Name: 一个反向遗传学方法测试胚胎发育过程中的功能冗余 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 了解斑马鱼胚胎中基因功能冗余的反向遗传学方法。通过吗啉代寡核苷酸注射和报告鱼品系，研究人员可定量分析细胞谱系分化并揭示基因补偿机制。

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感谢 Evans 实验室成员在准备本演示文稿过程中的帮助。本研究中使用的吗啉寡核苷酸最初由 Audrey Holtzinger 博士验证。T.E. 的研究得到了美国国立卫生研究院（HL064282 和 HL056182）基金的资助。动物实验均依照威尔康奈尔医学院动物护理与使用委员会制定的指南和规定进行。

我们的目标是检验两种转录因子在心肌细胞前体特化过程中的功能冗余性。这两种因子由两个相关基因gata5和gata6编码，我们利用斑马鱼模型来研究它们的相对功能1。我们的策略是使用吗啉代寡核苷酸（morpholinos）来阻断基因功能2。我们将把针对其中一个或另一个基因的吗啉代注射到受精卵中，并将所得胚胎表型与同时注射两种吗啉代的受精卵发育而来的胚胎进行比较。为了简化表型评估，我们使用来源于携带心肌细胞特异性表达GFP转基因鱼的受精卵。
步骤 1. 准备显微注射。
A) 建立鱼类繁殖配对
注射前一晚，将单条雄性与单条雌性成年鱼（3至18月龄）按配对方式放入繁殖缸中，并用隔板分隔，直至次日早晨。我们通常设置10至20对鱼，无论卵子是否会被使用，均每周交配一次，以维持其繁殖能力。本实验采用一种报告基因品系，该品系转基因表达cmlc2:egfp，因其可提供简便的信号输出，用于识别正在分化的心肌细胞。次日早晨开灯后，更换水体，并移除隔板，使鱼对交配并产卵。可对产卵过程进行监测，产卵可能立即开始，也可能在1小时或更长时间后开始，具体取决于鱼的状态。通常，在持续交配约20分钟后，使用移液管或滤网收集卵子，并倒入含有系统水的100 mm培养皿中。监测产卵时间至关重要，以确保胚胎在1至4细胞期之间接受注射。通过分批释放多对鱼，可实现产卵时间的错开，从而最大化可在早期发育阶段进行注射的卵子数量。一对状态良好的鱼可产生超过200个胚胎，而同时收集数千枚卵子并无实际意义，因为单个研究人员无法在卵子发育超过4细胞期前完成全部注射。鱼类的繁殖受光周期刺激，因此本实验需尽早开始，通常中午之后难以获得卵子。
B) 准备针头
<ol>
 <li> 使用显微拉针仪和一根3.5英寸玻璃毛细管，在以下参数条件下制备两根针头：加热值=626，拉力=60，速度=60，时间=250。我们使用无内丝的开放式芯针头，因为我们将通过负压从前端填充液体。</li>
 <li> 然后使用洁净的剃须刀片或镊子轻轻敲断每根针头的尖端，并使用EG-4型微型研磨仪以约30度角进行约20秒的斜面打磨。此步骤可使针尖更锋利，对于穿透卵壳进行注射尤为重要。</li>
 <li> 获得直径一致、约为15微米的针尖至关重要（使用带网格的显微镜目镜校准为4个单位，以便准确校准1–2 nl的注射体积）。</li>
 <li> 针头应提前制备，并安全存放于稳妥位置；每次注射开始前需对每根针头单独校准，以确保注射体积的一致性（详见D节）。如果条件理想，单根针头可能可完成整个实验。然而，针头在实验过程中可能容易断裂，因此不应在实验中途花费时间重新拉制新针头。</li>
</ol>
C) 制备注射平板
<ol>
 <li> 在微波炉中加热煮沸，用系统水配制100 ml的2%琼脂糖溶液。</li>
 <li> 冷却至不烫手，将约12 ml倒入直径100 mm培养皿的倒置皿盖中。</li>
 <li> 将两张载玻片以大约45度角倾斜插入皿盖两侧。待琼脂糖凝固后，轻轻将两张载玻片从皿盖上取下。</li>
 <li> 这样可形成用于放置并随后注射胚胎的凹槽。可预先制备多个培养皿。加入一层70%乙醇，放回原培养皿底部，并用封口膜密封后，可在4°C长期保存。使用前请务必充分清洗。</li>
</ol>
D) 显微注射工作站和针头校准
<ol>
 <li> 打开压缩氮气源和PLI-100显微注射仪。应将注射仪调节至18 PSI的恒定流体压力。</li>
 <li> 在插入针头前，确保显微操作器处于合适位置，以允许大范围移动，并确保插入的针头不会触碰到台面。将先前制备好的针头之一（见C部分）插入显微操作器中，确保密封紧密。注意不要折断针头。</li>
 <li> 在进行校准之前，通过显微镜观察针尖，确保其未被堵塞。</li>
 <li> 将一滴（2–3 μl）注射溶液或ddH2O滴加到一小片Parafilm上，使用填充按钮将约1.5 μl液体吸入针头中。确保针尖完全浸入溶液中，并通过显微镜观察液体吸入过程，避免吸入气泡。</li>
 <li> 将一滴矿物油滴加到微米级刻度网格上。</li>
 <li> 通过经验调整注射时间，确保液滴直径约为1.5微米，这将提供约1.8 nl的注射体积。实际注射体积可根据需要调整，但实际操作中难以准确校准低于1 nl的体积，且胚胎可能无法耐受超过2 nl的注射量。无论选择何种体积，所有注射（包括对照组）均应保持一致，并通过调整溶液浓度（而非注射体积）来滴定注射的吗啉代寡核苷酸量。</li>
 <li> 每次更换针头后均需重新校准，因为不同针头的尖端尺寸可能存在差异。</li>
</ol>
步骤 2. 靶向两个不同基因的吗啉代寡核苷酸的验证
吗啉代寡核苷酸的设计目的是靶向目标 mRNA 的翻译起始位点或剪接位点，从而阻断蛋白质的合成或正常的 mRNA 加工过程。在首次分析某个基因时，我们会同时使用两种类型的吗啉代寡核苷酸，以检测它们是否产生相同的表型，从而表明实现了特异性基因敲低。剪接阻断型吗啉代的优势在于，可以通过 RT-PCR 验证正常转录本的敲低效果，这在缺乏针对目标基因的特异性抗体时尤为有用。我们将以 gata5 和 gata6 基因为例，说明如何利用吗啉代寡核苷酸获得一致的心脏表型（gata5 5'非翻译区 MO 序列：5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3'；gata5 剪接位点 MO 序列：5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'；gata6 5'非翻译区 MO 序列：5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3'）。
<ol>
 <li> Morpholino 来自 Gene Tools, LLC（Philomath, OR）。如果您咨询其技术支持人员，Gene Tools 可帮助您选择最佳的靶向序列。您只需提供登录号，他们将给出建议。然而，不能保证 Morpholino 一定有效，因此您需要做好验证其活性的准备。您也可以检查 OpenBiosystems 是否提供该 Morpholino。Gene Tools 向 OpenBiosystems 提供合成的 Morpholino 库存。尽管同样无法保证其有效性，但它们以更小的包装量和更低的价格出售，有助于降低测试新靶点的成本。务必对您的 Morpholino 进行转录组 BLAST 分析；我们使用 UCSC 斑马鱼基因组浏览器（genome.ucsc.edu）上的 BLAT 功能。当然，如果某 Morpholino 已在文献中被严格验证过，建议您购买相同的序列。</li>
 <li> 将 Morpholino 溶解于无菌 ddH2O 中，配制成终浓度为 1 mM 的溶液，并在室温下保存。切勿冷冻 Morpholino 溶液，因为低温有时会导致其聚集并沉淀。Morpholino 对蛋白酶或核酸酶不敏感，因此只要所加水为无菌水，其在室温下应相当稳定。</li>
 <li> 注射前，将 Morpholino 在 65°C 下孵育 5 分钟，以确保完全溶解，然后冷却至室温。切勿将样品置于冰上。在注射前始终保持 Morpholino 在室温下。</li>
 <li> 为滴定 Morpholino，我们通常用 ddH2O 对原液进行系列稀释，得到 1 mM、0.5 mM、0.25 mM 和 0.125 mM 的工作浓度。根据序列不同，在注射体积为 1.8 nl 时，这大约相当于每次注射 20 ng、10 ng、5 ng 和 2.5 ng 的 Morpholino。这仅是一个起始点，因为每个 Morpholino 的耐受性和有效性各不相同，无法预测。大多数 Morpholino 在超过 20 ng 时难以耐受，但有些在远低于 1 ng 的剂量下即有效。我们的方法是确定表型“达到平台期”的浓度。换句话说，如果使用 2.5 ng 时未观察到特定表型，而在 5 ng 及以上剂量时表型相似，则选择 5 ng 作为阈值剂量。当然，接下来在 2.5 ng 和 5.0 ng 之间进一步滴定可能更有意义，以确保您是在阈值以上稳定地工作，而不是刚好处于“临界边缘”。</li>
 <li> 用最低工作浓度（最稀释）的 Morpholino 溶液填充已连接并校准的注射针。避免过度填充针尖，以免浪费试剂。若仅填充 1 μl，则足以进行 500 次注射。</li>
 <li> 使用一次性移液器将受精的单细胞胚胎转移至显微注射板的槽中。去除多余水分，确保胚胎沉降至注射槽底部。胚胎不应漂浮，而应贴附于琼脂糖基质上。</li>
 <li> 调整注射板位置，使显微操作器能够将注射针尖穿过卵膜并进入卵黄进行注射。为调整单个胚胎的位置，可通过移动注射板，使注射针尖推动或拉动胚胎至合适位置。注意不要折断针尖或损伤胚胎！这需要一定练习，但一般原则是：仅使用显微操作器将注射针平稳插入胚胎，注射后迅速而干净地退出。通过用空闲的手（若右手注射则用左手）移动注射板来将胚胎调整至注射位置。对于初学者，使用含 0.25% 酚红的溶液进行练习有助于观察注射液的分布。此外，注射含有荧光标记微球的溶液（Molecular Probes；F-8794）也可增强信心，以确认溶液确实注入胚胎内而非卵膜间隙。然而，经过几轮练习后，这些辅助手段通常不再需要。偶尔向空气中注射一次也是个好习惯，可确认针头未堵塞且注射体积适当。</li>
 <li> 注射后的胚胎转移回含系统水的 100 mm 培养皿中，在 28.5°C 下培养。完成最低工作浓度的注射后，可排出剩余溶液，并用下一个较高浓度的 Morpholino 溶液重新填充注射针。依次对每个浓度重复操作。尽管可在更换不同 Morpholino 时用水冲洗针头，但我们更倾向于更换新针并重新校准。务必保留一批未注射的胚胎，以确认该批次胚胎本身是否健康且发育正常。</li>
</ol>
步骤3. 在单个阈值剂量下共注射吗啉代寡核苷酸
上述滴定实验的目的是确定每种吗啉代寡核苷酸（morpholino）的阈值剂量。在理想情况下，如果靶基因具有重要功能，则几乎所有吗啉代胚胎（morphants）都会表现出明确的表型。然而，由于显微注射过程中可能出现技术误差，实验中会存在一定变异。随着操作熟练度的提高，此类误差应不超过10%。某些批次的胚胎（包括未注射的对照组）可能存活率较差，此时整个实验结果应予以舍弃。此外，还存在生物学上的个体差异，因为不同胚胎对基因敲降的耐受程度可能有所不同。最后，某些吗啉代寡核苷酸本身可能效率不足，无法实现充分（完全外显）的基因敲降。如果仅在少数胚胎中出现表型，但该表型可重复出现，则值得尝试使用另一种不同的吗啉代寡核苷酸进行验证。本后续实验的目标是确定当同时靶向两个基因时，是否会出现一种全新的表型。我们关注的并非仅仅是表现出吗啉代表型的胚胎比例增加，而是要观察是否产生一种在单独敲降任一基因时、于阈值剂量下从未出现或极为罕见的、独特的新型表型。
<ol>
 <li> 以先前测试过的每种吗啉代寡核苷酸（morpholino）产生明确表型的最低有效浓度为基础，配制其组合混合物。例如，若每个基因的最低有效剂量为 5 ng，则配制含有每种 5 ng（共 10 ng）的工作溶液。由于胚胎通常无法耐受超过 20 ng 的总吗啉代寡核苷酸，因此根据前期实验结果，应使用足以有效靶向各基因的最小剂量。</li>
 <li> 对照组应包括分别单独注射每种吗啉代寡核苷酸的胚胎，其浓度与联合注射组所用浓度相同。注射溶液体积应保持恒定（例如 1.8 nl）。使用报告基因品系的一大优势在于可随时且可重复地评估表型（例如心肌细胞分化）。若需通过基因表达分析来评估胚胎， 原位 杂交后，可在注射后的不同时间点固定同期发育的胚胎和对照样本。在本实验中，我们将在受精后约24小时评估GFP表达，以间接反映心肌细胞的分化情况。</li>
</ol>
步骤4. 表型评估
<ol>
 <li> 注射后的胚胎应在注射后立即进行监测，并在当天多次观察，及时移除任何死亡或濒死的胚胎，因为这些胚胎可能影响其余形态发生异常胚胎的存活率。为评估报告基因的表达情况，需使用配备荧光功能的体视显微镜观察胚胎。我们使用尼康SMZ1500显微镜，配备1X或1.6X物镜，放大倍数范围为0.75x至11.25x。使用荧光滤光片时，务必将光圈完全打开，以最大化光照强度。同时，应根据报告基因（如GFP、RFP等）选择正确的滤光片。</li>
 <li> 通常使用系统水将4mg/ml的三卡因甲磺酸盐储备液稀释20倍来对胚胎进行镇静处理。储备液应于-20°C冷冻保存。 alternatively，可使用20倍浓度的三卡因储备液对胚胎实施安乐死。通常即使胚胎仍处于卵膜内，也可进行筛选。然而，特别是在需要拍照时，建议使用尖头镊子去除卵膜。可将胚胎置于含三卡因溶液的凹玻片中进行观察，或将其放入一小滴3%甲基纤维素中以更好地固定，便于摄影。</li>
 <li> 观察共注射多种吗啉代寡核苷酸组合的胚胎表型，并与单一吗啉代处理的胚胎进行比较。在此实验中，我们关注原始心脏管中GFP表达的模式。在该报告基因品系中，GFP通过cmlc2启动子特异性地在心肌细胞中表达，从而可对心脏细胞命运决定及心脏管形态发生进行详细分析。</li>
</ol>
代表性结果
在我们的实验中，当注射剂量达到阈值水平时，gata5 和 gata6 单一吗啉代寡核苷酸（morphant）均表现出可重复的心脏表型，尽管存在较大的生物学变异3,4。例如，大多数 gata5 吗啉代寡核苷酸胚胎会形成双叶心脏，GFP 表达出现在两个区域。这是因为在心脏管形成过程中，心脏前体细胞未能正常迁移并在中线处融合所致。然而，部分 gata5 吗啉代寡核苷酸胚胎仍会形成有缺陷的心脏管，且在少数个体（5%）中，GFP阳性细胞的数量显著减少。我们认为这反映了生物学变异性，但也可能是因为吗啉代寡核苷酸并不等同于“无效”突变。
同样，gata6 形态发生抑制胚胎均表现出心脏表型，但表型存在一定的范围，包括少量分叉的心脏，以及与未注射的对照胚胎相比形态发生紊乱的心脏。这种变异性在心脏形态发生表型中并不罕见，因为心脏形成是一个动态过程，至少部分心脏表型可能间接源于胚胎形态发生缺陷。然而，重要的是，gata5 和 gata6 形态发生抑制胚胎的心脏形态发生缺陷表型范围具有一致性和可重复性，且大多数胚胎能够生成大量 GFP+ 心肌细胞。
与 gata5 和 gata6 单一形态发生素缺失胚胎形成鲜明对比的是，同时缺失这两个因子的胚胎表现出GFP表达完全丧失，这与心肌细胞的缺失一致。因此，gata5 和 gata6 在心脏形态发生过程中各自具有不可替代的功能，但在分化心肌细胞的生成需求方面，这两个基因在功能上是冗余的。我们先前的研究还显示最早期心肌细胞标志物（包括 nkx2.5）的表达缺失，提示其在心肌细胞特化过程中具有必要作用3。

<ol><li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li>
<li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li>
<li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在本实验中，我们联合使用了两种吗啉代寡核苷酸（morpholino），每种单独注射时均可产生不同的表型，而当二者共同注射时，却出现了完全不同的表型。当然，我们首先需要有合理的依据来开展这一实验。我们推测，这两个基因可能在早期功能（在此为心脏特化过程）中具有相互补偿作用。这是因为这两个基因具有高度同源性（能够结合相同的DNA序列），并且在胚胎发育过程中表达模式存在重叠5。此外，果蝇（Drosophila）中的遗传学实验表明，GATA转录因子应参与心脏特化过程6。
然而，该策略还可用于其他情况，例如测试功能冗余性或更广泛的遗传相互作用。首先，对一个或两个基因进行敲低可能不会产生任何明显表型。在这种情况下，每个基因没有明确的阈值水平，所使用的吗啉代寡核苷酸（morpholino）用量需通过实验经验确定，并受限于胚胎对其耐受程度。同样，测试补偿效应的依据通常在于这些基因具有高度同源性，并且已被证实存在共表达模式。其次，可通过使用低于阈值剂量的吗啉代寡核苷酸来检测任意基因对之间的遗传相互作用。在此策略中，每种吗啉代寡核苷酸的使用...

<table><tbody><tr><td>鱼类繁育水箱和隔离板</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>捞鱼网</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>系统用水</td><td></td><td></td><td>每升去离子水中加入60mg Instant Ocean&amp;#8221;</td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>BD Biosciences</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>微量移液针拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97 Flaming/Brown</td><td></td></tr><tr><td>3.5&quot; 玻璃毛细管</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Personna Medical Care</td><td>94-120-71</td><td></td></tr><tr><td>微型研磨器</td><td>Narishige International</td><td>EG-4</td><td></td></tr><tr><td>带网格的显微镜目镜</td><td>Premiere</td><td>MF-02</td><td></td></tr><tr><td>千分尺</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>超纯琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>刮勺</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>一次性称量皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>2-202-B</td><td></td></tr><tr><td>普通微波炉</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>锥形瓶</td><td>Corning</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552</td><td></td></tr><tr><td>量筒</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6D</td><td></td></tr><tr><td>自动移液器控制器</td><td>BrandTech</td><td>2026333</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇清洗液</td><td>Tarr</td><td>801VWR</td><td></td></tr><tr><td>氮气罐</td><td>Tech Air</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Micro Instruments</td><td>LTD</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>American National Can</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>吸水纸（Kimwipes）</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata5&lt;/em&gt; 剪接位点吗啉代寡核苷酸</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>gata5 ATG 阻断型吗啉代寡核苷酸</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata6&lt;/em&gt; 长亚型 ATG 阻断型吗啉代寡核苷酸</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>一次性巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐（Tricaine Methanesulfonate）</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155495</td><td></td></tr><tr><td>加热金属块</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-4</td><td></td></tr><tr><td>尖头镊子</td><td>Dumont</td><td></td><td>55号</td></tr><tr><td>凹面载玻片</td><td>VWR international</td><td>48339-009</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于检测胚胎发生过程中功能冗余的反向遗传学方法

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

在胚胎发生过程中，基因功能通常通过功能缺失实验来确定，例如在小鼠中进行靶向诱变（基因敲除）。在斑马鱼模型中，已开发出有效的反向遗传学技术，即通过显微注射针对特定基因的反义吗啉环寡核苷酸（morpholino）。吗啉环寡核苷酸通过特异性碱基配对靶向mRNA，并在胚胎发育的数天内通过抑制翻译或剪接而暂时阻断基因功能（基因敲降）。然而，在小鼠或斑马鱼等脊椎动物中，由于存在可补偿功能缺失的其他基因，某些基因功能可能在这些实验中被掩盖。这种情况在含有共表达于相同发育组织中的同源基因的基因家族中尤为常见。在斑马鱼中，可通过同时注射靶向两个基因的吗啉环寡核苷酸，以相对高通量的方式检测功能补偿现象。同样，通过使用吗啉环寡核苷酸将两个基因共同敲降至亚阈值水平，可验证任意两个基因之间的遗传相互作用。例如，可对吗啉环寡核苷酸进行剂量滴定，使得单独敲降任一基因均不产生表型。若在此条件下，共注射两种吗啉环寡核苷酸引发表型，则表明存在遗传相互作用。本文中，我们以两个相关的GATA转录因子为例，演示如何揭示功能冗余现象。GATA因子对心脏前体细胞的特化至关重要，但只有当Gata5与Gata6同时缺失时，这一功能才得以显现。我们展示了如何开展显微注射实验、验证吗啉环寡核苷酸的有效性，并评估心脏发育中的补偿性表型。

关键词：基因功能，胚胎发生，吗啉环寡核苷酸，基因敲降，功能冗余，遗传相互作用，GATA转录因子，心脏发育，斑马鱼，显微注射

如果存在其他基因的补偿作用，基因功能在功能缺失实验中可能会被掩盖。斑马鱼模型能够在活体胚胎中相对高效地揭示此类功能冗余。

胚胎发育过程中基因功能的定义通常通过功能缺失实验实现，例如在小鼠中进行的靶向诱变（基因敲除）。在……

本实验的总体目标是确定两个基因在特定细胞谱系特化过程中是否具有功能冗余性。首先，通过将基因特异性的吗啉代寡核苷酸注入发育中的斑马鱼胚胎，分别明确每个基因的缺失功能表型，以此实现上述目的。实验的第二步是建立一种定量分析细胞谱系特化或分化的检测方法。例如，使用报告基因鱼品系，正如我们在此展示的。该实验步骤的第三步是联合两种形态的 FENO，以同时靶向两个基因的功能缺失。实验步骤的最后一步是评估双基因敲降所引起的表型变化。最终，通过检测谱系报告基因或分析谱系特异性标记物的表达，可以获得特定谱系细胞功能丧失或获得的结果。该技术相较于现有方法（如小鼠模型中的基因敲除组合）的主要优势在于，仅需在一个实验中联合使用经过验证的吗啉代寡核苷酸，即可在鱼类模型中同时靶向两个甚至三个基因。可在数天内完成对100多个胚胎的显微注射并评估其表型。该方法有助于回答发育生物学中的关键问题，例如定义控制细胞命运的转录通路。关键调控通路通常由功能冗余的相关基因小家族代表，因此在小鼠基因敲除研究中，由于旁系同源基因的补偿作用，其功能并不明显。尽管该模型有助于研究斑马鱼胚胎发育，但由于相同的遗传程序在进化过程中通常高度保守，其结果也可应用于小鼠等其他系统。在注射胚胎前，需预先制备显微注射用培养皿。将约12毫升的2%琼脂糖溶于系统水中（即直接取自养鱼系统的洁净水），倒入直径100毫米培养皿的倒置皿盖中。将两张载玻片以大约45度角插入盖子的两侧。当琼脂凝固后，轻轻将载玻片从盖子上取下，形成用于放置胚胎进行显微注射的凹槽。注射前，将吗啉代（morpholino）储存液以1毫摩尔浓度溶于无菌去离子蒸馏水中，并在室温下保存。在使用前，将吗啉代储存液于65摄氏度孵育5分钟，以确保其完全溶解。让储备液冷却至室温。每种新设计的吗啉代寡核苷酸（morpholino）都必须通过实验验证其活性及对胚胎的耐受性。在微量离心管中，用去离子蒸馏水对储备液进行一到两倍的系列稀释，得到的工作浓度分别为1 mmol/L、0.5 mmol/L、0.25 mmol/L和0.125 mmol/L。在解剖显微镜下，使用吸力将已连接至显微操作仪并准确定位的校准注射针进行前端上样。用约一微升最低浓度的吗啉代溶液上样至注射针中。使用移液器将受精的单细胞胚胎转移至显微注射板的槽中。使用移液器去除培养皿中多余的水分，使胚胎沉入槽底。将注射板置于显微镜下，将针头穿过绒毛膜插入卵黄中。在取出针头并重新定位注射板以接触下一个胚胎之前，完成对每个胚胎的注射。在学习注射技术时，使用活性染料有助于观察染料注入细胞的过程（如图所示），然后将胚胎转移回含有系统培养水的100毫米培养皿中，在28.5°C条件下进行培养。将针头中残留的吗啉代溶液排出，并用下一个较高浓度的吗啉代溶液填充针头，用于在适当发育阶段对下一批胚胎进行注射。在每个注射的吗啉代浓度下，观察胚胎的表

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一个反向遗传学方法测试胚胎发育过程中的功能冗余

一种可适应的斑马鱼反向遗传学方法，通过心室注射基因特异性吗啉代寡核苷酸，用于评估基因在发育后期及生理性稳态（如组织再生）过程中的功能。...

利用心脏心室注射反向遗传学吗啉代寡核苷酸方法转染斑马鱼幼鱼中多个难以靶向的组织

我们描述了一种利用Xenopus卵母细胞和动物帽系统进行基因表达克隆的方法，可用于筛选能够诱导有反应能力的外胚层产生应答的基因，并讨论了对这些基因进行后续分析的技术。该系统在多种基因产物的功能鉴定中具有重要应用价值。...

使用 Xenopus 卵母细胞表达系统进行功能克隆

本实验方案旨在描述一种功能缺失和功能获得的方法，可用于鉴定新生素（neogenin）作为植入前小鼠胚胎中滋养外胚层和内细胞团分化的阶段特异性受体。...

利用功能缺失与功能获得方法研究小鼠着床前胚胎早期细胞命运决定因子

本视频文章详细介绍了一种简单直接的体内方法，可用于系统且高效地表征多种无脊椎动物胚胎中复杂信号通路和调控网络的组分。...

简约的力量：海胆胚胎作为 体内 用于研究复杂细胞间信号网络相互作用的发育模型

我们介绍一种在裂殖酵母中进行的简单抑制子筛选方案。该方法高效且无需诱变，  选择性  用于  突变  经常  发生于   a  单个  基因组的  位点...

一种利用深度测序辅助的裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe自发抑制子筛选方法

我们开发了一种新的功能缺失研究方法，该方法通过利用人工微小RNA序列的导入及其在鸡胚基因组中的整合来实现 在卵内...

利用 Tol2 转座子介导的 人工 microRNA 转基因表达在鸡胚视网膜中进行功能缺失研究

明暗交替实验是测量小鼠焦虑样行为最常用的实验方法之一。本文展示了一段视频，详细介绍了我们进行该实验的具体操作步骤。...

小鼠明暗转换实验

体外培养早期鸡胚的方法（新培养法）

本视频展示了双色整体原位杂交技术，该方法可用于在年轻的鸡胚中可视化两种不同基因的空间和时间表达模式。该方法最初由 David Wilkinson、Domingos Henrique、Phil Ingham 和 David Ish-Horowicz...

早期鸡胚双重整体原位杂交

神经诱导是大脑形成的第一个步骤。该过程是一种由亨森结（组织中心）指导邻近组织获得神经命运的机制，即发育形成神经系统。本视频演示了在鸡胚中进行神经诱导实验的方法。...

鸡胚神经诱导检测方法

了解斑马鱼胚胎中基因功能冗余的反向遗传学方法。通过吗啉代寡核苷酸注射和报告鱼品系，研究人员可定量分析细胞谱系分化并揭示基因补偿机制。

一种用于检测胚胎发生过程中功能冗余的反向遗传学方法

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