去除果蝇肌肉组织

该程序的总体目标是从果蝇幼虫中去除肌肉组织，以准备对幼虫树突树枝化或 da 神经元和表皮组织进行免疫荧光分析。今天，我们将演示一种方法，该方法可以提高参与树突形态发生的神经元和神经元外因子的可视化。该技术的主要优点是它允许对蛋白质进行免疫荧光成像，否则这些蛋白质会被肌肉组织掩盖，提高信噪比，并支持使用超分辨率显微镜。

首先，在硅胶弹性体培养皿中加入足够的冷盐水以覆盖底面。将实验幼虫加入培养皿中，并将其置于立体显微镜下。确保光线的正确放置。

将幼虫腹侧朝上放置，这可以通过腹部齿带来识别。将幼虫向前后方向拉伸，并使用昆虫针将头部和尾部固定在培养皿的底部。用一把细剪刀，沿着幼虫的腹侧中线从一端到另一端剪开。

将幼虫张开，将角质层组织固定在四个角上，使其平躺。使用镊子切除内部器官，包括 CNS、肠道和气管。调整昆虫针，使菲力鱼片被示教，但不要最大限度地拉伸。

找到幼虫的背中线，那里没有肌肉组织，然后将镊子叉放在该边界的内部。在肌肉和表皮之间滑动爪子，注意尽量减少与表皮的接触 为了尽量减少对表皮的损伤，用尽可能平的爪子解剖，并尝试在含钙盐水中解剖。这可能有助于在肌肉和表皮之间创造空间。

接下来，向上拉镊子，在一个锚点处打破肌肉与体壁的附着。对剩余的感兴趣肌肉段重复此过程。重新调整昆虫针，以最大限度地向各个方向拉伸幼虫片。

要固定菲力片，首先去除盐水溶液，然后在 PBS 中加入新鲜制备的 4% 甲醛冷水，以覆盖盘子底部。在室温下孵育 25 分钟。用 PBS 冲洗菲力片五次以去除多余的甲醛。

接下来，使用镊子小心地从剩余的锚点拉出肌肉组织。同样，尽量减少与表皮的接触。最后，解开菲力牛排并将其从解剖盘中取出。

将其放入干净的 1.5 毫升微量离心管中。应在该管中进行进一步的洗涤、封闭和免疫染色。要安装切片进行成像，请从微量离心管中取出样品，并将其内表面向下定向到一滴 PBS 中的盖玻片上。

切掉头和尾。然后用实验室擦拭布吸收 PBS 以去除 PBS。添加 1 滴 Antifade Mountant。

将显微镜载玻片放在盖玻片上，然后用实验室抹布轻轻按压以分散封固剂。将侧面翻转过来，在每个边缘涂抹透明指甲油以密封盖玻片。这些共聚焦图像显示了免疫荧光实验，以可视化隔膜连接蛋白、Coracle 或 Cora 和 da 神经元。

在这里，肌肉切除和肌肉完整组织的图像是在相同的激光功率条件下拍摄的。在肌肉完整的组织中，激光功率增加以补偿肌肉干扰，并产生可比的图像。在从肌肉切除的鱼片获得的图像中，可以沿着 4 类神经元树突的间歇性轨迹在表皮细胞边界处清楚地检测到 cora。

并勾勒出神经元，soma。相比之下，在样本的肌肉中几乎无法检测到这些结构域的 cora 定位。在这里，cora 主要在肌肉、气管和神经肌肉接头中可见，来自这些组织的荧光掩盖了大多数表皮cora。

还使用 3D 结构照明显微镜对样品进行成像，以确定肌肉去除是否能在更高分辨率下改善可视化。同样，肌肉完整的样品需要以更高的功率和曝光时间进行可视化，以补偿肌肉干扰。肌肉分离样品的图像分辨率看起来更清晰，观察到的伪影更少，并且树突轨迹的 cora 染色更容易分辨。

突膜也可以在肌肉关闭条件下在 114 纳米处测量。而它们在鱼片上的肌肉似乎有 272 纳米宽。在执行此程序时，重要的是要限制固定前解剖的幼虫数量，以便经过的时间不超过 25 分钟。

看完这个视频，你应该对如何从果蝇幼虫中去除肌肉组织有一个很好的了解。该协议将有助于幼虫感觉神经元及其创新的表皮细胞的免疫荧光分析。感谢您的观看，祝您的实验好运。