胞，可将完整细胞的悬液在透射电镜载网（EM grid）上进行快速冷冻。此处以商用自动冷冻仪为例进行演示：首先检查细菌培养物，确保无污染且处于适当的汇合度或浓度；随后将碳膜覆盖的电镜载网进行辉光放电处理2至4分钟。接下来，将100微升胶体金溶液与25微升5% BSA溶液混合。将混合物在18,000 G条件下离心15分钟。离心后，弃去上清液，重悬金颗粒沉淀。取20微升细胞溶液，将透射电镜载网置于Vitra bot中，在100%湿度条件下孵育。然后将四微升（4 µL）细胞混合液滴加至经辉光放电处理的电镜载网上。用滤纸自动从两侧轻轻吸去多余液体，随后迅速将载网浸入由液氮冷却的乙烷与丙烷混合液中进行冷冻。小心地将载网从乙烷-丙烷混合液中取出，并迅速转移至置于液氮中的载网储存盒内。对于较厚的细胞样品，高压冷冻可防止冰晶形成。随后进行冷冻切片，使样品足够薄以用于电镜观察。成像开始时，将15毫升细胞以1000转/分钟离心3分钟。离心后，弃去上清液，取0.5毫升剩余的菌体沉淀，与0.5毫升20%蔗糖冷冻保护剂混合。然后以13,000 RPM离心15秒。细胞沉淀后，用移液器吸取0.1毫升上清沉淀物糊状液，转移至已含有0.2毫升20%右旋糖酐冷冻保护剂的封口微量移液器吸头中，随后在微量移液器吸头中以13,000 RPM离心30秒。离心后，弃去上清液。在封口末端可见一个5至10微升的紧密沉淀。将沉淀转移至已安装在高压冷冻机样品架臂上的聚四氟乙烯涂层黄铜凹面圆片的一侧半球中，然后用其配对的平头黄铜帽进行密封。然后迅速将臂组件插入已预冷的高压冷冻仪中。在2100巴压力下，含有细胞的组合式黄铜载样单元通过高压液氮射流被快速冷却。细胞冷却后，迅速取出臂组件并立即浸入液氮浴中，以防止载样盘温度上升。接下来，将载样座转移至预冷的冷冻切片机夹具中，该夹具为类似台钳的装置，已牢固安装在冷冻切片机腔室内，以暴露已完全冻结的细胞圆顶状结构用于切片。在液氮环境中小心地将两片黄铜载样座分开。理想冻结的细胞圆顶应呈玻璃样外观，无裂纹及冰晶成核裂隙。使用冷冻切片机，借助金刚石修块工具，以快速切片速度将外层穹顶区域修整至小于0.2平方毫米，并保留约200微米的深度，同时将抗静电喷雾对准低角度刀片和铜支持载网。在靠近样品的位置，以约0.4毫米/秒的切割速度和窄切割窗口，小心地推进金刚石刀至抛光的包埋块表面。开始切取50至350纳米厚的切片。使用精细的睫毛刷工具勾取初始切片，使其从低角度金刚石刀刃上滑落，并将切片带转移至铜网支撑架上进行支撑和引导。网格加载完毕后，使用冷却的抛光银探针用力压紧切片带。将网格置于网格盒中，并存放在液氮冷却的干式运输罐内，直至显微镜准备就绪。可使用冷冻光学显微镜对载网上的细菌细胞进行成像。此处将使用一台定制的尼康倒置显微镜TIB，配备经改装的FEI冷冻载台。在冷冻工作站上将载网装入样品盒中，并用铜制夹环固定，随后将样品盒放入盛有液氮的试管中以进行转移。将最多两个 cartridge 装入预冷的冷冻载台，并将载网移至观察窗口。然后降低聚光镜，并将物镜聚焦到载网上。找到细胞并采集图像。用于相关联的光镜与电镜研究。在细胞区域周围扫描载网，以便后续在电镜中定位细胞。成像后，将载网放回卡盒并插入管中，将管子置于液氮中保存，直至进行电镜成像，以获得细菌细胞的三维断层成像（3D TOM）。在样品沿一个或两个轴逐步倾斜的同时，采集一系列投影图像。此处以 LEGON 配备的冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）TF30 Polar 为例进行演示：在冷冻站上将最多六个样品盒装入多选样品 holder 中，然后将其连接至 TF30 Polar，选择其中一个样品盒并插入电镜镜筒。在电镜计算机的客户端软件中启动 LEGEND 程序。输入会话图例的图像条件。从最低放大倍数的图像开始选择目标区域，并将其发送到下一个更高放大倍数的步骤。然后将所有目标区域排队，用于倾斜系列数据的采集，并将它们全部提交至最终的断层成像步骤。获取一系列图像。在冷冻透射电镜中，样品将沿一个或两个轴逐步倾斜。实验完成后，将完整的倾斜系列图像下载到本地工作站以进行重构。使用专用软件计算细菌细胞的断层图像。可使用程序 Raptor 自动重建断层图像，也可使用 eTomo 进行半自动重建。使用 IMOD 的 3Dmod 查看器检查倾转系列图像，并剔除因追踪或其他错误而难以产生有效结果的图像。使用基本设置，在实验室的 Linux 机器上分布式运行 Tommo Raptor 效果良好。生成断层图像所需时间为 20 分钟至两小时，具体取决于文件大小。当 Raptor 运行失败或研究者希望确保重建结果达到最优时，可使用 EMO 手动仔细对齐图像。按照 e tomo 图形用户界面中每个选项卡的步骤，从倾斜系列图像中重建 Tom Graham 的断层图像。我们使用基于网络的内部数据库来组织、存储、检索和分发断层扫描数据。主浏览页面展示缩略图以及类似 YouTube 的特色视频。对于每个断层扫描（tomo）中的格雷厄姆（Graham），在获取断层成像后的格雷厄姆样本后，可对各个特征进行分割，以帮助可视化其形态。三维分割是指将三维图像中的每个体素分配给特定区域或材料的过程。此处使用镜像软件生成表面模型，其中每个区域以不同颜色显示，并可在断层扫描的三维视频和动画中进行观察。可通过图表对项目进行总结，并利用三维图形展示研究结果。可使用 Amira 或 Kymera 等软件对视频和商业动画的单帧图像进行渲染。可以使用 Adobe Premiere 等视频编辑软件对商业视频进行编辑。Maya 用于生成动画，它可导入 Amira 构建的表面，制作关键帧，并渲染成视频。此处展示了螺旋体密螺旋体 Promesa（Spiro Treponema Promesa）的完整细胞数据的代表性倾斜系列图像，随后是重建后的断层图（Tom Agram）逐层切片视图。对 T. Promesa 细胞的分割揭示了其外膜、内膜以及表面结构，包括表面凹坑和表面钩状拱形结构。该细菌具有鞭毛和杆状马达、周质锥形结构以及菌毛。该机械模型展示了螺旋体密螺旋体属 Promesa 的运动方式：内层圆柱或核心被外层鞘包裹。鞭毛在内层圆柱与外层鞘之间像油漆滚筒一样运动。当鞭毛旋转时，内层圆柱在外层鞘内反向旋转。在非黏性环境中，细胞会无用地旋转；但在黏性环境中（例如T Promesa在自然界中所处的环境），外部的纤维或其他物体可阻碍外鞘的旋转，从而加速内层圆柱体的转动，并为细胞提供可推动的介质，使其在向前钻进时有所依托。图中所示为通过光学显微镜观察到的真实T promeus细胞。我们刚刚向您展示了如何对细菌细胞进行电子冷冻断层扫描。当然，我们意识到这类工作需要大量的投入。冷冻电子显微镜和荧光显微镜都是复杂且昂贵的设备，必须得到妥善的引用。例如，该房间的地基是一块厚度达数英尺的机械隔离混凝土板，放置在经过特殊压实的地面上。空调系统同样经过定制设计，采用大尺寸风管和缓和的弯道，以维持恒定温度，同时避免产生气流或湍流。您所看到的窗帘用于降低声学噪声。最后，我们验证该房间不存在干扰性的电磁场。尽管我们向您展示的显微镜操作如今已基本实现自动化，但问题仍时常出现，需要专家进行诊断。尽管如此，我们希望观看本视频能帮助您更好地理解此类工作所涉及的操作流程与仪器使用。感谢您的关注。

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细菌细胞的电子Cryotomography

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利用冷冻电子断层扫描技术观察处于冷冻水合状态神经突的原代神经元制备

我们介绍了一种收集和处理完整线粒体冷冻电子断层成像图的方法。该技术可提供关于天然生物膜中大型膜蛋白复合物的结构、功能和组织的详细信息。...

通过电子冷冻断层扫描技术可视化线粒体中的ATP合酶二聚体

我们介绍了一种利用高通量冷冻电子断层扫描技术测定高分辨率结构的实验方案 原位...

使用 Tomoauto：高通量自动化冷冻电子断层成像实验方案

本方案描述了如何可视化蓝细菌中瞬时的DNA压缩过程。采用同步培养、荧光显微镜监测、快速冷冻以及高压冷冻电子断层扫描技术。本文介绍了这些方法的操作流程，并讨论了其未来的应用与发展方向。...

利用高压冷冻电镜断层扫描技术观察蓝细菌中的DNA压缩现象

细菌细胞成像是一种新兴的系统生物学方法，旨在解析调控大型大分子机器功能的静态与动态过程。本文通过整合定量活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术，用于研究Legionella pneumophila...

应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统

我们提出了一种用于大分子高分辨率结构研究的冷冻生物样品冷冻聚焦离子束微加工薄片制备方案 原位 使用冷冻电子断层扫描技术。本方案提供了制备高质量、高重复性薄片的指南，用于对细胞内大分子的结构进行表征 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）.

样品制备与冷冻聚焦离子束微加工 酿酒酵母 用于冷冻电子断层扫描

本实验方案的目的是引导细胞在冷冻电子显微镜用载网上特定区域进行黏附和生长。该目标通过以下步骤实现：首先涂覆抗污染层，然后按照用户指定的图案进行消融，接着在图案化区域沉积细胞外基质蛋白，最后接种细胞。...

微图案化透射电子显微镜载网以在全细胞冷冻电子断层成像工作流程中引导细胞定位

本实验方案描述了使用 Tomo5 进行高分辨率冷冻电子断层扫描远程数据采集，以及使用 emClarity 进行后续数据处理和子断层平均化的方法。以脱铁铁蛋白为例，详细展示了获得分辨率为 2.86 Å...

冷冻电子断层扫描远程数据采集与亚断层图像平均法

冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术提供了一种无需包埋、切片或其他侵入性制备步骤即可观察完整细胞中细胞器的方法。目前该技术获得的三维分辨率可达数纳米，视场范围为数微米，可观察样品厚度约为 1...

细胞器的可视化 原位 通过冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术

本方案通过整合高压冷冻（HPF）与华夫格法、低温聚焦离子束（cryo-FIB）拾取技术以及剂量对称平行采集，实现了厚组织样品冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的标准化，可获得均一厚度的薄片和玻璃化样品，从而实现可重复的 原位...

厚组织冷冻电子断层成像工作流程在小鼠海马体中的应用

了解电子冷冻断层扫描技术用于细菌细胞超微结构成像的方法。该方案涵盖 plunge freezing 和高压冷冻样品制备流程，实现近天然状态下的高分辨率三维重建，为细胞生物学研究提供详细的实验指南。

细菌细胞的电子冷冻断层扫描技术

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