Injeção de Morpholino: Um método para derrubar a expressão genética direcionada para estudar a função em zebrafish

- Uma abordagem para determinar a função de um gene é derrubar sua expressão e observar o efeito. Os oligômeros de Morfolino são frequentemente usados em estudos de derrubada em zebrafish. Um morpholino é uma molécula sintética semelhante ao DNA em torno de 25 bases de comprimento, o que inibe a expressão genética alvo.

Para o tratamento de morfolino, coloque um peixe anestesiado com uma barbatana traseira parcialmente amputada em uma placa de injeção e posicione a placa sob um microscópio estéreo. Injete apenas o lado dorsal enquanto o lado ventral não injetado atua como controle. Morfos podem funcionar de duas maneiras dependendo da sequência que eles visam.

Em segundo lugar, ele pode ligar-se à junção intron-exon em um pré-mRNA e evitar o adequado splicing, resultando em uma transcrição defeituosa que será degradada pela célula. Mais tarde, examine as aletas caudais para o crescimento. Diferenças entre o crescimento das regiões tratadas com morfolino e não tratadas indicam que a proteína alvo desempenha um papel na regeneração de barbatanas. Neste protocolo, usaremos morfinas como parte de um ensaio de regeneração caudal.

- Um dia antes da injeção de morfolino, fazer uma placa de injeção com 2% de agarose que tem um entalhe cortado em uma extremidade do poço, o que ajudará a estabilizar o peixe para o procedimento de injeção. Pouco antes de injetar, diluir o morpholino marcado por fluorosceína em RNAase e DNAase água livre para a concentração adequada e incuba-lo em um banho de água Celsius de 65 graus por cinco minutos.

Em seguida, anestesiar o peixe e colocá-lo na placa de injeção. Remova todo o excesso de líquido e coloque a placa no palco de um microscópio estéreo. Oriente a agulha apenas distal ao raio ósseo.

Insira a agulha suavemente no tecido regenerativo apenas distal a cada raio ósseo e empurre distally até localizar no blastema. Quando a agulha estiver corretamente localizada, siga as instruções do sistema de microinjeção e injete uma gota de cinco nanoliteres do morfolino por injeção. Com cada injeção, pode-se ver um sopro amarelo de solução de morfetalino, que ajuda a localizar a injeção para o blastema. Trabalhando dorsalmente a partir da linha média, injete aproximadamente 75 nanolitros de morfolino por raio ósseo no lado dorsal, deixando o lado ventral como um controle apenas de eletroporção.