一个反向遗传学方法测试胚胎发育过程中的功能冗余

该程序的总体目标是确定两个基因是否在功能上是冗余的，以规范定义的细胞谱系。这是通过首先使用注射到发育中的斑马鱼胚胎中的基因特异性形态来定义每个单独基因的功能丧失表型来实现的。该程序的第二步是开发一种用于定量细胞谱系规格或分化的测定法。

例如，使用报告鱼品系，我们将在此处展示。该程序的第三步是结合两个变型 FENOs 以同时靶向两个基因的功能丧失。该程序的最后一步是评估由双重敲低引起的表型。

最终，通过检查谱系报告基因或分析谱系特异性标记物的表达，可以获得显示特定谱系细胞功能丧失或获得的结果。与现有方法（如在小鼠模型中结合敲除）相比，该技术的主要优点是，只需在单个实验中结合经过验证的形态，就可以在鱼类模型中靶向两个甚至三个基因。可以注射 100 多个胚胎，并在几天内评估表型。

此方法可以帮助回答关键问题。在发育生物学中，例如定义控制细胞命运的转录途径，关键调控途径通常由功能冗余的相关基因的小家族表示。因此，由于 Sister Gene 的补偿，它们的作用在小鼠敲除研究中并不明显。

虽然这个模型可以提供对斑马鱼胚胎发生的见解，但结果可以应用于其他系统，例如小鼠，因为相同的遗传程序通常在整个进化过程中都保存得很好。注射胚胎前准备显微注射板。将大约 12 毫升 2% 的 agros 倒入系统水中，这是直接从鱼缸系统中取出的干净水，放入 100 毫米培养皿的倒盖中。

将两张显微镜载玻片以大约 45 度角放入盖子的两侧。当 agros 凝固后，轻轻地将载玻片从盖子上拉开，在注射过程中形成胚胎休息的槽，没有茎在室温下以 1 毫摩尔的浓度保持无菌蒸馏去离子水注射前。将 morphos 原液在 65 摄氏度下孵育 5 分钟，以确保它们完全溶解。

让原液冷却至室温。每个新设计的形态都必须经过活性和胚胎耐受性的实证验证。在微量离心管中，首先在蒸馏去离子水中对储备吗啡进行一到两次连续稀释，产生 1 毫摩尔、0.5 毫摩尔、0.25 毫摩尔和 0.125 毫摩尔的工作浓度。

在解剖镜下，使用吸力将校准的注射针前部加载，该注射针已连接到微型纵器并正确定位。在针头上加入大约 1 微升最低浓度的 morpho 溶液。使用移液管将受精的单细胞胚胎移动到显微注射板的槽中。

使用移液管从板中去除多余的水，使胚胎落到槽的底部。将注射板置于显微镜下，将针头向下穿过 corion 并进入蛋黄。在取出针头并重新定位注射板以进入下一个胚胎之前，先注射每个胚胎。

学习注射时，使用活性染料将注射到细胞中可视化可能会有所帮助，如图所示，将胚胎转移回 100 毫米培养皿中，并在 28.5 摄氏度下进行系统水培养。从针头中排出任何剩余的 morpho 溶液，并用次高浓度的 morpho 填充它，以便在适当的发育阶段注射下一批胚胎。检查胚胎在每个注射的形态浓度下的表型。

每种形态的阈值剂量是存在确定的可靠表型的最低剂量。可能需要多轮滴定来定义不准确的阈值。寻找两个不同基因之间的遗传相互作用。

准备两种感兴趣的吗啡的混合物，每种吗啡都以其各自的阈值浓度。重要的是要记住，胚胎每次注射不能耐受超过 20 纳克的总形态。以与以前相同的方式注射胚胎。

保持实验组和对照组之间的注射量恒定，其中应包括在解剖显微镜下单独注射每种形态的组。注射后立即监测注射的胚胎，并在一天中多次监测，使用移液管去除任何死亡或垂死的胚胎。由于这些会损害剩余吗啡的活力，因此移液管可以随时移动、镇静或安乐死胚胎。

指向凹陷滑梯进行观察。用于摄影。如有必要，使用锋利的镊子去除冠状动脉。

在一滴 3% 甲基纤维素中稳定胚胎，筛选胚胎以获得独特的表型，这是吗啡组合所独有的，而不是单个吗啡表型的更大外显率。以下是在阈值处注射吗啡时的几种野生型胚胎。对于 gata five，典型的表型是心脏裂或两个心脏，因为祖细胞未能在中线融合。

注意箭头指示的 GFP 阳性心肌细胞。六种吗啡的表型包括无法正确循环的畸形心脏。这些胚胎还发育出 GFP 阳性心肌细胞。

然而，注射了 gata five 和 gata six 组合的胚胎，如图所示。表现出心肌细胞发育完全丧失，表明心肌细胞必须表达 gata 5 或 gata 6 才能发育。这两个基因对于心肌细胞规格在功能上是冗余的。

在尝试此程序时，重要的是首先完全验证您的morphos，并尽可能确定它们代表了单基因靶标的真正敲低。遵循此程序。可以执行其他方法，例如组合条件小鼠无效等位基因，以表明相同的基因起作用。哺乳动物也是如此。

看完视频后，您应该对如何确定胚胎发生过程中两个基因是否在功能上是冗余的有一个很好的理解。