昆虫腿部样本的荧光显微镜制备方法：一种用于成像的神经肌肉结构保存技术

- 至 开始， 浸没 麻醉的 昆虫 在 70% 乙醇 溶液 到 减少 的 疏水性 的 的 角质层 然后， 洗涤 和 透化 的 组织 与 磷酸盐缓冲 生理盐水 含有 a 去垢剂 用于 在 最少 30 分钟 到 允许 组织 穿透 在……期间 固定

接下来， 移除 的 头部 和 腹部 从 的 胸部 使用 镊子 到 应用 轻柔的 压力 到 的 髋-胸 连接 和 分离 的 腿 仔细地 位置 的 腿 在 冰冷的 4% 多聚甲醛 溶液 过夜 到 允许 它 到 穿透 的 组织 多聚甲醛 固定剂 组织 由 交联 蛋白质

然后， 移除 的 固定 溶液 和 洗涤 的 组织 若干 次 与 磷酸盐缓冲 生理盐水 含有 去垢剂 之前 封片， 位置 的 腿 在纯的 或 轻微地 稀释的 封片 缓冲液 用于 在 最少 一 天 到 提供 足够 时间 用于 的 缓冲液 到 进入 的 组织

最后， 安装 的 腿 在 a 滴加 的 封片 培养基 使用 a 间隔序列 之间 的 显微镜 载玻片 和 的 盖玻片 至 防止 的 样本 从 损伤， 和 固定 的 安装 与 指甲 抛光。

在 下 列 示例中，我 将 展 示 果 蝇 的 腿 的 Drosophila melanogaster 的解剖、固定与封片过程。

- 开始 由 填充 的 适当的 数量 的 孔 在 a 玻璃 多孔板 平板 与 70% 乙醇 使用 a 刷子 至 添加 15 至 20 碳 二氧化物 麻醉的 果蝇 的 任何 年龄 或 性别 到 每个 嗯， 和 轻柔地 dab 的 果蝇 进入 的 乙醇 直到 他们 是 完全 浸没

之后 无 更多 比 一 分钟 冲洗 的 果蝇 三 次数 与 0.3% 非离子型 表面活性剂 去垢剂 溶液 在 磷酸盐缓冲 生理盐水 用于 在 最少 10 分钟 每 洗涤。 之后 的 最后 洗涤 使用 镊子 到 移除 的 头部 和 腹部 的 每个 果蝇 无 损伤的 的 胸部的 片段 或 的 腿 和 使用 的 尖端 的 a 配对 的 精细 镊子 到 轻柔地 但 牢固地 应用 压力 到 的 髋-胸 连接 到 解离 一 腿 从 的 胸部的 片段

将 腿 放入 一个 新 多孔板 的 一 孔 中， 加入 新鲜 配制 的 4% 多聚甲醛 ， 置于 冰 上， 在 4 摄氏度 下 过夜 固定。

- 它 是 重要 至 推 的 腿 轻柔地 进入 的 固定 缓冲液 无 让 它们 漂浮 至 获得 固定良好 腿

- 该 下一步 天 洗涤 的 腿 五 次 在 新鲜的 0.3% 非离子型 表面活性剂 去垢剂 溶液 用于 20 分钟 每 洗涤。 之后 的 最后 洗涤， 替换 的 去垢剂 与 封片 培养基 和 保持 的 腿 在 的 封片 培养基 用于 在 最少 24 小时

的 下一步 天 添加 大约 20 微升 的 70% 甘油 下一步 到 的 包被 结束 的 的 玻璃 显微镜 载玻片 和 盖子 的 甘油 与 a 22 由 22 毫米 盖玻片 接下来， 添加 在 关于 10微升 线 的 封片 培养基 至 的 右侧 的 的 盖玻片 和 应用 a 第二 30微升 线 的 封片 培养基 至 的 右侧 的 的 10微升 线。

使用 精细 镊子 转移 一 腿 从 的 多孔板 培养皿 在 a 滴 的 培养基 到 的 10微升 条带 的 封片 培养基 在 一个 外部 侧面 上 或 向下 取向 重复 直到 六 到 八 腿 有 已经 安装 和 对齐的 和 位置 a 第二 盖玻片 结束 的 腿 如此 那 的 第二 盖玻片 静止 轻微地 在 的 第一 盖玻片 然后， 使用 指甲 抛光 在 每个 角落 的 的 盖玻片 至 固定 它们 在 位置。